माउस हार्ट फील्ड-विशिष्ट कार्डिएक संतति कोशिकाओं की विट्रो जनरेशन में

Developmental Biology

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Summary

इस विधि का उद्देश्य संतान कोशिका विनिर्देश और कार्यात्मक गुणों का अध्ययन करने के लिए, और हृदय रोग मॉडलिंग के लिए कक्ष विशिष्ट हृदय कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए इन विट्रो में हृदय क्षेत्र-विशिष्ट हृदय जनक कोशिकाओं को उत्पन्न करना है।

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Tampakakis, E., Miyamoto, M., Kwon, C. In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (149), e59826, doi:10.3791/59826 (2019).

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Abstract

Pluripotent स्टेम सेल दिल के विकास और रोग को समझने के लिए और पुनर्योजी दवा के लिए महान क्षमता प्रदान करते हैं. जबकि विकास कार्डियोलॉजी में हाल ही में प्रगति pluripotent स्टेम कोशिकाओं से हृदय कोशिकाओं को पैदा करने के लिए नेतृत्व किया है, यह स्पष्ट नहीं है अगर दो हृदय क्षेत्रों - पहले और दूसरे हृदय क्षेत्रों (FHF और SHF) - pluripotent स्टेम सेल सिस्टम में प्रेरित कर रहे हैं. इस पर ध्यान देने के लिए, हमने इन विट्रो विनिर्देश और हृदय क्षेत्र-विशिष्ट हृदय जनक कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल उत्पन्न किया। हम भ्रूण स्टेम कोशिकाओं Hcn4-GFP और Tbx1-Cre ले जाने लाइनों का इस्तेमाल किया; रोजा-आरएफपी एफएचएफ और एसएचएफ के पत्रकारों, क्रमशः, और कोशिका झिल्ली प्रोटीन Cxcr4, एक SHF मार्कर के लाइव सेल इम्यूनोस्टेनिंग। इस दृष्टिकोण के साथ, हम जनक कोशिकाओं जो कार्यात्मक गुण और उनके vivo समकक्षों में की transcriptome recapitulate उत्पन्न. हमारे प्रोटोकॉल जल्दी विनिर्देश और दो हृदय क्षेत्रों के अलगाव का अध्ययन करने के लिए और हृदय रोग मॉडलिंग के लिए कक्ष विशेष हृदय कोशिकाओं उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जा सकता है. चूंकि यह एक इन विट्रो organoid प्रणाली है, यह सटीक शारीरिक जानकारी प्रदान नहीं कर सकते हैं. हालांकि, इस प्रणाली gastrulation चरण भ्रूण की गरीब पहुंच पर काबू पाने और उच्च throughput स्क्रीन के लिए upscaleकिया जा सकता है.

Introduction

pluripotent स्टेम सेल (पीएससी) के उपयोग रोग मॉडलिंग और दवा उपचार1,2,3, के लिए रोगी विशेष मायोसाइट्स के साथ हृदय पुनर्जनन और व्यक्तिगत चिकित्सा के क्षेत्र में क्रांति ला दी है 4. हाल ही में, एट्रियल बनाम वेंट्रिकुलर के साथ-साथ पेसमेकर जैसे पीएससी व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स के उत्पादन के लिए इन विट्रो प्रोटोकॉल में5,6 विकसित किए गएहैं. हालांकि, हृदय विकास का अध्ययन करने और बाद में वेंट्रिकुलर चैम्बर-विशिष्ट हृदय कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए कार्डियोजेनेसिस को इन विट्रो में फिर से बनाया जा सकता है या नहीं, यह अभी भी स्पष्ट नहीं है।

प्रारंभिक भ्रूण ीय विकास के दौरान, बीएमपी 4, Wnts और Activin एक रूप आदिम लकीर7के रूप में स्रावित morphogens के प्रभाव में मध्यचर्मी कोशिकाओं . कार्डिएक मध्यचर्म कोशिकाओं Mesp1 की अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित, पूर्वकाल और बाद में स्थानांतरित करने के लिए हृदय वर्धमान और फिर आदिम हृदय ट्यूब7,8. कोशिकाओं के इस प्रवासी समूह में हृदय जनक कोशिकाओं (सीपीसी) की दो बहुत अलग जनसंख्या एंकुलेशन शामिल हैं , अर्थात् पहला और दूसरा हृदय क्षेत्र (एफएचएफ और एसएचएफ )9,10. SHF से कोशिकाओं अत्यधिक proliferative और प्रवासी हैं और मुख्य रूप से दिल ट्यूब के दीर्घीकरण और पाशन के लिए जिम्मेदार हैं. इसके अतिरिक्त, SHF कोशिकाओं कार्डियोमायोसाइट्स, फाइब्रोब्लास्ट्स, चिकनी मांसपेशियों और endothelial कोशिकाओं के लिए अंतर के रूप में वे दिल की ट्यूब में प्रवेश करने के लिए सही वेंट्रिकल, सही वेंट्रिकुलर बहिर्वाह पथ और दोनों atria के बड़े हिस्से के फार्म7,10. इसके विपरीत, एफएचएफ कोशिकाएं कम प्रोलफेटिव और प्रवासी होती हैं और मुख्य रूप से कार्डियोमायोसाइट्स में अंतर करते हैं क्योंकि वे बाएं वेंट्रिकल और एट्रिया11के एक छोटे भाग को जन्म देती हैं। इसके अलावा, SHF संतति Tbx1, FGF8, FGF10 और Six2 की अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित कर रहे हैं, जबकि FHF कोशिकाओं Hcn4 और Tbx511व्यक्त ,12,13,14,15.

पीएससी सभी तीन रोगाणु परतों में अंतर कर सकता है और बाद में शरीर4,16में किसी भी कोशिका प्रकार में अंतर कर सकता है . इसलिए, वे हृदय के विकास को समझने और जन्मजात हृदय रोग के परिणामस्वरूप विशिष्ट विकासात्मकदोषों को मॉडलिंग करने के लिए जबरदस्त क्षमता प्रदान करते हैं, जो जन्म दोष 17 का सबसे अधिक कारण है। जन्मजात हृदय रोग के एक बड़े उपसमूह कक्ष-विशिष्ट हृदय असामान्यताओं18,19शामिल हैं. हालांकि, यह अभी भी स्पष्ट नहीं है कि क्या ये असंगत हृदय क्षेत्र विकास से उत्पन्न होते हैं। इसके अलावा, जन्म के बाद कार्डियोमायोसाइट्स की गति बढ़ने में असमर्थता को देखते हुए हृदय पुनर्जनन1,7,20के लिए हृदय ऊतक बनाने के व्यापक प्रयास किए गए हैं. हृदय कक्षों के बीच शारीरिक और रूपात्मक मतभेदों को ध्यान में रखते हुए, पीएससी का उपयोग कर के कक्ष-विशिष्ट हृदय ऊतक की पीढ़ी महत्वपूर्ण महत्व की है। हालांकि विकास कार्डियोलॉजी में हाल ही में प्रगति पीएससी से हृदय कोशिकाओं की मजबूत पीढ़ी के लिए नेतृत्व किया है, यह अभी भी स्पष्ट नहीं है अगर दो हृदय क्षेत्रों पीएससी प्रणालियों में प्रेरित किया जा सकता है.

विट्रो में कार्डियोजेनेसिस को पुन: प्राप्त करने और सीपीसी के विनिर्देश और गुणों का अध्ययन करने के लिए, हमने पहले पीएससी व्युत्पन्न कार्डियक स्फीरोइड21,22,23,24के आधार पर एक प्रणाली का उपयोग किया। हाल ही में, हम उत्पन्न माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (MESCs) GFP और RFP पत्रकारों के साथ FHF जीन Hcn4 और SHF जीन Tbx1 के नियंत्रण में, क्रमशः (mESCsTbx1-Cre; रोजा-आरएफपी; HCN4-GFP) 25| इन विट्रो विभेदित एमईएससी में कार्डियक गोलोइड ्स्ड होते हैं, जिनमें जीएफपी+ और आरएफपी+ कोशिकाएं मेसोडरमल कोशिकाओं के दो अलग-अलग क्षेत्रों से प्रकट होती हैं और पूरक तरीके से पैटर्न होती हैं। परिणामस्वरूप GFP + और आरएफपी + कोशिकाओं FHF और SHF विशेषताओं का प्रदर्शन किया, क्रमशः, आरएनए अनुक्रमण और क्लोनल विश्लेषण द्वारा निर्धारित. महत्वपूर्ण बात, Isl1-RFP रिपोर्टर (mESCIsl1-RFP)ले जाने mESCs का उपयोग कर, हमने पाया कि SHF कोशिकाओं ईमानदारी से सेल सतह प्रोटीन CXCR4 द्वारा चिह्नित किया गया, और यह transgenes के बिना दिल क्षेत्र-विशिष्ट कोशिकाओं के अलगाव सक्षम कर सकते हैं. वर्तमान प्रोटोकॉल एमईएससी से दिल क्षेत्र-विशिष्ट सीपीसी की पीढ़ी और अलगाव का वर्णन करेगा, जो चैम्बर-विशिष्ट हृदय रोग के अध्ययन के लिए एक मूल्यवान उपकरण के रूप में काम कर सकता है।

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Protocol

नोट: हृदय क्षेत्र-विशिष्ट माउस हृदय जनक कोशिकाओं की विट्रो पीढ़ी में (चित्र 1)।

1. माउस ESCs का रखरखाव

  1. एसएमईएससी (एमईएससीTbx1-Cre; रोजा-आरएफपी; HCN4-GFP, एमईएससीIsl1-RFP)25 पर 0.1% (w/v) 2i मध्यम में जिलेटिन लेपित T25 फ्लास्क (870 एमएल glascow न्यूनतम आवश्यक माध्यम (GMEM), भ्रूण गोविन सीरम के 100 एमएल (FBS), ग्लूटामैक्स के 10 एमएल, सोडियम एमीमो एसिड के 10 एमएल, 10 एमएल गैर-एमिनो एसिड, 10 एमएल पाइरुटेट, बीटा-मेरकैप्टोथेनॉल के 3 डिग्री एल, एलआईएफ के 20 डिग्री एल (200 यू/एमएल), 0.3 डिग्री एम CHIR999021 और 0.1 डिग्री एम PD0325901)।
  2. जब कोशिकाएं 70-80% संगम तक पहुंच जाती हैं, तो कोशिकाओं को एक बार फॉस्फेट बफर समाधान (पीबीएस) के साथ धोएं और फिर 1 एमएल ट्रिप्सिन जोड़कर और 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करके एकल कोशिकाओं में अलग कर दें।
  3. Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में 10% FBS के 4 एमएल जोड़कर Trypsin बेअसर. स्वचालित कक्ष काउंटर का उपयोग करके कक्षों की गणना करें.
  4. सेंट्रीफ्यूज ]3 x 105 कोशिकाओं के लिए 3 मिनट पर 270 x ग्राम और कमरे के तापमान.
  5. सुपरनेटेंट को प्रेरित करें, 2i मध्यम के 5 एमएल में कोशिकाओं को फिर से तैयार करें और रखरखाव के लिए 0.1% (w/v) जिलेटिन लेपित टी 25 फ्लास्क पर रीप्लेट करें।

2. कार्डिएक संतति कोशिकाओं की पीढ़ी कार्डिएक स्फीरॉइड का उपयोग

  1. सेंट्रीफ्यूज 2.5 x 106 कोशिकाओं कदम से 1.3 के लिए 3 मिनट पर 270 x g और कमरे के तापमान.
  2. सुपरनेंट को प्रेरित करें और एसएफडी माध्यम के 25 एमएल में कोशिकाओं को पुन: स्फूर्ति देते हैं (105 कोशिकाएं/ प्रयोग के पैमाने के आधार पर, MESC संख्या तदनुसार समायोजित किया जा सकता है.
    नोट: एसएफडी माध्यम में Iscove के संशोधित Dulbecco के मध्यम (IMDM), हैम F12 के 250 एमएल, N2-पूरक के 5 एमएल, बी 27 माइनस विटामिन ए के 10 एमएल, 10% के 5 एमएल (w/v) बीएसए (पीबीएस में), 7.5 एमएल GLUTIN और 7.5 m.l. एस्कॉर्बिक एसिड जोड़ें (50 mg/mL) और 3.9 x 10-3% (v/v) मोनोथियोग्लिसरोल का उपयोग करने से पहले.
  3. एक 150 मिमी x 25 मिमी बाँझ प्लेट में सेल निलंबन प्लेट और 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट 48 ज के लिए कार्डिएक स्फरॉइड्स का गठन किया जाना चाहिए।
  4. चुनिंदा गोलोइड को अलग करने और एकल कोशिकाओं से बचने के लिए 145 x ग्राम और कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए सभी गठित कार्डियक गोहरॉइड और अपकेंद्रित्र लीजिए।
  5. अति-निश्चित और एसएफडी माध्यम के 25 एमएल में स्फीरॉइडों को तथा भेदभाव प्रेरण के लिए बीएमपी 4 के 1.5 एनजी/एमएल के साथ स्फीरॉइड्स को पुन: स्फूर्तिबद्ध करें। एक ही 150 मिमी x 25 मिमी बाँझ प्लेट में गोलाभ प्लेट प्लेट और उन्हें 40 एच के लिए 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: एमईएससी लाइन के आधार पर एक्टाइल ए (0-3 एनजी/एमएल) और बीएमपी4 (0.5-2 एनजी/एमएल) की विभिन्न सांद्रता का उपयोग भेदभाव अनुकूलन के लिए किया जा सकता है।
  6. 145 x ग्राम और कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए सभी कार्डियक गोहरॉइड और अपकेंद्रित्र लीजिए।
  7. सुपरनेंट को प्रेरित करें और एसएफडी माध्यम के 25 एमएल में गोलियों को पुन: स्फूंश करें। एक अल्ट्रा कम लगाव 75 सेमी2 फ्लास्क में resuspended EBs स्थानांतरण और 48 एच के लिए 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें इनक्यूबेट करें।

3. फ्लोरोसेंट रिपोर्टर का उपयोग कर हृदय क्षेत्र विशिष्ट कार्डिएक संतति कोशिकाओं के अलगाव

  1. 145 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज कार्डियक गोहरॉइड्स और 3min के लिए कमरे के तापमान और सुपरनेंट को प्रेरित करें। 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्रिप्सिन और इनक्यूबेट के 1 एमएल जोड़ें। कोशिकाओं को अलग करने के लिए पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
  2. Trypsin निष्क्रिय करने के लिए DMEM में 10% FBS के 4 एमएल जोड़ें और pipeting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण. गैर dissociated EBs को दूर करने के लिए, एक 70 मिमी छलनी का उपयोग कर मिश्रण फिल्टर और 270 x ग्राम और कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए छान कोशिकाओं centrifuge.
  3. फ्लोरोसेंट पत्रकारों ले जाने सीपीसी सॉर्ट करने के लिए (सीपीसी एमईएससीTbx1-Cre से व्युत्पन्न; रोजा-आरएफपी; HCN4-GFP), supernatant aspirate और एफएसएएस छँटाई समाधान के 500 $L जोड़ें (1% (v/v) FBS, 200 m HEPES और PBS में EDTA के 10 m) को फिर से निलंबित करने के लिए.
  4. छँटाई से पहले सभी सेल समूहों को हटाने के लिए, कोशिकाओं को फिर से एक 40 डिग्री सेल छलनी के साथ एक 5 एमएल polystyrene गोल-नीचे ट्यूब का उपयोग कर फ़िल्टर करें। छांटने तक कोशिकाओं को बर्फ पर रखें।
  5. Tbx1-Cre को अलग करने के लिए कोशिकाओं को सॉर्ट करें; रोजा-आरएफपी और HCN4-GFP सकारात्मक सीपीसी एक फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल सॉर्टर (FACS) का उपयोग कर। FBS के 1 एमएल में हल कोशिकाओं लीजिए. सेल का नमूना रखें और कक्षों को 4 डिग्री सेल्सियस पर सॉर्ट किया।

4. एक सेल सतह प्रोटीन मार्कर के रूप में Cxcr4 का उपयोग कर हृदय क्षेत्र विशिष्ट कार्डिएक जनक कोशिकाओं के अलगाव

  1. सतह प्रोटीन रिसेप्टर Cxcr4 की अभिव्यक्ति के आधार पर पहले बनाम दूसरे दिल क्षेत्र सीपीसी को अलग करने के लिए, MESCIsl1-RFPलाइन का उपयोग करें। चरण 3.3 से supernatant aspirate और 10% FBS के 300 $L में एक सीपीसी को पुन: असाइन 1:200 (vol/vol) PerCP-efluor 710 संयुग्मी विरोधी Cxcr4 एंटीबॉडी युक्त.
  2. 5min के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट और ठंड पीबीएस के 1-2 एमएल जोड़कर धो लें। 270 x ग्राम और कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए एकल सीपीसी को सेंट्रीफ्यूज करें और दो बार अपकेंद्रण के बाद धोएं।
  3. सुपरनेंट को प्रेरित करें और एकल सीपीसी को पुन: निलंबित करने के लिए एफएसीएस छँटाई समाधान के 500 $L जोड़ें और चरण 3.4 के रूप में फ़िल्टर करें।
  4. FACS का उपयोग करCxcr4 + और Cxcr4- कोशिकाओं को अलग करें। FBS के 1 एमएल में हल कोशिकाओं लीजिए. सेल का नमूना रखें और कक्षों को 4 डिग्री सेल्सियस पर सॉर्ट किया।

5. अलग दिल फील्ड विशिष्ट कार्डिएक संतति कोशिकाओं का विश्लेषण

  1. सेंट्रीफ्यूज 270 x ग्राम और कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए सीपीसी को सॉर्ट किया जाता है। सॉर्ट की गई कोशिकाओं का उपयोग जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए किया जा सकता है या उन्हें बाद के समय बिंदुओं पर विश्लेषण के लिए पुनर्कृषि किया जा सकता है।
  2. अलग सीपीसी को फिर से संस्कृति बनाने के लिए, सुपरनेंट को प्रेरित करें, एसएफडी माध्यम में कोशिकाओं को फिर से रखें और 384-वेल प्लेट के प्रति अच्छी तरह से 384-वेल प्लेट के प्रति कोशिकाओं को पुन: रखें 0.1% (w/v) जिलेटिन।  यदि बढ़ी हुई कोशिका मृत्यु छँटाई के बाद नोट की जाती है, तो नमूने में Y-27632 (रॉक अवरोधक) का 10 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। पुनर्कृषि के दो दिन बाद, सहज पिटाई ध्यान दिया जाना चाहिए।
  3. कार्डियोमायोसाइट्स में अंतर करने के लिए प्लेट्ड सीपीसी की क्षमता का विश्लेषण करने के लिए, भेदभाव के दिन 12 में कोशिकाओं को इकट्ठा करें। एकल मुख्याहत्से को अलग करने के लिए चरण 1.2-1.5 में वर्णित ट्रिप्सिन का उपयोग करें। कोशिकाओं को 4% (w/v) पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) में पुन: असाइन करें और कोशिकाओं को ठीक करने के लिए कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. 895 x gपर 3 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें, और कमरे के तापमान। सुपरनेंट को प्रेरित करें और पीएफए को धोने के लिए पीबीएस में कोशिकाओं को फिर से शुरू करें। इस चरण को एक बार फिर दोहराएँ.
  5. सुपरनेंट को प्रेरित करें और पीबीएस में 10% एफबीएस में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। माउस एंटी-ट्रोपोनिन टी एंटीबॉडी (1:500) के साथ सेल नमूने के आधे इनक्यूबेट करें और बाकी नमूने को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग करें। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  6. पीबीएस का उपयोग करके चरण 5.4 में वर्णित कक्षों को दो बार धोएं. सुपरनॉटेंट को प्रेरित करें और पीबीएस में 10% एफबीएस में दोनों सेल नमूनों को 1:500 गधा एंटी-माउस आईजीजी (एच +एल) सेकेंडरी एंटीबॉडी, एलेक्सा फ्लोर 647 संयुग्मी के साथ पुन: असाइन करें। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  7. चरण 5.6 के रूप में पीबीएस के साथ दो बार धो लें। सुपरनेंट को प्रेरित करें और पीबीएस के 200 डिग्री एल में कोशिकाओं को फिर से शुरू करें। कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए एक प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करें।

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Representative Results

लगभग 132 एच के विभेदन के बाद, Tbx1-RFP और Hcn4-GFP CPCs एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है (चित्र 2). सामान्यतया, GFP और RFP कक्ष लगभग एक ही समय के आसपास दिखाई देते हैं। सीपीसी की दो आबादी निकट निकटता में और आमतौर पर एक पूरक पैटर्न में विस्तार करने के लिए जारी है. एक्टिविन ए और बीएमपी4 की सांद्रता को समायोजित करने से एफएचएफ बनाम एसएचएफ सीपीसी के प्रतिशत में परिवर्तन होगा (चित्र 3)। इन विट्रो में सीपीसी विनिर्देश मुख्य रूप से BMP4 की एकाग्रता द्वारा निर्धारित किया गया था. इसलिए, हमारे कार्डियक स्रूपभ कनेरा प्रणाली सीपीसी विनिर्देश का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

इसी तरह Isl1-RFP रिपोर्टर एमईएससी लाइन का उपयोग करते हुए, भेदभाव के 132 एच के बाद, Isl1-RFP + सीपीसी दिखाई देते हैं। CXCR4 के लिए सीपीसी के इम्यूनोस्टेनिंग के बाद, Isl1-RFP +, Cxcr4 + बनाम Isl1-RFP +, Cxcr4- कोशिकाओं को अलग किया जा सकता है (चित्र ाांधत 4 ).

कार्डियोमायोसाइट्स में अंतर करने के लिए एमईएससी व्युत्पन्न सीपीसी की क्षमता का विश्लेषण करने के लिए, कार्डियक ट्रोपोनिन टी के लिए इम्यूनोस्टेनिंग भेदभाव के 12 दिन में किया जा सकता है। इस मॉडल के साथ समझौते में कि एफएचएफ कोशिकाओं को मुख्य रूप से मायोसाइट्स के लिए अंतर, Hcn4-GFP + सीपीसी से व्युत्पन्न कोशिकाओं मुख्य रूप से myogenic हैं (चित्र 5ए, बी). इसी प्रकार, Isl1+ से व्युत्पन्न कोशिकाओं, CXCR4- सीपीसी भी Isl1 +, CXCR4- सीपीसी (चित्र 5सी) की तुलना में बहुत अधिक प्रतिशत पर कार्डियोमायोसाइट्स को जन्म देते हैं।

कभी-कभी, एमईएससी कुशलता से अंतर करने में विफल रहते हैं और बहुत कम संख्या में हृदय क्षेत्र-विशिष्ट सीपीसी बनाते हैं (चित्र6)।

Figure 1
चित्र 1 : हृदय क्षेत्र-विशिष्ट हृदय जनक कोशिकाओं के इन विट्रो विनिर्देश में का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। एमईएससी 48 एच के भीतर गोलभड़ियों का निर्माण करता है। फिर 40 एच के लिए Activin ए और BMP4 के लिए जोखिम mesodermal प्रेरण करने के लिए नेतृत्व करेंगे. कार्डिएक संतति कोशिकाएं लगभग 36 घंटे बाद विकसित होती हैं। दूसरे या पहले दिल क्षेत्र के जनक फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई का उपयोग कर हल किया जा सकता है। दूसरा दिल क्षेत्र कोशिकाओं Tbx1-RFP अभिव्यक्ति बनाम पहले दिल क्षेत्र है कि Hcn4-GFP द्वारा चिह्नित कर रहे हैं द्वारा चिह्नित कर रहे हैं. वैकल्पिक रूप से, Isl1-RFP सीपीसी के निशान और Cxcr4 के खिलाफ लाइव इम्यूनोस्टेनिंग का उपयोग कर एक तरह कर सकते हैं Isl1 +, Cxcr4 बनाम Isl1 +, Cxcr4- सीपीसी कि क्रमशः दूसरे बनाम पहली दिल क्षेत्र कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : सीपीसी विनिर्देश के बाद कार्डियक स्फीरॉइड की प्रतिनिधि छवि. आरएफपी चिह्न Tbx1 + और GFP अंक Hcn4 + सीपीसी. दो सेल आबादी एक मानार्थ पैटर्न में निकट निकटता में गठन कर रहे हैं. स्केल बार $ 50 डिग्री मी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : Activin A और BMP4 के विभिन्न सांद्रता के संपर्क के बाद कार्डियक स्फीरॉइड ्स्ड फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण। दो morphogens की सांद्रता समायोजित Tbx1 + और Hcn4 + सीपीसी के विभिन्न प्रतिशत की ओर जाता है. दो आबादी मुख्य रूप से BMP4 एकाग्रता का समायोजन करके प्रभावित थे. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : इसl1 व्यक्त हृदय जनक कोशिकाओं के प्रवाह cytometric विश्लेषण और Cxcr4 के लिए प्रतिरक्षा कर रहे हैं. कार्डिएक प्रोजेक्टरों को पहले उनके Isl1 अभिव्यक्ति के आधार पर गेट किया गया था और फिर Isl1+, Cxcr4 + बनाम Isl1+, Cxcr4- कोशिकाओं को हल किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5 : हृदय क्षेत्र-विशिष्ट सीपीसी से व्युत्पन्न कोशिकाओं का प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण हृदय ट्रोपोनिन टी के लिए दाग। (ए) एफएचएफ कोशिकाओं की उच्च मायोजेनिक क्षमता के अनुरूप, ह्एन4-जीएफपी+ कोशिकाओं का उच्च प्रतिशत मायोसाइट्स में अंतर करता है। (ख) सभी एमईएससी व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स का विश्लेषण, जहां विशाल बहुमत Hcn4-GFP + हैं। (सी) Cxcr4- सीपीसी कार्डियोमायोसाइट्स के उच्च प्रतिशत में अंतर करते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6 : इन विट्रो विभेदों में असफल/कम दक्षता का प्रतिनिधि साइटोमेट्रिक विश्लेषण। (ए) प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण 132 ज के विभेदन के बाद, एच सी एन 4-जीएफपी कोशिकाओं का कोई गठन नहीं दर्शाता है और Tbx1-RFP + कोशिकाओं का एक बहुत कम प्रतिशत है। () एमईएससी की निम्न विभेदन दक्षता Isl1 के बहुत निम्न स्तर को व्यक्त करती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

हमारे प्रोटोकॉल में, हम कार्डियक अफ़ीरॉइड और अलग दिल क्षेत्र-विशिष्ट सीपीसी उत्पन्न करने के लिए एक पद्धति का वर्णन करते हैं। उन सीपीसी विनिर्देश और उनके गुणों के तंत्र का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ ही हृदय कक्ष विशेष रोग मॉडलिंग के लिए. एक पहले से प्रकाशित काम दो फ्लोरोसेंट पत्रकारों के साथ एक एमईएससी लाइन का इस्तेमाल किया (Mef2c/Nkx2.5) इन विट्रो में cardiogenesis का अध्ययन करने के लिए, तथापि, उन दोनों मार्करों भ्रूण दिन 9.5-10 पर व्यक्त कर रहे हैं जब cardiomycytes पहले से ही26का गठन कर रहे हैं . हमारे ज्ञान के लिए, वर्तमान में दिल क्षेत्र के अलगाव के लिए कोई तरीके हैं विशिष्ट इन विट्रो में सीपीसी. इससे भी महत्वपूर्ण बात, हमारे प्रोटोकॉल भी मानव स्टेम कोशिकाओं, जहां CXCR4 SHF CPCs कि Isl125के उच्च स्तर को व्यक्त को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए लागू किया जा सकता है. इसके अलावा, हमारे डबल, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर MESC लाइन यौगिकों और प्रतिलेखन कारकों है कि दिल क्षेत्र विनिर्देश या सीपीसी में सेल polarity को प्रभावित कर सकते हैं की पुस्तकालयों स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों में से एक MESCs की प्रारंभिक संख्या है। कम या उच्च संख्या का उपयोग काफी हृदय गोलभक्षी और भेदभाव दक्षता के आकार को प्रभावित करेगा. हम विभिन्न एमईएससी लाइनों के लिए विभिन्न सेल नंबरों (7.5-10 x 104 सेल/एमएल) का परीक्षण करने की अनुशंसा करते हैं। वैकल्पिक रूप से, यदि कार्डियक स्फीरोइड का आकार काफी परिवर्तनशील रहता है, तो निर्दिष्ट आकार के माइक्रोवेल्स वाले कुओं वाली प्लेटों का उपयोग पुनरुत्पादनीयता को बढ़ाने के लिए भी किया जा सकता है। जांचकर्ताओं को भी विशिष्ट समय और mesodermal प्रेरण की अवधि के साथ ही सेल छँटाई के समय के बारे में जागरूक होना चाहिए. इसके अलावा, विभिन्न एमईएससी लाइनों के लिए, कार्डियबियन सांद्रता का अनुकूलन कार्डियक गोलोइड में सीपीसी उत्पन्न करने की उनकी क्षमता का परीक्षण करने से पहले किया जाना चाहिए। पुराने / समाप्त साइटोकिन्स या सेल संस्कृति माध्यम, या morphogens के असंगत सांद्रता का उपयोग भेदभाव दक्षता को प्रभावित करेगा. अंत में, 15-20 बार से अधिक के लिए पारित किया गया है कि एमईएससी लाइनों, कुशलता से अंतर करने के लिए अपनी क्षमता खोने के लिए दिखाई देते हैं।

हमारी भेदभाव प्रणाली विशिष्ट संशोधनों की अनुमति देता है. Cxcr4 एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के बिना एमईएससी लाइनों में SHF सीपीसी के एक एकमात्र मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, जांचकर्ताओं अभी भी भेदभाव प्रोटोकॉल का अनुकूलन करने के लिए Isl1 + सीपीसी के प्रतिशत को बढ़ाने से पहले Cxcr4 + बनाम Cxcr4- सीपीसी25होना चाहिए. इसके अलावा, Activin A को विहित Wnt agonists/activators जैसे Wnt3a या CHIR99021 (GSK3b अवरोध करनेवाला) के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है ताकि SHF CPCs25के विनिर्देश को और बढ़ाया जा सके।

यह प्रोटोकॉल अच्छी तरह से परिभाषित शर्तों, समय चूक निगरानी, और कोशिकाओं की अप्रतिबंधित संख्या का उपयोग कर सीपीसी विनिर्देश के अध्ययन में सक्षम बनाता है। इस प्रकार, यह भ्रूण का विश्लेषण करने की तुलना में अधिक सुगम, कुशल और कम महंगा है। फिर भी, यह अभी भी एक इन विट्रो प्रणाली है जहां दिल क्षेत्र विशिष्ट सीपीसी के निरपेक्ष जीन अभिव्यक्ति मूल्यों कसकर vivo जीन अभिव्यक्ति के स्तर में के साथ सहसंबंधित नहीं हो सकता है. इस प्रकार, हमारी प्रणाली में, केवल BMP4 दोनों दिल क्षेत्रों से सीपीसी निर्दिष्ट कर सकता है और काफी उनके संबंधित अनुपात बदल सकते हैं. साथ ही, परिवर्तनशीलता भेदभाव क्षमता के बारे में मौजूद हो सकता है.

अंत में, एमईएससी फ्लोरोसेंट रिपोर्टर लाइनों या सेल झिल्ली प्रोटीन के इम्यूनोस्टेनिंग का उपयोग करते हुए, हमने विट्रो और अलग दिल क्षेत्र-विशिष्ट सीपीसी में कार्डियोजेनेसिस को फिर से पहचाना। यह प्रारंभिक संकेतों के अध्ययन की अनुमति देता है जो सीपीसी विनिर्देश और कार्यात्मक गुणों के साथ-साथ हृदय क्षेत्र/कक्ष-विशिष्ट जन्मजात हृदय रोगों को मॉडलिंग करते हैं।

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Disclosures

लेखकों खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

ई. टी जादू कि मामलों और AHA द्वारा समर्थित था. C. K. NICHD/NIH (R01HD086026), AHA, और एमएससीआरएफ से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
β-mercaptoethanol Sigma M6250
0.1% (w/v) Gelatin EMD Millipore ES-006-B
100 mM Sodium Pyruvate Gibco 11360
100x Pen/Strep Gibco 15070-063
1x PBS w/o Calcium and Magnesium Thermo Fisher Scientific 21-040-CV
20% Paraformaldehyde Thermo Fisher Scientific 50-980-493
5 mL Polystyrene round-bottom tube with a 40μm cell strainer BD Falcon 35223
Activin A R & D Systems 338-AC-010
Ascorbic Acid Sigma A-4544
B27 minus vitamin A (50x) Thermo Fisher Scientific 12587010
BMP4 R & D Systems 314-BP
Bovine Serum Albumin Sigma A2153
Cell sorter Sony SH800 Sony or any other fluorescence-activated cell sorter
Cell strainer 70μm Thermo Fisher Scientific 08-771-2
Centrifuge Sorvall Legend XT Thermo Fisher Scientific 75004508
CHIR99021 Selleck chemicals S2924
CO2 Incubator Thermo Fisher Scientific 51030285
Corning Ultra Low Attachment T75 flask Corning 07-200-875
Countless II FL automated cell counter Thermo Fisher Scientific
Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate Thermo Fisher Scientific A-31571, Lot #1757130
Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose (DMEM) Gibco 11965-092
EDTA Sigma E6758
ESGRO (LIF) Millipore ESG1106
EVOS FL microscope Thermo Fisher Scientific AMF4300
Fetal Bovine Serum Invitrogen SH30071.03
Glasgow’s MEM (GMEM) Gibco 11710035
GlutaMAX (100x) Gibco 35050-061
Ham’s F12 Gibco 10-080-CV
HEPES Sigma H3375
IMDM Gibco 12440053
Monothioglycero (MTG) Sigma M-6145
Mouse anti-Troponin T antibody Thermo Fisher Scientific MS-295-P1
N2-SUPPLEMENT Gibco 17502-048
Non-essential amino acid solution (NEAA Invitrogen 11140-050
PD0325901 Selleckchem S1036
PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody Thermo Fisher Scientific 46-9991-82
Suspension culture dish 150 mm x 25 mm Corning 430597
T25 flasks Corning 353109
TrypLE (Trypsin) Gibco 12604
Y-27632 (ROCK inhibitor) Stem cell technologies 72304

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References

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