लिपिड-मिश्रण परख के लिए Liposomes में रिकॉमबिनेंट Drosophila Atlastin के डिटर्जेंट की मदद से पुनर्गठन

Biochemistry

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Summary

जैविक झिल्ली संलयन विशेष संलयन प्रोटीन द्वारा उत्प्रेरित है। प्रोटीन के fusogenic गुणों को मापने लिपिड मिश्रण परख द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. हम पुनः संयोजक Drosophila atlastin, एक प्रोटीन है कि ईआर के homotypic संलयन मध्यस्थता, यह preformed liposomes के लिए पुनर्गठन, और संलयन क्षमता के लिए परीक्षण के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं.

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Betancourt-Solis, M. A., McNew, J. A. Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays. J. Vis. Exp. (149), e59867, doi:10.3791/59867 (2019).

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Abstract

झिल्ली संलयन यूकैरियोटिक कोशिका में एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है। संलयन को उत्प्रेरित करने के लिए विशेष प्रोटीन आवश्यक हैं। ए्टलैस्टिन एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) निवासी प्रोटीन हैं जो ईआर के होमोटाइपिक संलयन में फंसाया जाता है। हम यहाँ एक glutathione एस-ट्रांसफरेस (जीएसटी) और पॉली-हिस्टिडाइन को शुद्ध करने के लिए एक विधि का विस्तार करते हैं, जिसमें एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी के दो दौर द्वारा ड्रोसोफिला एटलास्टिन टैग किया गया है। इन विट्रो में संलयन प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए शुद्ध संलयन प्रोटीन को लिपिड द्विपरत में डाला जाना आवश्यक है। Liposomes आदर्श मॉडल झिल्ली हैं, के रूप में लिपिड संरचना और आकार समायोजित किया जा सकता है. यह अंत करने के लिए, हम drosophila atlastin के लिए preformed liposomes में डिटर्जेंट हटाने के द्वारा एक पुनर्गठन विधि का वर्णन. जबकि कई पुनर्गठन के तरीके उपलब्ध हैं, डिटर्जेंट हटाने के द्वारा पुनर्गठन कई फायदे हैं जो इसे atlastins और अन्य समान प्रोटीन के लिए उपयुक्त बनाते हैं। इस विधि का लाभ एक उच्च पुनर्गठन उपज और पुनर्गठन प्रोटीन का सही अभिविन्यास भी शामिल है. इस विधि अन्य झिल्ली प्रोटीन के लिए और अन्य अनुप्रयोगों है कि proteoliposomes की आवश्यकता के लिए बढ़ाया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, हम झिल्ली संलयन के माप के रूप में इस्तेमाल किया प्रोटीओलिपोसोम के एक FRET आधारित लिपिड मिश्रण परख का वर्णन.

Introduction

झिल्ली संलयन कई जैविक प्रतिक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है। जैविक परिस्थितियों में, झिल्ली संलयन सहज नहीं है और इस तरह की प्रतिक्रियाओं को उत्प्रेरित करने के लिए विशेष संलयन प्रोटीन की आवश्यकताहोती है 1। ईआर होमोटाइपिक झिल्ली संलयन डाइनामिन संबंधित जी.टी.पी.एस. एटलास्टिन2द्वारा जानवरों में मध्यस्थता की जाती है। समरूपीय संलयन में Atlastin की भूमिका परिधीय ईआर में तीन तरह के जंक्शनों के लिए मौलिक है, जो ट्यूबल के एक बड़े परस्पर नेटवर्क का गठन करता है जो पूरे सेल में विस्तार करता है। Atlastins एक संरक्षित डोमेन आकृति विज्ञान एक बड़े GTPase, एक तीन कुंडलिनी बंडल मध्य डोमेन, एक हाइड्रोफोबिक झिल्ली लंगर, और एक छोटी साइटोप्लाज्मिक सी-टर्मिनल पूंछ3से मिलकर है। रिकॉमबिनेंट Drosophila atlastin के साथ इन विट्रो अध्ययन में पता चला है कि जब liposomes के लिए पुनर्गठन, यह अपने fusogenic गुणों का कहना है. मानव समलॉग सहित अन्य atlastins इन विट्रो में संलयन recapitulate करने में सक्षम नहीं किया गया है. हम यहाँ एक जीएसटी और पॉली-हिस्टिडाइन टैग रिकॉमबिनेंट Drosophila atlastin के लिए एक पद्धति का वर्णन, यह liposomes के लिए पुनर्गठन, और फ्यूजन पराजय.

इन विट्रो में झिल्ली संलयन का अध्ययन एक चुनौती प्रस्तुत करता है क्योंकि फ्यूजोजेनिक प्रोटीन में आमतौर पर एक झिल्ली लंगर होता है। उन्हें अध्ययन करने के लिए, उन्हें मॉडल लिपिड बाइलेयर में पुनर्गठन करना आवश्यक है। बड़े unilamellar vesicles (LUV) लिपिड प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण हैं। हम यहाँ प्रोटीन पुनर्गठन और संलयन परख के लिए विभिन्न लिपिड रचनाओं के LUVs बनाने के लिए एक प्रणाली मौजूद है. LUVs में अभिन्न प्रोटीन का पुनर्गठन सहित तरीकों की एक किस्म द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, कार्बनिक विलायक मध्यस्थता पुनर्गठन, यांत्रिक तंत्र, या डिटर्जेंट सहायता प्रदान पुनर्गठन4. हम यहाँ डिटर्जेंट हटाने से preformed liposomes में Drosophila atlastin के पुनर्गठन के लिए एक विधि मौजूद है. इस पुनर्गठन विधि के लाभ उच्च पुनर्गठन पैदावार और लिपिड bilayer में atlastin के उचित अभिविन्यास शामिल हैं. इसके अतिरिक्त, इस विधि के माध्यम से, प्रोटीन सूखे या कार्बनिक सॉल्वैंट्स के संपर्क में नहीं है जिससे संरचना और समारोह को बनाए रखने. इसके नुकसान के अलावा, डिटर्जेंट की उपस्थिति सभी प्रोटीन के लिए आदर्श नहीं हो सकता है और अंतिम proteoliposomes लिपिड bilayer में कुछ शामिल डिटर्जेंट हो सकता है. इसके अलावा डायलिसिस डिटर्जेंट के अधिक को खत्म करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, डायलिसिस एक लंबा समय लग सकता है और इसलिए प्रोटीन गतिविधि की हानि हो सकती है।

Atlastin के संलयन गतिविधि का आकलन लिपिड मिश्रण assays द्वारा निर्धारित किया जा सकता है के रूप में पहले वर्णित2. यहाँ, हम N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl (NBD)/Lisamine rhodamine-B sulfonyl (rhodamine) लेबल लिपिड के माध्यम से atlastin मध्यस्थता संलयन को मापने के लिए एक विधि वर्णन. इस परख दाता के संलयन की आवश्यकता है (लेबल) proteoliposomes और स्वीकारकर्ता (unlabeled) proteoliposomes. एक FRET रिलीज एक दाता-स्वीकारक जोड़ी के कमजोर पड़ने के रूप में मापा जा सकता है "लेबल" liposomes करने के लिए "unlabeled" liposomes झिल्ली संलयन के दौरान लिपिड मिश्रण का एक परिणाम के रूप में (चित्र 1)5. हालांकि इस परख झिल्ली संलयन के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में कार्य करता है, यह झिल्ली संलयन और अर्धभ्रम, एक राज्य है जहां केवल बाहरी पत्रक मिश्रण के बीच भेद में सीमित है. इस मुद्दे को हल करने के लिए, एक विकल्प dithionite द्वारा NBD के बाहरी पत्रक शमन है. NBD/rhodamine लिपिड मिश्रण परख के रूप में एक ही पद्धति का पालन, बाहरी पत्रक किसी भी NBD FRET संलयन द्वारा जारी बुझाने पर आंतरिक पत्रक मिश्रण8के कारण होगा.

आंतरिक जलीय सामग्री मिश्रण पते पूर्ण संलयन केवल5द्वारा वैकल्पिक संलयन assays . इसके उदाहरण हैं- टेरबियम (टीबी)/डिपिकॉलिनिक एसिड (डीपीए) परख और अमीनाफ्थैलीन ट्राइसल्फोनिक एसिड (एएनटीएस)/पी-xylene bis (pyridinium) ब्रोमाइड (DPX) परख। Tb/DPA assays में, encapsulated Tb के साथ liposomes का एक पूल मिश्रित कर रहे हैं और encapsulated DPA के साथ liposomes के साथ जुड़े; संलयन पर, [Tb (DPA)3]3- chelation जटिल6के भीतर डीपीए से टीबी करने के लिए आंतरिक ऊर्जा हस्तांतरण के माध्यम से फ्लोरोसेंट बढ़ जाता है। इसके विपरीत, ANTS/DPX assays के लिए, ANTS फ्लोरोसेंट DPX7द्वारा बुझा दिया जाता है. जबकि इन प्रणालियों आंतरिक सामग्री मिश्रण पता है, liposomes की अधिक गहराई से तैयारी गैर-लम्बोद अभिकर्मकों को हटाने के लिए आवश्यक है, साथ ही fluorores के अनपेक्षित बातचीत.

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Protocol

1. जीएसटी-DAtl-His8 का शुद्धिकरण

  1. प्रोटीन अभिव्यक्ति और lysate तैयारी
    1. PGEX4-T32 में GST-DAtl-His8 निर्माण के साथ BL21 (DE3) ई. कोलाई रूपांतरण करें और एक एम्पिसिलिन प्लेट पर चयन करें।
    2. एक एकल परिवर्तक और टीका 5 एमएल एलबी + एम्सिलिन (5 100 मिलीग्राम/एमएल एम्पीसिलिन का 5 डिग्री सेल्सियस) का चयन करें, एक 14 एमएल संस्कृति ट्यूब में और 25 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए 25 डिग्री सेल्सियस पर 6-8 एच के लिए मिलाते हुए।
      नोट: लीक अभिव्यक्ति के कारण, उच्च तापमान पर इनक्यूबेट करने की सिफारिश नहीं की जाती है। 25 डिग्री सेल्सियस की वृद्धि इस वृद्धि अवधि के दौरान प्रोटीन के एकत्रीकरण को कम कर देता है।
    3. एल बी + एम्सिलिन के 200 एमएल को 5 एमएल संस्कृति के 1 एमएल के साथ टीका लगाएं और रात भर इनक्यूबेट करें ($15-18 ज) 25 डिग्री सेल्सियस पर।
    4. अगली सुबह, सेंट्रीफ्यूगेशन (2,000 x ग्राम 10 मिनट के लिए) द्वारा कोशिकाओं फसल और LB के 5 एमएल में resuspend.
    5. जड़ + एम्सिलिन के 4 एल टीका और OD600 उपाय (0.05-0.15). मिलाते हुए के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
      नोट: बैक्टीरिया जोड़ने से पहले OD600 माप के लिए एक खाली के रूप में सेवा करने के लिए कुछ मीडिया आरक्षित करें।
    6. यह 0.4-0.5 के बीच एक ओडी तक पहुँच जाता है जब तक OD600 हर घंटे उपाय. इस बिंदु पर, तापमान को 16 डिग्री सेल्सियस तक कम करें।
    7. 0.2 एम एम IPTG (800 $L 1 M स्टॉक के साथ प्रेरित), इनक्यूबेटर 16 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने के बाद 10 मिनट. रात भर इनक्यूबेट ($15-18 ज) 16 डिग्री सेल्सियस पर।
      नोट: कम तापमान atlastin के एकत्रीकरण को कम करके कार्यात्मक प्रोटीन की उपज में सुधार.
    8. अगली सुबह, 4 डिग्री सेल्सियस पर 7,500 x g पर centrifuging द्वारा कोशिकाओं फसल.
    9. A200 (25 एमएम HEPES (पीएच 7.4) और 200 एम केसीएल के 200 एमएल में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
    10. कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 11,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    11. बफर तोड़ने के 40 एमएल में गोली को फिर से निलंबित (A200 प्लस 10% ग्लिसरोल, 2 एम एम 2-mercaptoethanol, 4% Triton X-100 (TX100), 40mM imidazole, और एक EDTA मुक्त प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल गोली).
      नोट: बुलबुले और फोम पैदा करने से बचने के लिए resuspending के बाद TX-100 जोड़ें.
    12. एक 18 जी सुई के माध्यम से गुजरती हैं और एक सेल के माध्यम से कोशिकाओं को चलाने के लिए 10,000 psi पर तीन बार disrupter.
    13. 1 ज के लिए 125,000 x ग्राम पर निकालने का केंद्रण।
      नोट: वैकल्पिक रूप से 8 एम यूरिया में गोली 1:2 (w:v) भंग और रात भर कमरे के तापमान पर अखरोट. एक विकृत के रूप में यूरिया धीरे धीरे एसडीएस-पेज विश्लेषण के लिए किसी भी अघुलनशील गोलीप्रोटीन भंग हो जाएगा। एसडीएस-पेज और Coomasie दाग विश्लेषण के लिए 1 $L सहेजें।
    14. बैक्टीरिया और बड़े जीवाणु मलबे को दूर करने के लिए एक 0.45 डिग्री सेलूलोज़ नाइट्रेट बाँझ झिल्ली फिल्टर के माध्यम से निकालने फ़िल्टर।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, एसडीएस पेज और Coomasie दाग विश्लेषण के लिए 1 $L बचाने के लिए।
  2. आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी द्वारा प्रोटीन शुद्धि
    1. फ़िल्टरकिए गए lysate को एक स्थिर धातु आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी (आईएमएसी) राल कॉलम पर लोड करें जो नि2+के साथ चार्ज किया जाता है, कम इमिडाज़ोल बफर (ए100 प्लस 10% ग्लिसरॉल, 2 एम एम 2-मेरकैप्टोथेनोल, 1% TX-100, 40 mM imidazole) के साथ चार्ज किया गया है। 4 डिग्री सेल्सियस पर मिनट।
    2. A100 से अधिक 10% ग्लिसरॉल, 2 एम 2-mercaptoethanol, 0.1% Anapoe एक्स-100, 40 m imidazole की दर के साथ 4 mL/min की दर के साथ कॉलम धो लें 4 डिग्री सेल्सियस पर। इमिडाज़ोल की 30 एमएल रैखिक प्रवणता वाले प्रोटीन को 40 एमएल से 500 मीटर तक और 500 एमएल में अंतिम 5 एमएल धोने के साथ।
    3. पूल एक साथ चोटी भिन्न और सूजन GSH-Agarose मोती के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए इनक्यूबेट, पहले पानी में सूजन और 10% ग्लिसरोल, 2 एमएम 2-mercaptoethanol, 0.1% Anapoe एक्स-100, और 1 एमएम EDTA के साथ A100 में बराबर.
      नोट: GSH-Agarose मोती पानी के 50 एमएल में सूजन से पहले दिन और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर incubated, या आरटी में 1 एच के लिए किया जा सकता है. पानी और तुल्यता बफर को दूर करने के लिए, ब्रेक के बिना 1 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर एक झूलते बाल्टी रोटर में अपकेंद्रित्र। एक 26 जी सुई के साथ supernatant प्रेरित.
    4. गोली GSH-Agarose मोती एक झूलते बाल्टी रोटर में 500 x ग्राम पर ब्रेक के बिना centrifuging द्वारा और एक 26 जी सुई के साथ आकांक्षा द्वारा lysate supernatant हटा दें.
    5. एक 10 एमएल polyprep कॉलम के लिए मोती स्थानांतरण और 5 एमएल के साथ पांच बार धोने समभन बफर (A100 के साथ 10% ग्लिरोल, 2 एम एम 2-mercaptoethanol, 0.1% Anapoe X-100, और 1 M EDTA) 500 x ग्राम पर centrifuging द्वारा.
    6. 1-1.5 एमएल के साथ प्रोटीन को 10 एमएल कम ग्लूटाथियोन के साथ पूरक किया गया। अलीकोट तरल नाइट्रोजन में प्रोटीन और फ्लैश फ्रीज को समाप्त कर दिया। प्रोटीन को अनिश्चित काल के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
      नोट: एल्यूशन बफर के पीएच को 7.4 तक समायोजित करें।
    7. amido काले प्रोटीन परख9 द्वारा प्रोटीन एकाग्रता की मात्रा और एसडीएस-पेज और Coomasie धुंधला द्वारा शुद्धता का आकलन.

2. लिपोसोम में रिकॉमबिनेंट एटलास्टिन का पुनर्गठन

  1. बाहर निकालना विधि द्वारा Liposome उत्पादन 10
    1. क्लोरोफॉर्म (10 एमएम कुल लिपिड) में लिपिड मिश्रण स्टॉक बनाएं। आवश्यक लिपिड हैं 1-पामिटोइल-2-ओलियोइल-ग्लिसेरो-3-फॉस्फोकोलीन (पीओपीसी), 1,2-डायलियोइल-एसएन-ग्लिसेरो-3-फॉस्फो-एल-सेरीन (डीओपी), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-फॉस्फोएथेनोलैमिन-N-(7-नाइट्रो-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (NBD-DPPE), और 1,2- डाइपैलिमिटोइल-स्न-ग्लिसेरो-3-फॉस्फोएथेनोलैमिन-एन-(लिसामाइन रोडामाइन बी सल्फोनिल) (आर-डीपीई)। ग्राही लिपोसोम ्स POPC: DOPS (85:15 मोलर अनुपात) और POPC के दाता liposomes:DOPS:Rh-PE:NBD-PE (83:15:1.5:1.5 मोलर अनुपात)।
      नोट: जबकि POPC: DOPS लिपिड घोला जा सकता है पारंपरिक रूप से इन विट्रो लिपिड मिश्रण परख के लिए इस्तेमाल किया गया है, वैकल्पिक लिपिड रचनाओं विभिन्न प्रयोगात्मक प्रयोजनों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. POPC: DOPS liposomes बहुत स्थिर और फ्यूज करने के लिए कठिन हैं, इसलिए संलयन के लिए एक बहुत ही कड़े प्रणाली है.
    2. लिक्विड मिश्रण करने के लिए एल-जेड-डिपैलिमिटोल-फॉस्फाटिडिलकोलीन (कोलीन मिथाइल-3 एच) के 1 [Ci/mL जोड़ें) तरल scintillation गिनती द्वारा बाद के चरणों में लिपिड सांद्रता निर्धारित करने के लिए। इस स्टॉक के कम से कम 8 डिग्री सेल्सियस आरक्षित करें।
    3. लिपिड की वांछित राशि को फ्लिंट ग्लास ट्यूबों में मिलाएं।
    4. लिपिड को $ 10 मिनट के लिए N2 गैस की कोमल धारा के नीचे सुखाएं जब तक कि कोई और क्लोरोफॉर्म दिखाई न दे।
    5. 30 मिनट के लिए vacuuming द्वारा एक desicator में लिपिड फिल्म आगे सूखी.
    6. लिपिड फिल्म के लिए 10% ग्लिसरोल, 2 एम 2-mercaptoethanol, और 1 एमएम EDTA के साथ पर्याप्त जलीय A100 जोड़ें और 10 एमएम के लिए एकाग्रता वापस लाने के लिए। कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए हल्के से भंवर द्वारा लिपिड फिल्म को फिर से निलंबित करें। एक भंवर कि चकमक कांच ट्यूब को समायोजित कर सकते हैं की सिफारिश की है.
    7. तरल नाइट्रोजन में हाइड्रेटेड लिपिड को दस गुना फ्रीज करें। तरल नाइट्रोजन में ठंड के बाद, समाधान 30 s के लिए कमरे के तापमान पर बैठने की अनुमति देकर liposomes thaw, तो तेजी से thwing के लिए पानी के लिए स्थानांतरण. इस फ्रीज-थॉव साइकिलिंग multilamellar vesicles कम से कम होगा.
      चेतावनी: ट्यूब दरार हो सकता है अगर वे 0.5 एमएल से बड़ा मात्रा में होते हैं और अगर वे सीधे पानी के लिए तरल नाइट्रोजन फार्म स्थानांतरित कर रहे हैं.
    8. 100 एनएम pores आकार के साथ पॉली कार्बोनेट फिल्टर के माध्यम से लिपिड पास 19 बार मिनी-एक्सट्रूडर का उपयोग कर।
    9. छानबीन गिनती द्वारा liposomes की कुल लिपिड एकाग्रता का निर्धारण
      नोट: लिपिड के कुछ कांच ट्यूबों में पीछे छोड़ दिया जा सकता है और मिनी-एक्सट्रूडर में.
      1. 3 एमएल के शानदार कॉकटेल में लिपिड स्टॉक और लिपोसोम के 4 डिग्री एल जोड़ें।
      2. स्टॉक और liposomes के लिए प्रति मिनट औसत गणना उपाय (CPMA). और निम्नलिखित सूत्र के साथ liposomes एकाग्रता की गणना:Equation 1
    10. एक सप्ताह तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर liposomes स्टोर. लंबे समय तक भंडारण की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि लिपोसोम समय के साथ कुल हो सकता है, पुनर्गठन क्षमता को कम कर सकता है।
  2. पूर्वीकृत लिपोसोम में डिटर्जेंट सहायता प्रदान किए गए निगमन द्वारा पुनर्गठन
    1. बफर, प्रोटीन, liposomes और अतिरिक्त डिटर्जेंट की मात्रा की गणना करने के लिए एक साथ मिलाया जा करने के लिए:
      1. इच्छित कुल वॉल्यूम निर्धारित करें। इस मात्रा बफर A100 के साथ बना है 10% ग्लिसरोल, 2 एम 2-mercaptoethanol, और 1 एम एम EDTA. 250 डिग्री सेल्सियस से कम वॉल्यूम 0.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में अच्छी तरह से मिश्रण नहीं करते हैं।
      2. लगभग 1 उम के अंतिम लिपिड सांद्रता देने के लिए आवश्यक लिपोसोम की मात्रा की गणना कीजिए। बफ़र वॉल्यूम से वॉल्यूम घटाएँ।
      3. लिपिड मोलर अनुपात (आमतौर पर 1:400) को वांछित प्रोटीन देने के लिए आवश्यक प्रोटीन की मात्रा की गणना करें। बफ़र वॉल्यूम तदनुसार घटाएँ।
      4. निर्धारित करें कि 0ण्64-0-8 के बीच एक प्रभावी डिटर्जेंट को लिपिड अनुपात (आरeff) के लिए लक्ष्य करने के लिए लिपोसोम को तर करने के लिए कितना अतिरिक्त डिटर्जेंट जोड़े जाने की आवश्यकता है। प्रोटीन के साथ जोड़ा जाता है कि डिटर्जेंट पर विचार करने के लिए याद रखें. समीकरण Equation 2 डीकुल द्वारा निर्धारित किया जाता है कुल डिटर्जेंट एकाग्रता और डीपानी एकात्मक डिटर्जेंट एकाग्रता (TX-100 के लिए 0.18 एमएम और डिटर्जेंट की उपस्थिति में Anapoe X-100)4है , 11|
    2. बफर, डिटर्जेंट, प्रोटीन, और liposomes: निम्नलिखित क्रम में एक 0.5 एमएल ट्यूब में एक साथ समाधान मिक्स. तेजी से liposomes जोड़ें और भंवर तुरंत के लिए 5 s मिश्रण homogenize करने के लिए.
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए एक पोषक में प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें।
    4. पानी में 0.2 g/mL गैर ध्रुवीय polystyrene adsorbent मनका "स्लरी" बनाओ।
      नोट: चरण 2.2.3 में पिछले 1 एच इनक्यूबेशन के दौरान polystyrene अधिशोषक मनका "स्लरी" बनाओ।
    5. 0.2 ग्राम पॉलीस्टाइरीन एसोर्बेंट मोती का वजन करें और एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    6. ट्यूब में 1 एमएल मेथनॉल जोड़कर मोतियों को डिगैस करें और 1 मिनट के लिए मिश्रण करें। डिगैस्ड मोती डूब जाएगा।
    7. मेथनॉल को प्रेरित करें और मोतियों में पानी डालें। मोती 5 मिनट के लिए पानी के साथ मिश्रण करते हैं, तो पानी aspirate. चार बार दोहराएँ, तो polystyrene adsorbent मनका "स्लरी" पानी के साथ 1 एमएल मात्रा और 0.2 g/mL के एक अंतिम एकाग्रता लाने के लिए.
      नोट: मोती अभी भी ट्यूब के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करना चाहिए. यदि वे नहीं करते हैं, degas फिर से. मोती से एस्पायर मेथनॉल और पानी के लिए एक 21 जी या उच्च सुई का प्रयोग करें।
    8. प्रत्येक नमूने में सभी डिटर्जेंट को अवशोषित करने के लिए आवश्यक polystyrene अधिशोषक मोती की मात्रा की गणना करें। 1 ग्राम पॉलीस्टाइरीन एसोर्बेंट मोती 70 मिलीग्राम TX-100 को अवशोषित करता है। प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक polystyrene अधिशोषक मनका घोल की मात्रा की गणना करने के लिए, प्रतिक्रिया में कुल डिटर्जेंट विभाजित (चरण 2.2.1.4) द्वारा 70 मिलीग्राम, और फिर मनका घोल की एकाग्रता से (0.2 g/
    9. स्थानांतरण polystyrene अधिशोषक मनका घोल की गणना राशि एक 0.5 एमएल ट्यूब करने के लिए और पानी aspirate.
      नोट: मोती स्थानांतरित करने के लिए एक 20-200 $L टिप के अंत में कटौती, बस बसे मोती को फिर से निलंबित करने के लिए pipeting से पहले ट्यूब भंवर.
    10. 0.5 एमएल ट्यूब में नमूने जोड़ें जिसमें पॉलीस्टाइरीन एसोर्बेंट मोती होते हैं और नमूना 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए पोषण को इनक्यूबेट करें।
    11. दो बार पुराने मोती पीछे छोड़ने और ताजा मोती के लिए नमूना स्थानांतरित दोहराएँ.
    12. ताजा मोती के साथ एक चौथे ट्यूब के लिए नमूना जोड़ें और रात भर इनक्यूबेट ($15-18 ज) 4 डिग्री सेल्सियस पर।
  3. सुबह में, polystyrene adsorbent मोती और गोली अघुलनशील प्रोटीन समुच्चय से नमूना हटाने के लिए 10 मिनट के लिए 16,000 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर centrifuging द्वारा.
  4. supernatant ठीक है और तरल scintillation गिनती द्वारा अंतिम लिपिड एकाग्रता का निर्धारण (चरण 2.1.9.2 देखें). वैकल्पिक रूप से, प्रोटीन एकाग्रता amido काले प्रोटीन परख9द्वारा निर्धारित किया जा सकता है.
    नोट: atlastin proteoliposomes के लिए, एंजाइमी परख ताजा liposomes के साथ किया जाना चाहिए. 4 डिग्री सेल्सियस या ठंड में लंबे भंडारण atlastin गतिविधि में महत्वपूर्ण नुकसान की ओर जाता है।

3. लिपिड मिश्रण परख

  1. दाता और स्वीकारकर्ता प्रोटीओलिपोसोम को A100 में 0.15 एम प्रत्येक की सांद्रता के लिए 10% ग्लिसरोल, 2 एमएम जेड-मरकेटोथेनोल, 1 एमएम ईडीटीए और 5 एमएम एमजीसीएल2के साथ ले आओ। प्रत्येक प्रतिक्रिया (50 जेडएल) एक फ्लैट सफेद 96 अच्छी तरह से फ्लोरोसेंट रीडिंग के लिए उपयुक्त प्लेट में एक अच्छी तरह से करने के लिए जोड़ा जाना चाहिए। एक triplicate सहित कम से कम 4 प्रतिक्रियाओं को तैयार है, और एक नहीं-GTP नकारात्मक नियंत्रण.
  2. प्लेट को पहले से गरम प्लेट रीडर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें। उपाय NBD फ्लोरोसेंट (उत्तेजना 460 एनएम और उत्सर्जन 535 एनएम) के लिए 5 मिनट हर मिनट.
  3. 5 एमएम GTP (5 $L 50 m GTP) जोड़कर संलयन को प्रेरित करें।
  4. 1 ज के लिए हर मिनट NBD फ्लोरोसेंट उपाय।
  5. प्रोटीओलिपोसोम को भंग करने के लिए 2.5% w/v n-Dodecyl ]-D-maltoside के 5 डिग्री एल जोड़ें और अधिकतम NBD फ्लोरोसेंट को मापता है। हर मिनट 15 मिनट के लिए NBD फ्लोरोसेंट पढ़ें.

4. Iohexol discontinuous ग्रेडिएंट12 पर Liposome फ्लोटेशन

  1. (वैकल्पिक) 13 पर ाालाओं द्वारापुनर्गठन की दक्षता का विश्लेषण कीजिए.
  2. 10% ग्लिसरॉल, 2 एमएम 2-मेरकैप्टोथेनोल, और 1 एमएम एड्टा के साथ A100 में एक 80% और एक 30% w/v iohexol तैयार करें। Iohexol आसानी से भंग नहीं करता है, तो यह एक दिन पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर रात को nutating द्वारा तैयार किया जाना चाहिए.
  3. अच्छी तरह से यह एक 40% iohexol करने के लिए लाने के लिए proteoliposomes नमूने के 150 $L के साथ 80% iohexol स्टॉक के 150 डिग्री एल मिश्रण. एक 5 x 41 मिमी2 अल्ट्रा स्पष्ट ट्यूब बुलबुले से बचने के लिए इस जोड़ें.
  4. एक मध्यम परत बनाने के लिए नमूना के शीर्ष पर धीरे-धीरे 30% iohexol स्टॉक की परत 250 $L। किसी भी बुलबुले से बचें और नीचे की परत परेशान. मध्य परत के शीर्ष पर, धीरे-धीरे 2 एम 2-मर्केटोथेनोल और 1 एम ईडीटीए के साथ ए100 के 50 डिग्री एल जोड़ें।
  5. धीमी त्वरण और कोई ब्रेक के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 एच के लिए 220,000 x ग्राम पर एक झूलते बाल्टी रोटर में ढाल को सेंट्रीफ्यूज करें।
  6. ढाल की परतों फसल और एसडीएस-पेज और Coomasie दाग द्वारा विश्लेषण, परिमाणीकरण densitometry द्वारा किया जा सकता है. पुनर्गठित प्रोटीन को शीर्ष परत पर तैरना चाहिए, जबकि प्रोटीन और लिपिड समुच्चय तल पर या मध्य परत में तलछट करेंगे।

5. थ्रोम्बिन प्रोटीओलिसिस द्वारा पुनर्गठित प्रोटीन के अभिविन्यास का विश्लेषण

नोट: यहां की रिपोर्ट किए गए ए्टलास्टिन निर्माण में एन-टर्मिनल जीएसटी टैग के अंत और एटलास्टिन की शुरुआत के बीच थ्रोम्बिन कट साइट है। सही अभिविन्यास में Atlastin इस कटौती साइट protease के लिए सुलभ होगा, जबकि गलत अभिविन्यास में प्रोटीन लिपिड bilayer द्वारा संरक्षित किया जाएगा.

  1. परख atlastin proteoliposome अभिविन्यास के लिए, ताजा पुनर्गठित proteoliposomes के कम से कम 8 डिग्री सेल्सियस आरक्षित.
  2. प्रोटीओलिपोसोम के 8 डिग्री एल और 1 यू/एल थ्रोम्बिन के 1 डिग्री एल जोड़ें। 1 h के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  3. EDTA मुक्त प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल के 1 $L के साथ प्रोटीज़ को कइन करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. एसडीएस-पेज और Coomasie दाग द्वारा नमूने का विश्लेषण करें. खमीर और अशुद्ध प्रोटीन का अनुपात डेन्सिटोमेट्री द्वारा निर्धारित किया जा सकता है।

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Representative Results

अलैस्टिन पुनर्गठन की दक्षता चित्र 2में प्रस्तुत की गई है। एक iohexol discontinuous ढाल में पुनर्गठित प्रोटीओलिपोसोम जारी किए गए थे। अनिगमित प्रोटीन नीचे की परत (बी) या मध्य परत (एम) में तलछट किया गया था। पुनर्गठित प्रोटीन शीर्ष परत (टी) के लिए तैरता होगा। ढाल के नमूने काटा और एसडीएस-पेज और Coomasie धुंधला द्वारा विश्लेषण किया गया. डेन्सिटोमेट्री द्वारा जेल की परिमाणीकरण नगण्य हार के साथ पुनर्गठन की एक बहुत ही उच्च दक्षता से पता चलता है; कुल प्रोटीन का 96% प्रोटीओलिपोसोम के रूप में पाया गया जो शीर्ष परत (टी) में तैरता था। प्रोटीन का 1% से कम unreconstituted था और मध्य परत (एम) में पाया जाता है, और केवल 3% unreconstituted या एकत्रित और नीचे परत (बी) के लिए तलछट था.

पुनर्गठन की सीमा का वर्णन करने के अलावा, पुनर्गठन के बाद atlastin के उन्मुखीकरण का विश्लेषण थ्रोम्बिन दरार assays14द्वारा परिमाणित किया गया था. पुनर्गठित प्रोटीन संभवतः गलत अभिविन्यास में हो सकता है, कि है, liposome के lumenal अंतरिक्ष का सामना करना पड़. गलत अभिविन्यास में प्रोटीन लिपिड bilayer द्वारा प्रोटीओलिसिस से संरक्षित किया जाना चाहिए. एक थ्रोम्बिन क्लीवेज साइट एन-टर्मिनल GST टैग के अंत और atlastin की शुरुआत के बीच कोडित है। फ्लोटेड प्रोटीओलिपोसोम को 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए थ्रोम्बिन के साथ इनक्यूबेट किया गया था, जिसके बाद EDTA-मुक्त प्रोटीज़ अवरोधक के साथ 30 मिनट की निष्क्रियता हुई थी। नमूने एसडीएस-पेज और कॉमसी दाग द्वारा विश्लेषण किए गए और डेन्सिटोमेट्री चित्र 3द्वारा मात्रा निर्धारित किए गए थे। एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, अनुपचारित प्रोटीओलिपोसोम का एक नमूना बाईं लेन में दिखाया गया है। डिटर्जेंट solubilized proteoliposomes (दाएं लेन) एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा की और थ्रोम्बिन दरार की हद तक दिखाने के लिए, केवल 1% के साथ छोड़ दिया संयुक्त राष्ट्र छोड़ दिया. सभी में, इस परख से पता चलता है कि पुनर्गठित प्रोटीन के अधिकांश केवल 7% protease (मध्य लेन) से संरक्षित किया जा रहा है के साथ cleaved था. यह ध्यान देने योग्य है कि बिना खतना के प्रोटीन के शेष पुनर्गठन प्रोटीन समुच्चय है कि कटौती साइट सुलभ नहीं हो सकता है का एक परिणाम हो सकता है लायक है. सभी में, इन परिणामों atlastin पुनर्गठन के लिए एक मजबूत प्रणाली का वर्णन.

गतिकी और अट्टन-मध्यस्थ प्रोटीओलिपोसम संलयन की सीमा का लिपिड मिश्रण परख द्वारा विश्लेषण किया गया (चित्र 1)। अलैस्टिन संलयन गतिकी और परिमाणीकरण का एक नमूना चित्र 4में दर्शाया गया है। पूर्ण गतिज रन चित्र 4कमें दर्शाया गया है। शून्य समय बिंदु पर जीटीपी के साथ संलयन को प्रेरित करने से पहले 5 मिनट का ऊष्मायन किया गया था और 1 ज के बाद, n-Dodecyl --D-maltoside को प्रोटीओलिपोसोम को विलेयित करने और अधिकतम FRET रिलीज़ करने के लिए जोड़ा गया था। इस भाग में संलयन अधिकतम 11% अधिकतम फ्लोरोसेंट था (चित्र 4ठ, ब्) । अप्रेरित (कोई GTP) नियंत्रण पृष्ठभूमि आधार रेखा निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।

Figure 1
चित्र ााााः ाााा् । फ्लोरोसेंट टैग फ्लोरोसेंट दाता लिपिड NBD-फॉस्फेटिडेलेथेनोलामाइन के साथ लेबल liposomes की एक आबादी NBD-phosphatidylethanolamine (हरी क्षेत्रों के रूप में प्रतिनिधित्व) और acceptor rhodamine- फॉस्फेटिलेथेनोलामाइन (लाल गोले के रूप में प्रतिनिधित्व) एक unlabeled के साथ मिलाया जाता है लिपोसोम का पूल। संलयन से पहले, एनबीडी का फ्लोरोसेंट स्वीकारकर्ता फ्लोरोफोर, रोडामाइन के साथ निकटता के कारण कम है। unlabeled liposomes के साथ संलयन पर एक सतह क्षेत्र में वृद्धि जांच के कमजोर पड़ने की ओर जाता है और NBD के एक FRET रिलीज मापा जा सकता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: पुनर्गठन दक्षता फ्लोटेशन परख द्वारा विश्लेषण किया। ऐलेस्टिन की पुनर्गठन दक्षता को एक आयोहेक्सोल विच्छिन्न प्रवणता में प्रोटीओलिपोसोम के फ्लोटेशन द्वारा मापा जा सकता है। पुनर्गठित प्रोटीन को शीर्ष परत (टी) के लिए प्रोटीओलिपोसोम के रूप में तैरना चाहिए, जबकि असंगठत और एकत्रित प्रोटीन को नीचे की परत (बी) या मध्य परत (एम) में तलछट करना चाहिए। एक Coomasie-सना हुआ एसडीएस-पेज जेल densitometry द्वारा परिमाणित किया गया था और नगण्य खो देता है के साथ proteoliposomes के रूप में मंगाया कुल प्रोटीन का 96% मापा ($4%).

Figure 3
चित्र 3: प्रोटीओलिपोसोम में प्रोटीओलिपोसोम में पुनर्गठित एस्टिन का विश्लेषण प्रोटीज़ पाचन द्वारा। रिकॉमबिनेंट एटलास्टिन में एन-टर्मिनल GST टैग है जिसके बाद थ्रोम्बिन कट अनुक्रम है। रिकॉमबिनेंट एटलास्टिन के प्रोटीओलिपोसोम को लिपिड बाइलेयर के संबंध में पुनर्गठित प्रोटीन के अभिविन्यास का विश्लेषण करने के लिए सेरीन प्रोटीज़ थ्रोम्बिन के साथ इलाज किया गया। थ्रोम्बिन उपचार के बाद प्रोटीज़ बाधित होता है और नमूनों का विश्लेषण एसडीएस-पेज, कोमासी दाग, और डेन्सीटोमेट्री द्वारा निर्धारित किया जाता है। प्रस्तुत प्रोटीओलिपोसोम में संरक्षित प्रोटीन का कम अनुपात होता है, जिसमें केवल 4% ही अपाच्य (मध्य लेन) रहते हैं। एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कुछ proteoliposomes डिटर्जेंट (0.5% TX100) (सही लेन) के साथ solubilized थे; नकारात्मक नियंत्रण, अनुपचारित प्रोटीओलिपोसोम, (बाएं लेन) को बंद नहीं किया गया था।

Figure 4
चित्र4: लिपिड मिश्रण atlastin proteoliposomes के परख. (क) 0 मि पर जी.टी.पी. के साथ संलयन को प्रेरित करने से पहले 5 मिनट ऊष्मायन समय के साथ संलयन अभिक्रिया का नमूना गतिज पता लगाना। 1 ज रन के बाद, डिटर्जेंट solubilization (काला तीर) NBD की अधिकतम FRET रिलीज निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. () समय बिंदु 0 से 1 ज के साथ और (ब्) औसत संलयन (द ] 3 ) 11ण्3% के ट्रेस को ध्यान में रखते हुए ज़ूम किया गया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहाँ तरीकों शुद्ध करने के लिए एक कुशल विधि वर्णन, पुनर्गठन, और रिकॉमबिनेंट atlastin के संलयन गतिविधि को मापने. कार्यात्मक atlastin की उच्च पैदावार सुनिश्चित करने के लिए कुछ महत्वपूर्ण कदम पर विचार किया जाना चाहिए. एलेस्टिन की अभिव्यक्ति कम तापमान (16 डिग्री सेल्सियस) पर की जानी चाहिए ताकि एकत्रीकरण से बचा जा सके और एक का लक्ष्य 0ण्4-1.5 मिलीग्राम/एमएल के बीच अंतिम सांद्रता का लक्ष्य होना चाहिए। बहुत पतला प्रोटीन लिपिड अनुपात के लिए एक 1:400 प्रोटीन पर बेहतर पुनर्गठन नहीं किया जाएगा. पुनर्गठन दक्षता का वैकल्पिक रूप से विश्लेषण किया जा सकता है , यहाँ वर्णित फ्लोटेशन परख द्वारा (चित्र 2)। लिपोसोम फ्लोटेशन परख के लाभों में से एक यह है कि उन्हें घुलनशील प्रोटीनों का विश्लेषण करने के लिए बढ़ाया जा सकता है जो लिपिड बाइलेयर्स13के साथ संबद्ध होते हैं . इसके अतिरिक्त, पुनर्गठित प्रोटीन के अभिविन्यास का विश्लेषण प्रोटीज़ पाचन14द्वारा भी किया जा सकता है, हालांकि, यह गलत अभिविन्यास या पुनर्गठित प्रोटीन या गलत अभिविन्यास में पुनर्गठित misfolded या एकत्रित प्रोटीन या पुनर्गठन के बीच अंतर नहीं हो सकता है (चित्र 3 ). इस विधि द्वारा विकसित प्रोटीओलिपोसोम को संलयन के लिए परख के लिए या एक मॉडल लिपिड द्विपरत में एटलस्टिन के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है। जबकि पुनर्गठन प्रक्रिया अपेक्षाकृत सरल है, इष्टतम डिटर्जेंट और लिपिड सांद्रता से छोटे विचलन पुनर्गठन की क्षमता को कम कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, डिटर्जेंट की अत्यधिक मात्रा liposome solubilization के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.

लिपिड मिश्रण परखदाता और स्वीकारकर्ता liposomes के एक पूल की आवश्यकता है (चित्र 1) . इस विधि हर कदम पर लिपिड एकाग्रता के परिमाणीकरण के लिए tritiated लिपिड द्वारा रेडियोधर्मिता का उपयोग करता है. तथापि, दाता लिपोसोम के आंतरिक फ्लोरोसेंट और डैन्सिल-फॉस्फोएथेनोलैमिन15,16के साथ स्वीकारकर्ता लिपोसोम का उपयोग करते हुए वैकल्पिक परिमाणीकरण विधियों की सूचना दी गई है। liposomes के आकार भी बाहर निकालना के दौरान संशोधित किया जा सकता है, के रूप में polycarbonate झिल्ली छिद्र आकार तदनुसार समायोजित किया जा सकता है.

जबकि लिपिड मिश्रण परख संलयन का विश्लेषण करने के लिए एक कुशल तरीका है, यह संलयन और अर्धभ्रम के बीच अंतर नहीं हो सकता है. अनेक अध्ययन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा संलयन के बाद एस्टिटिन प्रोटीओलिपोसोम पर विज़ुअलाइज़ िंग तथा लिपिड फ्लोरोसेंट16, 17 आगे एस्टेस्टिन के पूर्ण संलयन का समर्थन करते हैं। हालांकि, विशिष्ट atlastin म्यूटेंट या अन्य संलयन प्रोटीन का विश्लेषण करते समय, यह पूर्ण संलयन सुनिश्चित करने के लिए ब्याज की है। इस समस्या का निवारण करने के लिए अतिरिक्त कदम dithionite के साथ बाहरी पत्रक बुझाने और आंतरिक पत्रक लिपिड मिश्रण को मापने के द्वारा किया जा सकता है. वैकल्पिक संलयन परख, इस तरह के आंतरिक जलीय सामग्री मिश्रण के रूप में इस के लिए नियोजित किया जा सकता है, तथापि, अतिरिक्त कदम और liposomes के डायलिसिस आवश्यक हो जाएगा.

यह ब्याज की है कि इस विधि मॉडल लिपिड bilayers में प्रोटीन के इन विट्रो अध्ययन में अन्य झिल्ली प्रोटीन के लिए लागू किया जा सकता है. अन्य झिल्ली प्रोटीन इस विधि16,17के साथ पुनर्गठन करने के लिए सूचित किया गया है . इस विधि इसलिए झिल्ली और संलयन प्रोटीन की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम अपनी अंतर्दृष्टि और atlastin संबंधित परियोजनाओं पर प्रतिक्रिया के लिए डॉ माइकल स्टर्न और उनकी प्रयोगशाला धन्यवाद. यह काम राष्ट्रीय सामान्य चिकित्सा विज्ञान संस्थान [R01GM101377] और राष्ट्रीय न्यूरोलॉजिकल विकार और स्ट्रोक संस्थान [R01NS102676] द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL poly-prep chromatography columns Biored 731-1550
10 mm x 75 mm Flint glass tubes VWR 608225-402
47 mm diameter, 0.45 μm pore whatman sterile membrane filters Whatman 7141 104
96 well white plate NUNC 437796
Anapoe X-100 Anatrace 9002-931-1
Cell disrupter Avestin Avestin Emulsiflex C3
DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt)) Avanti 840035P-10mg DOPS
EDTA Research organics inc. 6381-92-6 Ethylenediaminetetraacetic acid
EDTA-free protease inhibitor cocktail Roche 11873580001 Complete protease inhibitor
Extruder Sigma Aldrich Z373400  Liposofast Basic Extruder
GE Akta Prime liquid chromatography system GE Pharmacia 8149-30-0006
Glutathione agarose beads Sigma aldrich G4510-50ml
Glycerol EMD GX0185-5
GTP Sigma Aldrich 36051-31-7 Guanosine 5' triphosphate sodium salt hydrate
HEPES, acid free Omnipur 5330
Imidazole fluka 5670
Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resin column GE Healthcare 17040801 1 mL HiTrap Chelating HP immobilized metal affinity chromatography columns
Iohexol Accurate chemical and scientific corporation AN 7050 BLK Accudenz/Nycodenz
IPTG Research products international corp. I56000-100.0 IPTG, dioxane free
L-Glutathione reduced Sigma-Aldrich G4251-5g
Magnesium chloride Fisher 7791-18-6
Methanol Omnisolv MX0488-1
NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt)) Avanti 236495 NBD-DPPE
n-Dodecyl β-D-maltoside Chem-Impex International 21950
Nonpolar polystyrene adsorbent beads BioRad 152-3920 SM2 Biobeads
Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 μm pore membrane Whatman 800309
Optima LE80K Ultra centrifuge Beckman Coulter
Phosphatidylcholine, L-α-dipalmitoyl [choline methyl-3H] ARC ART0284 Titriated lipids
Plate reader TECAN TECAN infinite M200 plate reader
POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) Avanti 850457C-25mg POPC
Potassium chloride MP 151944
Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)) Avanti 236495 Rh-DPPE
Scintillation Cocktail National Diagnostics LS-272 Ecoscint XR Scintillation solution for aqueous or non-aqueous samples
Scintillation vials Beckman 592928 Fast turn cap Mini Poly-Q Vial
Thrombin Sigma T1063-1kU Thrombin from human plasma
Triton X-100 Fisher BP151-500
Ultra-clear centrifuge tubes 5 mm x 41 mm Beckman 344090
Vortex 9 to 13 mm Tube Holder VWR 58816-138 Insert for vortexing flint glass tubes
Vortex Insert Retainer VWR 58816-132 Retainer needed for vortex tube holder
Vortexer VWR 2.235074 Vortex Genie 2 model G560
β-mercaptoethanol molecular biology grade Calbiochem 444203

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