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July 03, 2019
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यहां विस्तृत पुनर्गठन और संलयन प्रोटोकॉल फ्यूजन प्रोटीन द्वारा एक मॉडल लिपिड बाइलेयर और लिपिड मिश्रण में झिल्ली-बाध्य प्रोटीन का अध्ययन करने का एक कुशल तरीका है। यहां हम एक डिटर्जेंट-असिस्टेड रिकॉम्बिनेंट ड्रोसोफिला एटलास्टिन, एक ईआर फ्यूजन प्रोटीन, प्रीफॉर्मेड फॉस्फेटिलकोलिन लिपोसोम्स में एक डिटर्जेंट-असिस्टेड रिसेप्स्ट्रेयशन का वर्णन करते हैं । एटलास्टिन प्रोटेओलिपोसोम का फ्यूजन तब एक FRET-आधारित लिपिड-मिश्रण परख द्वारा मापा जाता है।
डिटर्जेंट-असिस्टेड रिएग्शन के प्रमुख फायदों में से एक यह है कि डिटर्जेंट में प्रोटीन सूखने या सॉल्वैंट्स के संपर्क में नहीं आता है । हम यहां यह भी दिखाते हैं कि एटास्टिन का पुनर्गठन अभिविन्यास बहुत कुशल है । FRET आधारित लिपिड मिश्रण परख का एक और लाभ यह है कि लिपोसोम्स को किसी भी डाई के साथ लोड करने की आवश्यकता नहीं है, और किसी भी अतिरिक्त डायलिस चरणों की कोई आवश्यकता नहीं है।
इस प्रक्रिया को शुरू करने के लिए, क्लोरोफॉर्म में लिपिड मिक्स स्टॉक तैयार करें, जैसा कि टेक्स्ट प्रोटोकॉल में उल्लिखित है। लिपिड घोला जा सकता है करने के लिए DPPC के मिलीलीटर प्रति एक microcurie जोड़ें, इस शेयर के कम से कम आठ माइक्रोलीटर आरक्षित करने के लिए सुनिश्चित कर रही है । लिपिड की वांछित मात्रा को चकमक ग्लास ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
फिर लिपिड को लगभग 10 मिनट तक नाइट्रोजन गैस की कोमल धारा के नीचे घोला जा सकता है जब तक कि कोई और क्लोरोफॉर्म दिखाई न दे। 30 मिनट के लिए वैक्यूमिंग द्वारा एक desiccator में आगे जिसके परिणामस्वरूप लिपिड फिल्म सूखी । इसके बाद, एकाग्रता को 10 मिलीमोलर में वापस लाने के लिए लिपिड फिल्म में 10% ग्लाइसेरोल, दो-मिलीमोलर 2-मर्केप्टोथेनॉल, और एक-मिलीमोलर ईडीटीए के साथ पर्याप्त A100 जोड़ें।
कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए हल्के से भंवर द्वारा लिपिड फिल्म को फिर से खर्च करें। तरल नाइट्रोजन में हाइड्रेटेड लिपिड को फ्रीज करें। लिपोसोम्स को पिघलाने के लिए, समाधान को 30 सेकंड के लिए कमरे के तापमान पर बैठने दें, फिर उन्हें तेजी से विगलन के लिए पानी में वापस स्थानांतरित करें।
इस फ्रीज-गल चक्र को कुल 10 बार दोहराएं। इसके बाद, पॉली कार्बोनेट फिल्टर के माध्यम से लिपिड को पास करने के लिए एक मिनी-एक्सट्रूडर का उपयोग करें, जिसमें 100 नैनोमीटर का पोर आकार 19 गुना है। लिपोसोम्स की कुल लिपिड एकाग्रता निर्धारित करने के लिए, लिपिड स्टॉक के चार माइक्रोलीटर जोड़ें और तीन मिलीलीटर प्रस्फुटित कॉकटेल में लाइसोसोम्स जोड़ें।
स्टॉक और लिपोसोम्स के लिए प्रति मिनट औसत गिनती को मापें, और पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित लिपोसोम एकाग्रता की गणना करें। एक सप्ताह तक के लिए लिपोसोम्स को चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। सबसे पहले, पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित 0.5 मिलीलीटर ट्यूब में बफर, अतिरिक्त डिटर्जेंट और प्रोटीन की उचित मात्रा मिलाएं।
तेजी से लिपोसोम्स जोड़ें, और मिश्रण को समरूप बनाने के लिए तुरंत पांच सेकंड के लिए भंवर। एक नटेटर में प्रतिक्रिया को एक घंटे के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इस इनक्यूबेशन के दौरान, 0.2 ग्राम पॉलीस्टीरिन एसोर्बेंट मोतियों का वजन करें और उन्हें एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
ट्यूब में मेथनॉल का एक मिलीलीटर जोड़ें, और मोतियों को डग करने के लिए एक मिनट के लिए मिलाएं। फिर, 21 गेज या उच्च सुई के साथ मेथनॉल को एस्पिरेट करें। मोतियों को धोना शुरू करने के लिए, उनमें पानी डालें।
मोतियों को पांच मिनट के लिए पानी के साथ मिलाएं, फिर पानी को एस्पिरेट करें। इस पानी को धोने की प्रक्रिया को चार बार दोहराएं। इसके बाद, पॉलीस्टीरिन एसोर्बेंट मनका घोल को एक मिलीलीटर की मात्रा में लाने के लिए पानी जोड़ें, जिसमें 0.2 ग्राम प्रति मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता है।
पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित प्रत्येक नमूने में सभी डिटर्जेंट को सोखने के लिए आवश्यक पॉलीस्टीरिन एसोर्बेंट मोतियों की मात्रा की गणना करें। मनका घोल इकट्ठा करने के लिए एक पिपेट टिप काटें। मनका घोल की गणना की गई मात्रा को 0.5 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें, और पानी को एस्पिरेट करें।
मोतियों वाली ट्यूब में नमूनों को जोड़ें, और एक घंटे के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर एक नटेटर में इनक्यूबेट करें। नमूनों को नए मोतियों वाली एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरित करें, जिससे पुराने मोतियों को पीछे छोड़ना सुनिश्चित हो। एक ही शर्तों का उपयोग कर फिर से इनक्यूबेट।
मोतियों को दो बार स्थानांतरित करने और इनक्यूबेटिंग करने की इस प्रक्रिया को दोहराएं। इसके बाद, नमूना को ताजा मोतियों वाली एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें और रात भर चार डिग्री सेल्सियस पर नीरस करके इनक्यूबेट करें। अगले दिन, अघुलनशील प्रोटीन समुच्चय को गोली मारने के लिए 16, 000 बार जी और चार डिग्री सेल्सियस पर मोतियों और अपकेंद्रित्र से नमूना निकालें।
सुपरनेट को ठीक करें, और पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित तरल प्रस्फुटन गिनती द्वारा अंतिम लिपिड एकाग्रता निर्धारित करें। शुरू करने के लिए, ग्लिसेरोल, बीटा-मर्केप्टोथेन, ईडीटीए और मैग्नीशियम क्लोराइड युक्त A100 में दाता और स्वीकार्य प्रोटेओपोलिपोम्स को 0.15 मिलीमोलर प्रत्येक की एकाग्रता में लाएं। फ्लोरेसेंस रीडिंग के लिए उपयुक्त फ्लैट 96-वेल प्लेट में प्रत्येक प्रतिक्रिया को स्थानांतरित करें, जिससे कम से कम चार प्रतिक्रियाएं तैयार करना सुनिश्चित करें, जिसमें एक ट्रिपलिकेट और नो-जीटीपी नकारात्मक नियंत्रण शामिल है।
थाली को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पूर्व गरम प्लेट रीडर में रखें। एनबीडी फ्लोरेसेंस को हर मिनट पांच मिनट के लिए मापें। फिर, फ्यूजन को प्रेरित करने के लिए पांच मिलीमोलर जीटीपी जोड़ें।
पहले की तरह एक ही उत्तेजन और उत्सर्जन का उपयोग कर एक घंटे के लिए हर मिनट NBD फ्लोरेसेंस उपाय । इसके बाद, प्रोटियोलपोसोम्स को भंग करने के लिए कुओं में 2.5% एन-डोडेसिल बीटा-डी-माल्टोसाइड के पांच माइक्रोलीटर जोड़ें, और उसी उत्तेजन और उत्सर्जन का उपयोग करके 15 मिनट के लिए हर मिनट अधिकतम एनबीडी फ्लोरेसेंस को मापें। इस अध्ययन में, पुनर्संयोजन ड्रोसोफिला एटलास्टिन को शुद्ध किया जाता है और पूर्व सूचित लिपोसोम्स में पुनर्गठित किया जाता है।
एटलास्टिन पुनर्गठन की दक्षता एक इओएक्सोल असतत ढाल में फ्लोटिंग पुनर्गठित प्रोटेओलिपोसोम द्वारा निर्धारित की जाती है। शीर्ष, मध्य, और नीचे ढाल परतों के नमूनों को काटा जाता है और एसडीएस-पेज और कूमासी धुंधला द्वारा विश्लेषण किया जाता है। घनत्व द्वारा जेल का मात्राकरण नगण्य खो देता है के साथ पुनर्गठन की एक बहुत ही उच्च दक्षता से पता चलता है, कुल प्रोटीन का 96% के साथ प्रोटियोलिपोमोस के रूप में पाया जा रहा है जो शीर्ष परत पर तैरता है।
1% से कम प्रोटीन अप्रतिबंधित है और मध्य परत में पाया जाता है, और केवल 3% अप्रतिबंधित या एकत्रित और नीचे की परत के लिए तलछट है । पुनर्गठन के बाद एटास्टिन के अभिविन्यास को थ्रोम्बिन क्लीवेज परख द्वारा निर्धारित किया जाता है। नमूनों का विश्लेषण एसडीएस-पेज और कूमासी स्टेनिंग और घनत्व से निर्धारित किया जाता है।
अधिकांश पुनर्गठित प्रोटीन क्लीव्ड होता है, जिसमें केवल 7% प्रोटीज से सुरक्षित होते हैं। काइनेटिक्स और एटलास्टिन-मध्यस्थता प्रोटेओलिपोसोम फ्यूजन की सीमा लिपिड-मिश्रण परख द्वारा विश्लेषण किया जाता है। शून्य समय बिंदु पर जीटीपी के साथ संलयन को प्रेरित करने से पहले पांच मिनट का इनक्यूबेशन किया जाता है।
एक घंटे के बाद, एन-डोडेसिल बीटा-डी-माल्टोसाइड को प्रोटियोलिपोसोम को घुलनशील करने और अधिकतम फ्लोरोसेंट प्रतिध्वनि हस्तांतरण रिलीज प्राप्त करने के लिए जोड़ा गया। रन में फ्यूजन मैक्सिमम में अधिकतम फ्लोरेसेंस का 11% हिस्सा देखा जाता है। लिपिड क्लोरोफॉर्म में घुल जाते हैं।
लिपिड घोला जा सकता है तैयार करते समय, किसी भी वाष्पीकरण से बचने के लिए, एक रासायनिक हुड पर, और बर्फ पर ऐसा करना सुनिश्चित करें। लिपोसोम आकार और आकार पर झिल्ली लंगर के प्रभावों की कल्पना करने के लिए माइक्रोस्कोपी द्वारा एटास्टिन प्रोटियोलिपोसोम का विश्लेषण करना संभव है। इस विधि को अन्य झिल्ली-लंगरित प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए बढ़ाया गया है और मॉडल लिपिड बाइलेयर में कैसे व्यवहार किया जाता है।
यह प्रोटोकॉल लिपिड मिक्स को मात्रा देने के लिए टिटैरेटेड लिपिड का उपयोग करता है। रेडियोधर्मी सामग्री के साथ काम करते समय आवश्यक सावधानियां बरतना सुनिश्चित करें।
जैविक झिल्ली संलयन विशेष संलयन प्रोटीन द्वारा उत्प्रेरित है। प्रोटीन के fusogenic गुणों को मापने लिपिड मिश्रण परख द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. हम पुनः संयोजक Drosophila atlastin, एक प्रोटीन है कि ईआर के homotypic संलयन मध्यस्थता, यह preformed liposomes के लिए पुनर्गठन, और संलयन क्षमता के लिए परीक्षण के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं.
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Betancourt-Solis, M. A., McNew, J. A. Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays. J. Vis. Exp. (149), e59867, doi:10.3791/59867 (2019).
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