Journal
/
/
Vaskemiddel-assistert rekonstituering av rekombinant Drosophila Atlastin til liposomer for lipid-miksing analyser
JoVE Journal
Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.  Sign in or start your free trial.
JoVE Journal Biochemistry
Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Vaskemiddel-assistert rekonstituering av rekombinant Drosophila Atlastin til liposomer for lipid-miksing analyser

7,556 Views

08:43 min

July 03, 2019

DOI:

08:43 min
July 03, 2019

7 Views
,

Transcript

Automatically generated

Rekonstituerings- og fusjonsprotokollen som er beskrevet her, er en effektiv måte å studere membranbundne proteiner på i en modell lipid bilayer og lipidblanding ved fusjonsproteiner. Her beskriver vi et vaskemiddelassistert rekonstituering av rekombinant Drosophila atlastin, et ER fusjonsprotein, til forhåndsformede fosfatidylkolinleosomer. Fusjon av atlastinprooliposomer måles deretter ved en FRET-basert lipidblandingsanalyse.

En av de viktigste fordelene med vaskemiddelassistert rekonstituering er at proteinet i vaskemiddel ikke utsettes for tørking eller løsemidler. Vi viser også her at rekonstitueringsorientering av atlastin er svært effektiv. En annen fordel med den FRET-baserte lipidblandingsanalysen er at liposomer ikke trenger å lastes med fargestoff, og det er ikke behov for noen ekstra dialyser trinn.

For å begynne denne prosedyren, forberede lipid blanding lagrene i kloroform, som beskrevet i tekstprotokollen. Legg til en mikrokurie per milliliter DPPC til lipidblandingene, og sørg for å reservere minst åtte mikroliter av denne aksjen. Overfør ønsket mengde lipidblandinger til flintglassrør.

Tørk deretter lipidblandingene under en mild strøm av nitrogengass i ca. 10 minutter til ikke mer kloroform er synlig. Tørk den resulterende lipidfilmen ytterligere i en desiccator ved å støvsuge i 30 minutter. Etter dette, legg nok A100 med 10% glyserol, to-millimolar 2-mercaptoetanol, og en millimolar EDTA til lipidfilmen for å bringe konsentrasjonen tilbake til 10 millimolar.

Resuspend lipidfilmen ved å virvle lett i 15 minutter ved romtemperatur. Frys de hydrerte lipidene i flytende nitrogen. For å tine liposomer, la løsningen sitte ved romtemperatur i 30 sekunder, og overfør dem deretter tilbake til vann for raskere tining.

Gjenta denne fryse-tine syklus totalt 10 ganger. Etter dette, bruk en mini-ekstruder for å passere lipidene gjennom polykarbonatfiltre, med en porestørrelse på 100 nanometer, 19 ganger. For å bestemme den totale lipidkonsentrasjonen av liposomer, legg til fire mikroliter lipidlager og lysosomer til tre milliliter scintillation cocktail.

Mål gjennomsnittlig antall per minutt for lager og liposomer, og beregn liposometkonsentrasjonen, som beskrevet i tekstprotokollen. Oppbevar liposomer på fire grader Celsius i opptil en uke. Bland først riktig mengde buffer, ekstra vaskemiddel og protein i et 0,5-milliliter rør, som beskrevet i tekstprotokollen.

Tilsett liposomer raskt, og virvle umiddelbart i fem sekunder for å homogenisere blandingen. Inkuber reaksjonen i en nutator ved fire grader Celsius i en time. Under denne inkubasjonen, vei ut 0,2 gram polystyren adsorbent perler og overføre dem til et mikrocentrifuge rør.

Tilsett en milliliter metanol til røret, og bland i ett minutt for å degas perlene. Deretter aspirerer metanol med en 21-gauge eller høyere nål. For å begynne å vaske perlene, legg til vann til dem.

La perlene blandes med vannet i fem minutter, og aspirer deretter vannet. Gjenta denne vannvaskeprosessen fire ganger. Etter dette, tilsett vann for å bringe polystyren adsorbent perle slurry til et volum på en milliliter, med en endelig konsentrasjon på 0,2 gram per milliliter.

Beregn mengden polystyren adsorbent perler som trengs for å adsorbere alt vaskemiddelet i hvert utvalg, som beskrevet i tekstprotokollen. Klipp en pipettespiss for å samle perleslamen. Overfør den beregnede mengden perleslam til et 0, 5-milliliter rør, og aspirer vannet.

Legg prøvene til røret som inneholder perlene, og inkuber i en nutator ved fire grader Celsius i en time. Overfør prøvene til et friskt rør som inneholder nye perler, og sørg for å forlate de gamle perlene bak. Inkuber igjen ved hjelp av de samme forholdene.

Gjenta denne prosessen med å overføre og inkubere perlene to ganger. Etter dette, overfør prøven til et nytt rør som inneholder friske perler og inkubere ved å nutating over natten på fire grader Celsius. Neste dag fjerner du prøven fra perlene og sentrifugen ved 16 000 ganger g og fire grader Celsius i 10 minutter for å pellet de uoppløselige proteinaggregatene.

Gjenopprett det overnaturlige, og bestem den endelige lipidkonsentrasjonen ved flytende scintillasjonstelling, som beskrevet i tekstprotokollen. Til å begynne med, bringe donor og acceptor proteoliposomer til en konsentrasjon på 0,15 millimolar hver i A100 inneholder glyserol, beta-mercaptoetanol, EDTA, og magnesiumklorid. Overfør hver reaksjon til en brønn i en flat 96-brønnsplate egnet for fluorescenslesing, og sørg for å forberede minst fire reaksjoner, inkludert en triplikate og en ikke-GTP negativ kontroll.

Plasser platen i en forvarmet plateleser ved 37 grader Celsius. Mål NBD-fluorescensen hvert minutt i fem minutter. Deretter legger du til fem millimolar GTP for å indusere fusjon.

Mål NBD-fluorescensen hvert minutt i én time ved hjelp av samme eksitasjon og utslipp som før. Etter dette legger du til fem mikroliter på 2,5% n-Dodecyl beta-D-maltoside til brønnene for å oppløse proteoliposomene, og måle maksimal NBD-fluorescens hvert minutt i 15 minutter ved hjelp av samme eksitasjon og utslipp. I denne studien blir rekombinant Drosophila atlastin renset og rekonstituert til forhåndsformede liposomer.

Effektiviteten av atlastin rekonstituering bestemmes av flytende rekonstituerte proteoliposomer i en iohexol seponert gradient. Prøver av topp-, mellom- og bunngradientlag høstes og analyseres av SDS-PAGE og Coomassie-farging. Kvantifiseringen av gelen ved densitometri viser en svært høy effektivitet av rekonstituering med ubetydelige tap, med 96% av det totale proteinet som finnes som proteoliposomer som fløt til det øverste laget.

Mindre enn 1% av proteinet er ikke rekonstituert og funnet i det midterste laget, og bare 3% er ukonstituert eller aggregert og sedimentert til bunnlaget. Orienteringen av atlastin etter rekonstituering kvantifiseres av trombinspaltingsanalyser. Prøver analyseres med SDS-PAGE og Coomassie farging og kvantifisert av tettsitometri.

Det meste av det rekonstituerte proteinet er spaltet, med bare 7% beskyttet mot protease. Kinetikken og omfanget av atlastinmediert proteoliposom fusjon analyseres av lipidblandingsanalyser. En inkubasjon på fem minutter utføres før du induserer fusjon med GTP på nulltidspunktet.

Etter en time ble n-Dodecyl beta-D-maltoside lagt til for å løse proteoliposomene og få maksimal fluorescerende resonansoverføringsutgivelse. Fusjonen maksimal i løpet er sett på å være 11% av maksimal fluorescens. Lipider oppløses i kloroform.

Når du forbereder lipidblandingene, sørg for å gjøre dette raskt, på en kjemisk hette og på is for å unngå fordampning. Det er mulig å analysere atlastin proteoliposomer ved mikroskopi for å visualisere effekten av et membrananker på liposometform og størrelse. Denne metoden har blitt utvidet til å studere andre membran-forankret proteiner og hvordan oppfører seg i en modell lipid bilayer.

Denne protokollen bruker titrerte lipider for å kvantifisere lipidblandinger. Sørg for å ta de nødvendige forholdsregler når du arbeider med radioaktive materialer.

Summary

Automatically generated

Biologisk membran fusjon er katalysert av spesialiserte fusjons proteiner. Måle fusogenic egenskaper av proteiner kan oppnås ved lipid miksing analyser. Vi presenterer en metode for rensing av rekombinant Drosophila atlastin, et protein som formidler homotypic fusjon av AKUTTEN, rekonstituering av det til preformed liposomer, og testing for fusjons kapasitet.

Read Article