المجهرية الخلوية التفاعلية للتحقيق في توطين البروتين تحت الخلوي والتغيرات في الخلايا المورفولوجية في البكتيريا

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

توفر هذه المقالة دليل خطوه بخطوه للتحقيق في ديناميات التعريب الخلوية البروتينية ومراقبه التغييرات المورفولوجية باستخدام المجهر عالي الدقة الفلورية في العصي الفرعية والمكورات العنقودية الذهبية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Brzozowski, R. S., White, M. L., Eswara, P. J. Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria. J. Vis. Exp. (153), e59905, doi:10.3791/59905 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وعاده ما يتم اجراء التحقيقات في العوامل التي تؤثر علي انقسام الخلايا وشكل الخلية في البكتيريا بالاقتران مع المجهر الفلوري عالي الدقة حيث ان الملاحظات التي تتم علي مستوي السكان قد لا تعكس حقا ما يحدث علي مستوي خليه واحده. يسمح المجهر الزمني للخلايا الحية للمحققين بمراقبه التغيرات في انقسام الخلايا أو الشكل الخلوي الذي يوفر رؤى قيمه فيما يتعلق بالتوطين دون الخلوي للبروتينات وتوقيت التعبير الجيني ، كما يحدث ، للمساعدة المحتملة في الاجابه علي الاسئله البيولوجية الهامه. هنا ، ونحن وصف البروتوكول لدينا لرصد التغيرات الظاهرية في عصيه سوتيلليس والمكورات العنقودية الذهبية باستخدام المجهر عاليه الدقة تفكيك. والهدف من هذا التقرير هو توفير بروتوكول بسيط وواضح يمكن ان يعتمده المحققون الآخرون المهتمون باجراء تجارب المجهر الفلوري لدراسة العمليات البيولوجية المختلفة في البكتيريا وكذلك الكائنات الحية الأخرى.

Introduction

وقد تم تعزيز مجال بيولوجيا الخلايا البكتيرية بشكل كبير من خلالالتطورات الاخيره في تقنياتالمجهر 1,2. ومن بين الاداات الأخرى ، تظل المجاهر القادرة علي اجراء تجارب المجهر الضوئي المضفية الزمنيه وسيله قيمه. ولذلك فمن غير المستغرب ان المجهر الفلوري لا تزال شعبيه بين علماء البيولوجيا الخلايا الميكروبية. الاضافه إلى إظهار الأنماط الظاهرية النهائية ، فان تقديم معلومات عن كيفيه ظهور الأنماط الظاهرية الملحوظة باستخدام المجهر الزمني يمكن ان يضيف قيمه كبيره إلى النتائج ويحتمل ان يقدم أدله عن العمليات الخلوية التي تستهدفها المرشحات المحتملات للادويه4.

يتم توفير البروتوكولات لاجراء التصوير عاليه الدقة باستخدام الميكانيكية بالبالكامل ، مقلوب ، والمجهر فلوري واسعه المجال (انظر جدول المواد) في هذه المقالة. ويمكن تكييف هذه البروتوكولات لتتناسب مع احتياجات المجاهر الأخرى التي هي قادره علي اجراء المجهر الزمني. علي الرغم من ان البرنامج الذي تمت مناقشته هنا يتوافق مع البرامج المحددة التي توفرها الشركة المصنعة كما هو مبين في جدول المواد، والبرمجيات التي يتم توفيرها عاده من قبل مصنعي المجهر الآخرين أو imagej5المتوفرة بحريه ، لديها أدوات مكافئه لتحليل بيانات المجهر. النسبة للظروف التي لا يكون فيها الزمن الزمني مواتيا ، يمكن اجراء تجارب الدورات الدراسية علي النحو الموصوف في هذه المادة. وتوفر البروتوكولات الموصوفة هنا دليلا مفصلا لدراسة التغيرات في النمط الظاهري في نوعين بكتيريين مختلفين: b. رقيقه و s. الذهبية . انظر الجدول 1 للحصول علي السلالات المستخدمة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-ظروف النمو العامة

  1. تطعيم 2 مل من متوسط النمو المناسب تستكمل مع المضادات الحيوية (عند الاقتضاء) مع مستعمره واحده من سلاله (ق) ان يكون المصابين بالإجهاد. احتضان هذه الثقافات البذور بين عشيه وضحيها في 22 درجه مئوية في حاضنه الاهتزاز.
    ملاحظه: يتم توفير شروط النمو البكتيرية المحددة المستخدمة في هذه المقالة تحت قسم النتائج التمثيلية.
  2. تمييع الثقافات بين عشيه وضحيها 1:20 في وسائل الاعلام الطازجة في قارورة 125 mL ، تكمله مع المضادات الحيوية (عند الاقتضاء).
  3. تنمو الثقافة (ق) في 37 درجه مئوية في حاضنه الاهتزاز حتى منتصف لوغاريتمي المرحلة (OD600 = 0.5).
    ملاحظه: يمكن أضافه المحفز أو المثبط مباشره إلى الثقافة المتنامية (ق) في مرحله النمو المناسبة.
  4. حصاد الخلايا في ظروف الثقافة المطلوبة لاعداد عينه المجهر كما هو موضح في القسم التالي.

2. اعداد العينة

  1. اعداد 1 ٪ اجنشات من خلال الجمع بين 0.25 غرام من البيولوجيا الجزيئية الصف ، وانخفاض فرص الاستخدام ، اجنشا مع اما 25 مل من متوسط النمو تستكمل مع المضادات الحيوية المناسبة (عند الاقتضاء) للحصول علي المجهر الزمني أو المياه المعقمة. سخني الخليط بمساعده الميكروويف لحوالي 30 ثانيه واسكبيه في طبق بيتري معقم 100 ملم × 15 ملم ودعه يصلب.
  2. خذ 5 – 50 μL من ثقافة الخلية اعتمادا علي الحاجة ووصمه عار الخلايا. الخلايا وصمه عار مع الاصباغ المناسبة في هذه المرحلة (علي سبيل المثال ، أضافه صبغه فلورية FM4-64 (غشاء وصمه عار) لتجربه (الشكل 1)).
    1. ماصه ل 5 μl قسامه من عينه الثقافة أو عينه ملطخه ليتم وضعها علي الجزء السفلي من صحن الثقافة أسفل الزجاج 35 mm (مع قطرها 14 مم microwell وغير المصقول رقم 1.5 coverslip ؛ انظر جدول المواد).
      تحذير: لا تستخدم بولي-L-ليسين المغلفة الشفتين خاصه بالنسبة للمجهر الزمني لأنها يمكن ان تحفز نمط النمو المختلفة (لاحظنا هذا مع بولي-D-يسين كذلك ؛ البيانات لم تظهر) و/أو تؤثر ديناميات البروتين6.
    2. للتقليل من استخدام الاصباغ ، وصمه عار 3-4 μl تعليق الخلية (تحصد في OD600 = 0.5 ؛ تقريبا 2.7 x 107 و 3.4 x 107 ل b. رقيقه و s. الذهبية علي التوالي لكل 1 مل الثقافة) مباشره علي الطبق السفلي الزجاج.
    3. ضع بلاطه سابقه القطع (قطرها 11 ملم أو اي حجم مرغوب فيه لتتداخل مع منطقه المشبك ؛ اقطع باستخدام الطرف المفتوح لأنبوب معقم أو شفره حلاقه) فوق العينة واضغط برفق للتاكد من ان البلاطة التي نشات مستلقية علي السطح المسطح ضد المشبك.
  3. بعد التصوير (انظر القسم التالي) ، إذا كان عدد الخلايا في مجال العرض غير مرغوب فيه ، اضبط كثافة الخلايا في العينة عن طريق التخفيف أو التركيز بواسطة طرد وتغيير نسبه الخلايا في العينة باستخدام متوسط النمو/المخزن المؤقت حسب الضرورة.
    ملاحظه: لتصغير الفلورية المنبثقة من وسط الثقافة ، يمكن غسل الخلايا في المخزن المؤقت (علي سبيل المثال في المحلول الملحي 1x القياسية الفوسفات) وأعاده تعليق في كميه مناسبه من المخزن المؤقت قبل التصوير. فمن الممكن ان في هذه الخطوة أصغر الخلايا أو الحويصلات قد لا يتم الاحتفاظ بها بعد طرد التالي سوف تضيع.
  4. أضافه الماء باستخدام ماصه (~ 5 μL قطرات) إلى الفضاء داخل طبق الثقافة (حول coverslip) لمنع الوسادة اجبرز من التجفيف ، والمساعدة في الحفاظ علي الرطوبة اثناء اكتساب الصورة ، وخاصه بالنسبة للتجارب الزمنيه.
  5. السماح للاطباق الثقافية لتتوازن إلى درجه الحرارة داخل غرفه الحضانة ، والمدمج في مقصوره معتمة المقدمة من قبل الشركة المصنعة ، من المجهر لمده 15-20 دقيقه.
    ملاحظه: بدوره علي عنصر التسخين وتعيين غرفه الحضانة إلى درجه الحرارة المطلوبة عده ساعات قبل التصوير. وهذا سيضمن استقرار الاجهزه إلى درجه الحرارة الجديدة. لمده طويلة التصوير المتتابع ، وضع الكاس أو قارورة مع الماء داخل غرفه المجهر ، بعيدا عن منطقه العمل ، للحفاظ علي الرطوبة.

3-التصوير

  1. في يوم التجربة ، قم بتشغيل نظام المجهر. بدء تشغيل برنامج التصوير (راجع جدول المواد) بالنقر فوق الرمز المناسب علي سطح المكتب. تهيئه المجهر عن طريق النقر علي تهيئه المجهر الخيار (زر يصور مع المجهر علي ذلك) في مربع الحوار بدء تشغيل البرنامج. تاكد من خفض الهدف بالبالكامل باستخدام المعايرة الخشنة المجهر قبل التهيئة.
    ملاحظه: التالية تهيئه ثلاثه مربعات حوار اضافيه يجب ان تظهر بالاضافه إلى القائمة أبدا: resolve3D وجمع البيانات وجهاز عرض عامل التصفية.
  2. ضع قطره من 1.517 (مؤشر الانكسار) النفط علي الهدف الغمر النفط 100x المقدمة من قبل الشركة المصنعة (الفتحة العددية = 1.4 ، مسافة العمل = 0.12 مم ؛ انظر جدول المواد).
    ملاحظه: من المهم اختيار زيت الغمر المناسب لدرجه الحرارة التي يتم فيها اجراء التصوير.
  3. تحميل الطبق السفلي الزجاج الذي يحتوي علي عينه في السكن المعدني (نعش) وتنزلق برفق إلى المشبك المرحلة.
  4. استخدام مقبض التعديل الخشن لرفع الهدف حتى النفط يجعل الاتصال مع الجزء السفلي من الزجاج من الطبق. استخدام قطعه العين ومقبض التعديل غرامه لجعل العينة في التركيز. بمجرد ان الخلايا في التركيز بدوره مقبض الباب من قطعه العين إلى وضع الكاميرا عن طريق تحريك مفتاح محدد يقع علي الجزء الامامي من الجسم المجهر إلى اليسار.
  5. أبدا التجربة باستخدام برنامج التصوير. في النافذة resolve3D ، حدد أيقونه التجربة تصميم/تشغيل التي تم تصويرها بواسطة قارورة. يجب ان يظهر مربع حوار جديد بعنوان تجربه التصميم/التشغيل.
    1. قم بتعيين عدد المكدسات Z وسمك العينة باستخدام التصميم ثم التبويب الخاص بالاختبار في مربع الحوار تجربه التصميم/التشغيل .
      ملاحظه: بالنسبة للتجارب في القسم النتائج التمثيلية ، 17 Z-مكدسات في 200 نانومتر الفاصل الزمني للصور الثابتة وأربعه Z-مداخن في 200 نانومتر الفاصل الزمني للحصول علي المجهر الزمني تم استخدامها.
    2. لقياس سمك الخلايا في النموذج يدويا ضبط المستوي Z بشكل متزايد باستخدام الأسهم لاعلي ولأسفل في مربع الحوار resolve3D . ضع علامة في المكان الذي تخرج فيه الخلايا من بؤره التركيز كالحد الأعلى والأدنى للحصول علي الصور. استيراد هذه المعلومات قبل تشغيل التجربة.
    3. للمساعدة في تقليل السمية الضوئية والمسح الضوئي اثناء التصوير المتتابع ، قلل عدد المكدسات Z واختر المستوي المتوسط للخلايا لاكتساب الصور.
  6. حدد مجموعه عوامل التصفية المناسبة للتجربة باستخدام علامة التبويب التصميم ثم القناات في مربع الحوار تجربه التصميم/التشغيل (tritc: EX 542/27; EM 597/45; FITC/GFP: EX 475/28; EM 525/48; mCherry: EX 575/25 ؛ EM 632/60; Cy5: EX 632/22; EM 676/34).
    1. أيضا ، حدد مرجعا لمجموعه معلومات POL/DIC. ضبط انتقال النسبة المئوية (كثافة الضوء) ومده التعرض للقنوات الفردية المحددة قبل التصوير عن طريق تحديد الخيارات المناسبة في مربع الحوار resolve3D .
      ملاحظه: في حقل اختبار من طريقه العرض التي لا تعتبر للتجربة اختبار هذه الإعدادات للتعرف علي ما إذا كانت المعلمات المحددة الحصول علي بيانات الفلورية ذات مغزى دون فقدان اشاره ضعيفه أو إفراط في التشبع. ثم استيراد هذه المعلمات لاعداد التجريبية.
  7. افتح قائمه النقاط عن طريق تحديد زر قائمه النقاط في مربع الحوار resolve3D . يجب ان يظهر مربع حوار جديد بعنوان قائمه النقاط. حدد العديد من حقول العرض التي سيتم استخدامها في التجربة عن طريق البحث عن الحقول المناسبة لطريقه العرض باستخدام عناصر تحكم مرحله المجهر وتحديد خيار نقطه العلامة في مربع الحوار قائمه النقاط.
    ملاحظه: سيتعين تحديد نقطه استبدال في كل مره يتم فيها أعاده تركيز المجهر علي نقطه في قائمه النقاط. ويمكن القيام بذلك عن طريق تركيز المجهر علي النقطة المناسبة في القائمة ثم تحديد الزر استبدال نقطه . من المهم ان لا تلمس التناظرية الخشنة/غرامه مقبض التعديل عند أعاده التركيز. استخدام البرنامج فقط لضبط التركيز.
  8. تعيين معلمات الفاصل الزمني من خلال تحديد التصميم أولا ثم الجدولة الزمنيه في مربع حوار التجربة التصميم/التشغيل. حدد خانه الاختيار الفاصلة الزمنيه. ادخل المعلمات الزمنيه المناسبة من حيث الصور المتتابعة/الوقت الإجمالي.
  9. قم بتعيين نقاط ليتم وضعها في قائمه النقاط من خلال تحديد علامة التبويب التصميم ثم النقاط في مربع الحوار تجربه التصميم/التشغيل أولا. حدد خيار قائمه نقاط الزيارة وادخل نقاطا ليتم وضعها في مربع النص مفصوله بفواصل أو واصلات إذا كان تسلسل كامل.
  10. قبل بدء تجربه ، يمكنك تحرير أسماء الملفات ومواقع الملفات باستخدام علامة التبويب " تشغيل " في مربع الحوار "تصميم/تشغيل". يمكن تغيير موقع الملف عن طريق تحديد زر الإعدادات ، وتحديد مجلد البيانات ، ومن ثم تحديد المجلد المناسب أو إنشاء واحده جديده. تغيير أسماء الملفات عن طريق إدخال في اسم الملف الجديد في مربع النص اسم ملف الصورة.
  11. أبدا التجربة عن طريق تحديد زر التشغيل في مربع الحوار بدء التجربة .
    ملاحظه: بالنسبة لمرور الوقت ، تحقق باستمرار التركيز في كل حقل من مجالات العرض خلال التجربة باستخدام اعداد DIC (لتجنب الرشح غير الضروري) وأعاده التركيز وتحديث المعلومات في قائمه النقاط كخلايا تميل إلى الخروج من التركيز علي مر الزمن.

4. معالجه الصور

  1. افتح ملفات الصور الخام (R3D) المطلوبة لإنشاء الأرقام.
    ملاحظه: يمكن تحديد موقع الملفات المحفوظة مؤخرا باستخدام زر مجلد البيانات في مربع الحوار بدء تشغيل برنامج التصوير.
  2. تشغيل برنامج تفكيك ، لأزاله الضوء الفلوري خارج التركيز7،8، من أجل إنتاج ملف صوره D3D ديفولفيد. حدد علامة التبويب العملية في مربع الحوار بدء التشغيل ، ثم حدد تفكيك. سيظهر مربع حوار جديد بعنوان تفكيك.
    1. تعيين معلمات فك التشكيل عن طريق سحب رقم الصورة المناسبة (الموجود في الزاوية اليسرى العليا من كل ملف صوره) إلى الإدخال في مربع الحوار أزاله التشكيل. في مربع الحوار أزاله الشكل ، حدد الزر المزيد من الخيارات ، وقم بإلغاء تحديد خانه الاختيار الاقتصاص الحدود بعد المعالجة (والا لا يمكن فرض الصور عبر ملف DIC المطابق).
    2. انقر فوق الزر " القيام بذلك " في مربع الحوار أزاله الشكل إلى ملف الصورة الاوليه التي تم تفكيكها.
      ملاحظه: يمكن تعديل معلمات التحلل علي النحو المشار اليه في دليل إرشادات الشركة المصنعة للبرمجيات للنتائج المرجوة.
  3. إذا لزم الأمر ، قم باجراء الطرح اليدوي للضوضاء في الخلفية وضبط السطوع/التباين في اي من قنوات الطول الموجي (اللون) أو جميعها. قم بذلك عن طريق تحديد زر تعديل التباين علي ملف الصورة الذي تم تفكيكه.
  4. احفظ الصورة كملف TIFF عن طريق تحديد خيار الملف أولا في اعلي مربع الحوار D3D . ثم حدد حفظ ك TIFF ، تحديد وتحديد المناسبة المكدسات Z (التي هي ضمن التركيز) ، حدد أو إلغاء تحديد مجموعات تصفيه المطلوب.
  5. قم باجراء قياس كمي للبيانات باستخدام اي برنامج موفر من قبل الشركة المصنعة أو برامج متوفرة بحريه مثل ImageJ5.
    1. لقياس حجم الخلية انقر فوق علامة التبويب أداه علي ملف صوره D3D المناسبة ، ومن ثم حدد الخيار مسافات القياس . قياس المسافات عن طريق تحديد نقاط البداية والنهاية علي ملف الصورة المطلوب باستخدام الماوس من خلال النقرات اليسرى.
      ملاحظه: من الأفضل تكبير الصورة اثناء القياس الكمي للخلية.
    2. للقياس الكمي اشاره فلوري استخدام الخيار مفتش البيانات تحت علامة التبويب أداه علي ملف صوره D3D المناسبة.
      ملاحظه: فمن الأفضل للتكبير علي الصورة ويكون المرشحات ذات الصلة فقط المحددة عند استكمال القياس الكمي اشاره فلوري.
    3. لتحديد الاشاره الفلورية ، ارسم مربعا باستخدام خيار العمود/الصف إلى بعد معين. حدد منطقه بها اشاره ليتم تحديدها كميا وتسجيل القيمة. قم بقياس اشاره الخلفية باستخدام مربع الحجم نفسه لتحديد منطقه خارج الخلايا مباشره. اطرح قيمه الخلفية من القيمة المسجلة من الاشاره الفلورية التي تم الحصول عليها داخل الخلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الأنماط الظاهرية GpsB
سابقا لقد أظهرنا ان Sa-GpsB هو بروتين أساسي كما استنفاد GpsB باستخدام النتائج الحمض الريبي النيبالي انتيسنس في الخلية تحلل9. هنا نوضح كيف يمكن التقاط ظهور مختلف الأنماط الظاهرية لتقسيم الخلايا والتغيرات في توطين البروتين باستخدام بروتوكول المجهر الزمني الذي تم وصفه في هذه المقالة. ولهذا الغرض ، فان سلالات s. RB143 [SH1000 إيواء pEPSA5 (ناقل فارغ)] و GGS8 [SH1000 إيواء pGG59 (Pxyl-gpsbتحسيسbla cat)] التي ابلغ عنها سابقا9، نمت علي النحو التالي. وقد تم تطعيم سلالات RB143 و GGS8 في 2 مل من مرق الصويا التريتيك (تقييس) تستكمل مع 5 ميكروغرام/مل الكلورامفينيكول (الكلور) في أنبوب اختبار 15 مل وكانت حضنت بين عشيه وضحيها في 22 درجه مئوية اثناء الاهتزاز. وخففت الثقافات بين عشيه وضحيها 1:20 في 10 مل من الكلور الطازجة + في قارورة 125 mL ونميت في 37 درجه مئوية مع الاهتزاز حتى منتصف لوغاريتمي المرحلة (OD600 = 0.5). تمت أضافه المحفز ، 1 ٪ اكسيليز ، إلى الوسط الثقافي لتحريك التعبير عن الحمض الريبي النيبالي انتيسنس من gpsb ونميت الثقافة لمده 3 ساعات أخرى. ثم كانت ملطخه الخلايا مع صبغ الفلورسنت FM4-64 (غشاء وصمه عار) ، عند الاقتضاء ، باضافه 0.5 μl من 10 ميكروغرام/مل من المخزون من FM4 مباشره علي قسامه 5 μl من الثقافة علي طبق المجهر كما هو موضح في قسم البروتوكول. كما هو مبين في الشكل 1 والفيديو 1, أضافه اكسيليز للحث علي GGS8 سلاله أسفرت عن "المرضي" النمط الظاهري الخلية, كما هو موضح سابقا9, بينما السيطرة علي ناقلات فارغه (RB143) يبدو مشابهه لسيطرتنا — خلايا نمت في غياب محفز.

وأفادت مجموعتنا أيضا ان الإفراط في إنتاج الأس الذهبي gpsb (Sa-gpsb) يعطل انقسام الخلايا في b. رقيقه9. نحن نستخدم هذا النمط الظاهري التعبير الفوقي كمثال لشرح البروتوكول الموصوف هنا. وتحقيقا لهذه الغاية ، a b. رقيقه سلاله GG9 (amye::Phyperspank-gpsbSaspc ؛ ftsaz:: ftsaz-gfpωerm) وقد استخدم9. التوطين تحت الخلوية من فلوريسسينتلي-المسمي FtsZ ، وهو البروتين شعبه الخلايا الرئيسية التي علامات مواقع تقسيم الخلية10،11، وقد استخدمت لرصد حاله شعبه الخلايا. وقد أعدت العينة المجهرية علي النحو التالي. وقد تم تطعيم مستعمره واحده من GG9 في 2 مل لوريا-Bertani (LB) المتوسطة وحضنت بين عشيه وضحيها في 22 درجه مئوية في حاضنه شاكر. وكانت الثقافات بين عشيه وضحيها 1:20 في 10 مل من LB الطازجة ، ونميت في 37 درجه مئوية مع الاهتزاز حتى منتصف لوغاريتمي المرحلة (OD600 = 0.5). GG9 الخلايا (5 μL aliquot) ليتم وضعها في الجزء السفلي من طبق ثقافة القاع الزجاجية ومغطاه 1 ٪ لوحه اجبرز المصنوعة من رطل تستكمل مع 250 μM (التركيز النهائي) من ايزوبروبيل β-د-1-ثيوغالالاكتويرانيوسيد (IPTG) للحث علي التعبير عن Sa-gpsB (الشكل 2 والفيديو 2). واجري المجهر الزمني والقياس الكمي لطول الخلية علي النحو الموصوف في القسم الخاص بالبروتوكول.

تثبيط FtsZ
FtsZ ، كونها بروتين أساسي لتقسيم الخلايا ، يعتبر هدفا جذابا المخدرات ومجموعات متعددة تتطور مثبطات FtsZ كوسيلة لتطوير المضادات الحيوية الجديدة12. أنماط التعريب من FtsZ أو واحده من البروتينات المرتبطة به ، مثل ZapA ، يمكن استخدامها كمراسل لدراسة و/أو تحديد المركبات المضادة للميكروبات الرواية. نحن نستخدم البروتوكول المقدم هنا لشرح هذا النهج باستخدام s. RB197 [SH1000 إيواء pRB42 (PCd-zapaSa-gfp bla)]9 و b. رقيقه PE92 (ftsaz:: ftsaz-gfpωerm)13 سلالات. وقد نمت RB197 و PE92 سلالات كما هو موضح أعلاه في مكتب تقييس الاتحادات (التي تحتوي علي 5 ميكروغرام/مل الاريثروميسين; و 1.25 μM CdCl2 للحث علي التعبير عن zapa-GFP) و LB علي التوالي. في المرحلة منتصف لوغاريتمي ، تم أضافه مثبط ftsz تتميز جيدا ، PC19072314،15، في 2 ميكروغرام/مل التركيز النهائي وتاثيره علي s. الذهبية والخلايا b. رقيقه تم رصدها باستخدام المجهر في فترات زمنيه مختلفه (الشكل 3 والشكل 4). تم اجراء القياس الكمي لقطر الخلية من s. الذهبية وطول الخلية من b. رقيقه كما هو موضح في قسم البروتوكول.

Figure 1
الشكل 1: الرسم المجهري عالي الاستبانة للخلايا الذهبية التي تعرض النمط الظاهري المرضي. الرسوم البيانية المجهرية من سلالات s. الذهبية إيواء اما ناقلات فارغه (اليسار; RB143) أو نسخه محرض من الحمض الريبي النيبالي انتيسنس من GpsbSa (الحق; GGS8) في وجود وغياب 1 ٪ اكسيليز (المحفز). الخلايا الملطخة الملونة مع وصمه الغشاء FM4-64 (الأسهم المذابة في المياه المعقمة) والذين يعانون من العقم باستخدام مجموعه فلتر TRITC. شريط المقياس: 1 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: بيانات تمثيليه تبين تثبيط انقسام الخلية في b. رقيقه(ا) المهل الزمنيه الدقيقة ل b. رقيقه سلاله GG9 مع الصور التي تم الحصول عليها في فواصل 20 دقيقه لمده 120 دقائق باستخدام قنوات DIC/fitc. وتظهر البيانات الفلورية من FtsZ-GFP (الأخضر). الأسهم تتبع خليه واحده في جميع انحاء التجربة. شريط المقياس: 1 μm. (ب) القياس الكمي لأطوال الخلايا في جميع النقاط الزمنيه. يتم عرض متوسط طول الخلية مع أشرطه الخطا التي تشير إلى الانحراف المعياري (n = 50). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: التحقيق في الدورة الزمنيه لتثبيط انقسام الخلايا في s.الذهبية. (ا) خلايا مرحله منتصف لوغاريتمي من سلاله RB197 غير المعالجة (الأعلى) أو المعالجة (أسفل) مع مثبطات ftsz (PC190723) ، بعد 30 دقيقه النمو ، واتخذت قسامات من الثقافات المتنامية كل 10 دقيقه لمده 90 دقيقه والذين يعانون من الاضطرابات باستخدام DIC ومجموعات فلتر fitc. ويظهر الفلورية من ZapA-GFP. شريط المقياس: 1 μm. (ب) القياس الكمي لبيانات المجهر المجهري. يظهر متوسط عرض الخلية مع أشرطه الخطا التي تشير إلى الانحراف المعياري (n = 50) والنسبة المئوية للخلايا (n = 50) التي تعرض تعريب ZapA-GFP المناسب (منتصف الخلية والمحيط). تظهر نقاط البيانات من الخلايا المعالجة بالمثبط باللون الأحمر. تتطابق الاشكال مع المخطط التفصيلي الأخضر مع المحور Y الأيمن. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: التحقيق في تثبيط انقسام الخلايا بواسطة مثبط اصطناعي في b. رقيقه B. السلالة الفرعية PE92 كان اما غير المعالجة أو التعامل مع مثبط FTSZ (PC190723) في منتصف لوغاريتمي المرحلة وتم رصدها لمده 90 التالية دقيقه. وأخذت الارصفه من الثقافات المتنامية كل 10 دقائق للمجهر وتم الحصول علي الصور باستخدام قنوات DIC/fitc. ويظهر الفلورية من FtsZ-GFP. شريط المقياس: 1 μm. (ب) القياس الكمي لبيانات المجهر المجهري. متوسط طول الخلية مع أشرطه الخطا التي تشير إلى الانحراف المعياري (n = 50) والنسبة المئوية للخلايا (n = 50) عرض ترجمه FtsZ-GFP الصحيحة في منتصف الخلية. تظهر نقاط البيانات من الخلايا المعالجة بالمثبط باللون الأحمر. تتطابق الاشكال مع المخطط التفصيلي الأخضر مع المحور Y الأيمن. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الفيديو 1: المجهر الزمني للخلايا s. الذهبية النامية النمط الظاهري المرضي. سلاله GGS8 (Gpsb انتيسنس) تعامل مع 1 ٪ اكسيليز. كانت ملطخه الخلايا مع FM4-64 وصمه عار الغشاء والذين يعانون منه في 10 دقيقه فواصل لمده 60 دقيقه باستخدام قناه TRITC كما هو موضح في البروتوكول. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.

الفيديو 2: الإفراط في التعبير عن Sa-gpsb يؤدي إلى تثبيط انقسام الخلايا في b. رقيقه. الفيديو الزمني يظهر التغذية والتغيير في تعريب FtsZ-GFP في GG9. وقد التقطت الصور علي فترات 20 دقيقه لمده 120 دقيقه باستخدام قنوات DIC و FITC. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.

الانواع سلاله الجيني مرجع
S. الذهبية RB143 SH1000 pEPSA5, bla, قطه اسارا وآخرون ، 2018
S. الذهبية GGS8 SH1000 pGG59 (pEPSA5 العمود الفقري) Pxyl-gpsbانتيسنس، bla ، القط اسارا وآخرون ، 2018
S. الذهبية RB197 SH1000 pRB42 (pJB67 العمود الفقري) PCd-ZapaSA-gfp ، bla ، القط اسارا وآخرون ، 2018
B. رقيقه GG9 amyE::P فرط الرشاقة-gpsBSA spc ؛ ftsAZΩftsAZ-gfp اسارا وآخرون ، 2018
B. رقيقه PE92 ftsAZ:: ftsAZ-gfp Ωerm Brzozowski et al, 2019

الجدول 1: السلالات المستخدمة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وظل المجهر عمادا في الدراسات المتعلقة بالكائنات الميكروبية. النظر إلى حجم خلايا الميكرون ، فان الدراسات علي مستوي الخلية الواحدة تعتمد تقليديا علي المجهر الكتروني (EM). علي الرغم من ان EM أصبحت تقنيه قويه جدا في السنوات الاخيره ، فان لديها حدودها الذاتية الخاصة بالاضافه إلى وصول المستخدم محدوده16. وقد وفرت التحسينات في تقنيات المجهر الفلوري وتطوير تحقيقات الفلورسنت المختلفة ، مثل FDAA3، علماء البيولوجيا الخلايا الميكروبية مع مجموعه واسعه من الاداات لدراسة مختلف العمليات الخلوية في الخلايا الحية. الباحثون أيضا بنشاط بناء أدوات الفلورسنت لرصد التغييرات, علي سبيل المثال في مستوي الاشاره جزيئات مثل c-دي-GMP من بين أمور أخرى, في الخلايا الحية17,18. الاضافه إلى ذلك ، فان المجهر الزمني العالي الدقة يتيح للمحققين مراقبه التغييرات عند حدوثها ودراسة الأنماط الظاهرية ذات الصلة.

لقد قدمنا بروتوكولات مفصله لاجراء التجارب المجهرية مع المجهر مضان عاليه الدقة (انظر جدول المواد). ومع ذلك ، يمكن تغيير الخطوات في البروتوكولات لتناسب احتياجات المستخدم والمجهر المستخدمة. نحن نستخدم s. الذهبية و b. رقيقه كما لدينا نموذج الكائنات الحية لإظهار كيفيه مراقبه مختلف الأنماط الظاهرية تقسيم الخلية ، وتتبع التغييرات في توطين البروتين ، وتحديد حجم البيانات. الاضافه إلى ذلك ، بالنسبة للحالات التي لا يؤدي فيها الزمن ، فاننا نعرض بمساعده مثبط FtsZ ، كيفيه اعداد تجربه دوره زمنيه.

الحصر متاصله مع [فلوو] مجهريه القرار يحدد بالانكسار حد, اي استطاع كنت قهرت [إلى حد ما] مع المعونة من متقدمة فائق الدقة مجهريه تقنيات19,20. ويمكن التحايل علي مسائل أخرى مثل السمية الضوئية والغسل بالصور عن طريق جمع عدد اقل من الأكوام المتوسطة أو تقليل مده و/أو تواتر التعرض لأشعه الليزر. والمواد التوجيهية الأخرى الخاصة بالمجهر الخلوي الحي متاحه21.

الاضافه إلى التجارب الموصوفة هنا ، يمكن استخدام منهجيات مماثله لتحديد المركبات التي تستهدف عمليات خلوية محدده بطريقه عاليه الانتاجيه. ويمكن أيضا ان تدمج الخوارزميات التي تقوم باتمته عمليه القياس الكمي في مجموعات البيانات الكبيرة22و23. هناك حاجه هائله لدراسة الأنواع البكتيرية المختلفة لمعالجه أزمه مقاومه المضادات الحيوية ، وهناك ما يبرر المزيد من الدراسات لفهم أليات العمليات البيولوجية الاساسيه وتحديد المركبات العلاجية الجديدة. وقد اكتسبت التقنيات المجهرية الفلورية المختلفة القوه والزخم لمساعده الباحثين في التصدي لهذه التحديات بين أمور أخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgments

نشكر أعضاء المعمل علي تعليقاتهم علي هذه المقالة. وقد تم تمويل هذا العمل من خلال منحه لبدء التشغيل من جامعه جنوب فلوريدا (PE).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Fisher BioReagents BP160-100 Molecular Biology Grade - Low EEO
DAPI Invitrogen D3571 Microscopy
FM4-64 Invitrogen T3166 Microscopy
Glass bottom dish MatTek P35G-1.5-14-C Microscopy
IPTG Fisher BioReagents BP1755-10 Dioxane-free
Microscope GE DeltaVision Elite Customized Olympus IX-71 Inverted Microscope Stand; Custom Illumination Tower and Transmitted Light Illuminator Module. Objectives: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X OIL (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); DIC Prism Nomarski for 100X Objective; CoolSnap HQ2 camera; SSI Assembly 7-color; Environmental control chamber - opaque.
PC190723 MilliporeSigma 3445805MG FtsZ inhibitor
SoftWorx GE Manufacturer-supplied imaging software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Coltharp, C., Xiao, J. Superresolution microscopy for microbiology. Cellular Microbiology. 14, (12), 1808-1818 (2012).
  2. Holden, S. Probing the mechanistic principles of bacterial cell division with super-resolution microscopy. Current Opinion in Microbiology. 43, 84-91 (2018).
  3. Hsu, Y. P., et al. Full color palette of fluorescent d-amino acids for in situ labeling of bacterial cell walls. Chemical Science. 8, (9), 6313-6321 (2017).
  4. Nonejuie, P., Burkart, M., Pogliano, K., Pogliano, J. Bacterial cytological profiling rapidly identifies the cellular pathways targeted by antibacterial molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110, (40), 16169-16174 (2013).
  5. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BioMed Central Bioinformatics. 18, (1), 529 (2017).
  6. Colville, K., Tompkins, N., Rutenberg, A. D., Jericho, M. H. Effects of poly(L-lysine) substrates on attached Escherichia coli bacteria. Langmuir. 26, (4), 2639-2644 (2010).
  7. McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy. Methods. 19, (3), 373-385 (1999).
  8. Wallace, W., Schaefer, L. H., Swedlow, J. R. A workingperson's guide to deconvolution in light microscopy. Biotechniques. 31, (5), 1076-1082 (2001).
  9. Eswara, P. J., et al. An essential Staphylococcus aureus cell division protein directly regulates FtsZ dynamics. Elife. 7, (2018).
  10. Haeusser, D. P., Margolin, W. Splitsville: structural and functional insights into the dynamic bacterial Z ring. Nature Reviews Microbiology. 14, (5), 305-319 (2016).
  11. Du, S., Lutkenhaus, J. At the Heart of Bacterial Cytokinesis: The Z Ring. Trends in microbiology. (2019).
  12. Haranahalli, K., Tong, S., Ojima, I. Recent advances in the discovery and development of antibacterial agents targeting the cell-division protein FtsZ. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 24, (24), 6354-6369 (2016).
  13. Brzozowski, R. S., et al. Deciphering the Role of a SLOG Superfamily Protein YpsA in Gram-Positive Bacteria. Frontiers in Microbiology. 10, 623 (2019).
  14. Elsen, N. L., et al. Mechanism of action of the cell-division inhibitor PC190723: modulation of FtsZ assembly cooperativity. Journal of the American Chemical Society. 134, (30), 12342-12345 (2012).
  15. Haydon, D. J., et al. An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcal activity. Science. 321, (5896), 1673-1675 (2008).
  16. Pilhofer, M., Ladinsky, M. S., McDowall, A. W., Jensen, G. J. Bacterial TEM: new insights from cryo-microscopy. Methods in Cell Biology. 96, 21-45 (2010).
  17. Ni, Q., Mehta, S., Zhang, J. Live-cell imaging of cell signaling using genetically encoded fluorescent reporters. Federation of European Biochemical Societies Journal. 285, (2), 203-219 (2018).
  18. Weiss, C. A., Hoberg, J. A., Liu, K., Tu, B. P., Winkler, W. C. Single-Cell Microscopy Reveals That Levels of Cyclic di-GMP Vary among Bacillus subtilis Subpopulations. Journal of Bacteriology. 201, (16), (2019).
  19. Schneider, J. P., Basler, M. Shedding light on biology of bacterial cells. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371, (1707), (2016).
  20. Yao, Z., Carballido-Lopez, R. Fluorescence imaging for bacterial cell biology: from localization to dynamics, from ensembles to single molecules. Annual review of microbiology. 68, 459-476 (2014).
  21. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  22. Fredborg, M., et al. Automated image analysis for quantification of filamentous bacteria. BioMed Central Microbiology. 15, 255 (2015).
  23. Ursell, T., et al. precise quantification of bacterial cellular dimensions across a genomic-scale knockout library. BioMed Central Biology. 15, (1), 17 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics