דמיין את הדינמיקה של משטח הפני-תא באמצעות מיקרוסקופ גיליון אור של סריג

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא להראות כיצד להשתמש במיקרוסקופיה של יריעות האור כדי להמחיש באופן זמני את הדינמיקה של קולטן פני השטח בתאים חיים. כאן קולטני תא T על CD4+ תאי t הראשי מוצגים.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Rosenberg, J., Huang, J. Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy. J. Vis. Exp. (155), e59914, doi:10.3791/59914 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

האיתות והתפקוד של תא מוכתבים על-ידי מבנים דינאמיים ואינטראקציות של קולטני פני השטח שלה. כדי באמת להבין את היחסים מבנה פונקציה של קולטנים אלה באתרו, אנחנו צריכים להמחיש ולעקוב אחריהם על פני השטח התא לחיות עם רזולוציה מספקת הזמן הזמני. כאן אנו מראים כיצד להשתמש לאחרונה פיתח רשת מיקרוסקופית גיליון אור (LLSM) לתמונה קולטני T-cell (TCRs) ארבע-מימדי (4D, מרחב וזמן) בקרום התא החי. תאי T הם אחד התאים העיקרי של האפקטור של המערכת החיסונית אדפטיבית, וכאן השתמשנו בתאי T כדוגמה כדי להראות כי האיתות והפונקציה של תאים אלה מונעים על ידי הדינמיקה ואינטראקציות של TCRs. LLSM מאפשר הדמיה 4D עם רזולוציה חסרת תקדים הזמני. טכניקה זו מיקרוסקופית ולכן ניתן להחיל בדרך כלל על מגוון רחב של מולקולות משטח או תאיים של תאים שונים בביולוגיה.

Introduction

הדינמיקה המדויקת של הסחר במולקולות והפצת המשטחים התלת-ממדיים בזמן אמת הייתה תעלומה לפתרון. מיקרוסקופ תמיד היה איזון של מהירות, רגישות, ורזולוציה; אם אחד או שניים מהם מוגדלים, השליש ממוזער. לכן, בשל גודל קטן ומהירות עצומה עם אילו קולטני פני השטח לנוע, מעקב אחר הדינמיקה שלהם נשאר אתגר טכנולוגי גדול לתחום של ביולוגיה התא. לדוגמה, מחקרים רבים נערכו באמצעות סך השתקפות פנימית מיקרוסקופ (tirf)1,2,3, אשר יש ברזולוציה הטמפורלית הגבוהה, אבל יכול רק תמונה פרוסה דקה מאוד של קרום T-cell (~ 100 nm), ולכן מחמיץ אירועים קורה רחוק יותר בתא. אלה תמונות TIRF גם מראה קטע דו מימדי של התא. לעומת זאת, טכניקות ברזולוציה סופר, כגון מיקרוסקופ סטוכסטי שחזור אופטי (סטורם)4, מיקרוסקופ לוקליזציה פוטומופעל (PALM)5, ו מיקרוסקופית פליטה מגורה (ההיסטד)6, יכול להתגבר על מגבלת מגביל של אבה של האור. טכניקות אלה יש רזולוציה מרחבית גבוהה (~ 20 החלטה nm)4,5,6,7, אבל לעתים קרובות הם לוקחים הרבה דקות כדי לרכוש מלא דו-ממדי (2d) או תלת מימדי (3d) התמונה, ולכן הרזולוציה הטמפורלית אובד. בנוסף, טכניקות כגון הסערה והדקל המסתמכים על אותות מהבהבים עשויים להיות אי-דיוקים בספירת8,9. מיקרוסקופ אלקטרוני יש הרזולוציה הגבוהה ביותר (עד 50 pm החלטה)10; זה יכול אפילו להתבצע תלת מימדי עם קרן יון ממוקדת סריקה אלקטרון מיקרוסקופ (פרפור-SEM), וכתוצאה מכך 3 ננומטר XY ו 500 nm Z החלטה11. עם זאת, כל צורה של אלקטרון מיקרוסקופ דורש הכנה לדוגמה קשה יכול להתבצע רק עם תאים קבועים או רקמות, ביטול האפשרות של הדמיה לחיות דגימות לאורך זמן.

טכניקות כדי להשיג את הרזולוציה גבוהה זמן זמן הדרוש כדי לזהות את הדינמיקה של פני השטח מולקולות תאיים בתאים חיים בטבע הפיזיולוגי האמיתי שלהם 3d הוא רק לאחרונה פיתח. אחת הטכניקות הללו היא מיקרוסקופ גיליון האור של סריג (LLSM)12, אשר מנצל גיליון אור מובנה כדי להקטין באופן דרסטי הלבנה. פותח בשנת 2014 על ידי חתן פרס נובל אריק ביאזיג, הרזולוציה הגבוהה בציר, הלבנה נמוכה ורעש הרקע, ואת היכולת לדמות בו מאות מטוסים לשדה התצוגה להפוך מיקרוסקופים מעולה לשדה שטח, tirf וקונפוקלית יקרוסקופים12,13,14,15,16,17,18,19. זה 4-מימדי (x, y, z ו-time) הדמיה טכניקה, בעוד עקיפה מוגבלת (~ 200 ננומטר החלטה XYZ), יש ברזולוציה הטמפורלית מדהים (השגנו שיעור מסגרת של כ 100 fps, וכתוצאה מכך תמונת תא 3D שוחזר עם 0.85 שניות לכל מסגרת) עבור רכישה מרחבית תלת-ממדית.

Llsm ניתן להשתמש בדרך כלל כדי לעקוב אחר הדינמיקה בזמן אמת של כל המולקולות בתוך תא כלשהו ברמת מולקולה אחת וברמה תא יחיד, במיוחד אלה בתאי נעים מאוד כגון תאים חיסוניים. לדוגמה, אנו מראים כאן כיצד להשתמש ב-LLSM כדי להמחיש דינאמיקה של קולטן T-cell (TCR). תאי T הם התאים האפקטור של המערכת החיסונית אדפטיבית. TCRs אחראים לזיהוי פפטיד-MHC (pMHC) ליגנדס הציג על פני השטח של תאים המציגים אנטיגן (APC), אשר קובע את הבחירה, פיתוח, בידול, גורל, ותפקוד של תא T. הכרה זו מתרחשת בממשק שבין תאי T ו-APCs, וכתוצאה מכך, באשכולות הקולטן מקומי כדי ליצור את מה שנקרא סינפולוגית. אמנם ידוע כי TCRs ב סינפולוגית החיסונית הם הכרחי לפונקציה T-cell אפקטור, עדיין לא ידוע הם המנגנונים הבסיסיים של סחר TCR בזמן אמת הסינפסה. LLSM אפשרה לנו לדמיין בזמן אמת את הדינמיקה של TCRs לפני ואחרי הסחר בסינפסה עם האינטראקציה הנובעת pMHC-TCR (איור 1). LLSM ניתן להשתמש לפיכך כדי לפתור את השאלות הנוכחיות של הדינמיקה המעצבים של TCRs ולספק תובנות כדי להבין כיצד תא מבדיל בין אנטיגנים עצמאיים וזרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

5C. C7 TCR-transgenic RAG2 עכברים בB10. הרקע שימש במחקר זה על פי פרוטוקול שאושר על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת שיקגו.

1. קציר והפעל תאי T

הערה: חלק זה של הפרוטוקול מבוסס על פרוטוקולים קודמים. ראה אזכורים לפרטים נוספים20,21.

  1. המתת חסד a 10-12 שבוע בן 5 ג. העכבר C7 טרנסגניים של שני מין (~ 20-25 g) על פי פרוטוקול IACUC מאושר (כלומר, חדר CO2 ואחריו פריקה צוואר הרחם).
  2. ספריי גווייה העכבר ביסודיות עם 70% אתנול לספוג את הפרווה ולהביא לארון בטיחות BSL-2.
  3. להפוך את העכבר על הצד הימני שלו ולעשות חתך קטן בחלל הגוף עם מספריים כירורגית. להסיר את הטחול באמצעות מלקחיים כירורגי. חותכים את רקמת החיבור כנדרש עם מספריים כירורגיים.
  4. מניחים את הטחול ב 70 μm-הנקבוביות תא מסננת ומחית עם הגב של מזרק 1 mL. לשטוף דרך מסננת ביסודיות עם RPMI מלאה (RPMI עם 10% סרום של שור עוברי [FBS], 2 מ"מ L-גלוטמין, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 50 μM 2-mercaptoethanol).
  5. צנטריפוגה את התא הבולם היחיד של הטחול ב 300 x g עבור 5 דקות. לבטל את הסופרנטאנט.
    הערה: הגלולה בנקודה זו תהיה אדומה.
  6. השהה מחדש את הטחול במאגר של 5 מ ל לפירוק. דגירה עבור 5 דקות, ואז להרוות עם 5 מ ל של RPMI השלם.
  7. צנטריפוגה את התא הבולם היחיד של הטחול ב 300 x g עבור 5 דקות. לבטל את הסופרנטאנט.
    הערה: הגלולה בנקודה זו צריכה להיות לבנה, לא אדומה.
  8. השהה מחדש את הגלולה ב-5 מ ל להשלמת RPMI.
  9. העבר לבקבוקון T-25 והוסף 10 μM עש ציטוכרום-C (מק, רצף אנארדיליאיקטק). הניחו את התאים בחממה לתרבות התא ב-37 ° c, 5% CO2 לילה.
  10. ביום למחרת, להוסיף רקומביננטי עכבר IL-2 לריכוז הסופי של 100 U/mL.
  11. צפו בימים הבאים, הוספת מדיה טרייה כאשר המדיה הנוכחית הופכת לצהובה. תאי T ימותו אם שמאל במדיה צהוב ללא השגחה עבור מעל 48 h. תאים מוכנים להשתמש 6-10 ימים לאחר הקציר.

2. הכן תאים

  1. מודטה 5 מילימטר שמיכות עגול עם 0.1% פולי-L-ליזין עבור 10 דקות.. ולתת להתייבש באופן טבעי
  2. השתמש מגיב הדרגתי צפיפות (לראות את הטבלה של חומרים) כדי להפריד תאים מתים להשיג 1 x 106 תאים T ו-1 x 106 apcs (CH27 תאים21, 22 התמרה באמצעות ציטוסולג mcherry) בנפרד.
    הערה: תאים נספרים באמצעות הומוציטוטומטר.
    1. הוסף 3 מ ל של צפיפות מעבר הצבע מגיב ל 15 מ"ל צינור חרוט ולהוסיף תאים dropwise לקצה הצינור בזהירות. אל תערבב. צנטריפוגה ב 930 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c; השתמש בהאצת/האטה: איטית/איטית. הסר את שכבת התאים האמצעית הדקה בין המדיה המלאה ומעבר הצבע המגיב בקפידה, תוך הצבת כל סוג תא בצינורות חרוטיים נפרדים.
      הערה: יש צורך להכין יותר תאים מהדרוש להדמיה, כפי שאנו מוצאים כי 50% אובד בממוצע במהלך התהליך. יותר תאים המשמשים את התהליך, קל יותר לקצור אותם מעבר הדרגתי צפיפות. אנו משתמשים 4-8 mL של שני סוגי התא כדי להבטיח תאים עודפים. במקרה הצורך, ניתן לספור תאים לפני שלב זה כדי להבטיח את נפח האחסון הדרוש. כל התאים הנוספים הם בחזרה לתוך מבחנות בהתאמה שלהם.
    2. לשטוף את שתי הצינורות של תאים T ו CH27 תאים שלוש פעמים עם 5 mL להשלים RPMI (300 x g עבור 5 דקות). התעלם מהסופרנטנט בכל פעם בזמן השטיפה. השהה מחדש כל צינור ב-1 mL להשלים RPMI ולספור תאים על ידי הומוציטומטר.
  3. השעיה מחדש 1 x 106 apcs ב 500 μl להשלים RPMI ולהוסיף 10 ΜM mcc. דגירה עבור 3 h ב 37 ° צ', 5% CO2. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 500 μL RPMI להשלים (300 x g עבור 5 דקות). . להיפטר מהסופרנטנמלים
  4. השהה מחדש 1 x 106 תאים T ב 500 μl השלם RPMI. להוסיף 2 μg של anti-TCRβ Alexa488 התווית Fab (שיבוט H57) כדי 500 μL של תאים. דגירה של 30 דקות ב 37 ° c, 5% CO2. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 500 μL של RPMI השלם (300 x g עבור 5 דקות). מחק את הסופרנטאנט לאחר כל כביסה.
    הערה: הנוגדן האנטי-ממדי שנחתך באמצעות ערכת הכנה מסוג Fab (ראה את שולחן החומרים) כדי למנוע התחברות של קולטני התא T על-ידי הנוגדן הדינטי (שלב זה הוא אופציונלי).
  5. השהה מחדש את שני סוגי התאים ב-500 μL של מדיית דימות (פנול-free-15 בינוני של לייבוביץ עם 10% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 2 מ"מ L-גלוטמין).

3. הנהלת המערך היומי של LLSM

הערה: (חשוב) פרוטוקול יישור זה מבוסס על כלי ה-LLSM המשמש (ראה את טבלת החומרים). כל LLSM עשוי להיות שונה ודורשים אסטרטגיות יישור שונות, במיוחד אלה שנבנו בבית. בצע את היישור השגרתי המתאים והמשך לסעיף 4.

  1. הוסף 10 מ ל של מים פלוס 30 μL fluorescein (1 מ"ג/mL מלאי) אל האמבטיה LLSM (~ 10 mL נפח), לחץ על תמונה (Home) כדי להעביר את המטרה למיקום התמונה, ולהסתכל על תבנית יחידה לייזר בסל. יישר את קרן הלייזר בעזרת המדריכים והאזור שנקבע מראש של ריבית (ROI) כדי להפוך את הקרן לתבנית דקה בכל הכיוונים.
    1. הקרן צריך גם להופיע ממוקד מצלמת מאתר. השתמש שתי מראה להטות משקף, מיקרומטר העליון, פוקוס, וצווארון אובייקטיבי המטרה כדי לכוונן. ראה איור 2א, B עבור קרן מיושרת כהלכה.
  2. לשטוף את האמבטיה ואת המטרות עם לפחות 200 mL של מים כדי להסיר לחלוטין fluorescein.
  3. התמונה חרוזים בתקן פלורסנט במדיה הדמיה (מוכן על ידי שמירה חרוזים 5 מ"מ coverslip עם פולי-L-ליזין, לראות את הטבלה של חומרים; זה יכול להיות מראש מוכן מחדש) עבור פונקציה התפשטות נקודה פיזית (psf) במדיה הדמיה.
    הערה: יכול להיות רק חרוז אחד בתצוגה לעיבוד מאוחר יותר, כך לנסות למצוא חרוז כי הוא על ידי עצמו בצופה או יכול בקלות להיחתך כדי לקבל חרוז אחד.
    1. הפעל מיזוג צבעים על-ידי הגדרה ל-3 בתיבה ' X galvo range '. הקש על Live כדי להציג את השדה הנוכחי. לנוע לאורך כיוון Z כדי למצוא את שובר הכיסוי ואת החרוזים. מצא את המרכז של חרוז על ידי נע לאורך Z, לחץ על הפסק כדי להשהות את הלייזר. בדוק תלת -ממד, הקש מרכז ולאחר מכן לחץ על בצע. פעולה זו תאסוף את הנתונים.
    2. באופן ידני להתאים את המראה הטיה, הצווארון האובייקטיבי, מיקרומטר מיקוד הערכים האפורים הגבוהים ביותר, ולאחר מכן להתאים לפי הצורך כדי להשיג דפוסים הנכון עבור סריקה אובייקטיבית, z galvo, z + מטרה (תוצרת מדומה), ו לדוגמה לסרוק (סמלפימית) ללכוד מצבי. ראה איור 2C-F עבור הקרנות מרביות בעוצמה מקסימלית (mips).
      הערה: מצבי לכידות שונים (סריקה אובייקטיבית, z galvo, z + אובייקטיבי, וסריקה לדוגמה) לשנות את האופן שבו גיליון האור נע דרך המדגם. יש להשתמש בכל מצבי הסריקה לצורך יישור.
    3. הסריקה לדוגמה מראה כיצד הנתונים ייאספו במהלך הניסוי. לאסוף את PSF לדוגמה על ידי לחיצה על לבצע במצב סריקה לדוגמה עבור deskewing ופירוק (ראה סעיף 5). לשנות לייזרים למצב צבע שלושה (488, 560, 647) ולחץ לבצע שוב.
      הערה: מאז תמונות LLSM בזווית (57.2 °), תמונות שנתפסו במצב "לסרוק את המדגם" נאספים בזווית זו, ולכן הם "מוטה". De-skewing הוא תהליך של תיקון עבור זווית זו ו "יישור מחדש" את התמונה למחסנית z אמיתי. יש לאסוף נתונים אלה במדיית הדמיה ובכל הערוצים שיהיו בתמונה במהלך הניסוי. אם הדבר לא נאסף כראוי, הנתונים לא יהיו מכווננים כהלכה. כמו כן, ודא שהמדיה הייתה מתחממת ל-37 ° צ' (או לטמפרטורה הניסיונית הרצויה).

4. הגדרת תאים עם LLSM

  1. הוסף 100,000 APCs (50 μL) משלב 2.5 עד 5 מ"מ בקוטר שמיכות מעגלית משלב 2.1 ולאפשר להם להתפשר על 10 דקות.
  2. משמן את מחזיק המדגם ולאחר מכן להוסיף את התא coverslip בצד עד זה. הוסף טיפה של מדיית הדמיה לחלק האחורי של שמיכות כדי למנוע בועות לפני הצבת באמבטיה. לעזאזל עם מחזיק המדגם על piezo, ולחץ על התמונה (Home).
  3. מצא APC לתמונה כדי להבטיח את התוכנה LLSM והדמיה (ראה טבלת חומרים) מתפקד כראוי.
    הערה: אנו התמונה בגודל השלב 0.4 יקרומטר עם 60 z-שלבים ו 10 ms חשיפה לשני צבעים עם מיזוג להגדיר 3, אשר תוצאות 1.54 s לכל מסגרת של תמונה תלת-ממדית עם ~ 200 nm ו-400 הרזולוציה ננומטר z. ייתכן שיהיה צורך לכוונן הגדרות אלה על בסיס גודל התא, הרזולוציה הרצויה של z, וכוח האות משיטת תיוג הפלורסנט המשמשת. השימוש בכוח לייזר יהיה גם משתנה בהתבסס על הטכניקה תיוג פלורסנט בשימוש.
    1. הקש על Live כדי להציג את התמונה הנוכחית. הזז לאורך Z כדי למצוא את שובר הכיסוי והתאים.
    2. מצא את מרכז APC על ידי הזזת כיוון Z, ולאחר מכן לחץ על הפסק כדי להשהות את הלייזר. בדוק תלת -ממד והקלט את ההגדרות הרצויות (ראה שלב 4.3.1), הקש Center ולאחר מכן לחץ על בצע. פעולה זו תאסוף את הנתונים.
  4. הנמך את השלב כדי לטעון מיקום ולהוסיף 50 μl של תאים T במדיית הדמיה (100,000 תאים, משלב 2.5) dropwise ישירות מעל coverslip. מומלץ לתת טופס טיפה על קצה הפיפטה ולאחר מכן לגעת בקצה לנוזל האמבט. להעלות את השלב בחזרה על ידי לחיצה על "תמונה (לחזור)".
  5. . התחילו בהדמיה הקפד להגדיר את גודל המחסנית הרצוי באורך זמן הקפיצה. לדוגמה, התמונה 60 z-ערימות בגודל 0.4 יקרומטר שלב וקלט 500 מסגרות הזמן. (בדרך כלל) להפסיק את ההקלטה לפני 500 מסגרות מגיעים כדי להימנע photobleaching לבנה. השתמש במצב Live כדי לחפש זוגות תאים וכאשר הגדרות מוכנות ורצויות הוזנו, לחץ על הפעל כדי לאסוף נתונים. ראה סרט 1 ואיור 1 לדוגמה.

5. מעקב אחר דינמיקה של פני השטח

  1. יצא את הנתונים מתוכנת הדימות (עיין בטבלת החומרים). זה ייצור z-מחסנית TIF קבצים עבור כל נקודת זמן בכל צבע.
  2. . קודם כל, ולפרק את המידע
    הערה: אנו משתמשים בצינור הנפט LLSpy תחת רישיון על ידי מחקר בקמפוס Janelia של המחקר18, אבל deskewing ופירוק זמינים גם בתוך תוכנות דימות מרובות (ראה טבלת חומרים).
  3. . לדבליץ את הנתונים
    הערה: אנו משתמשים בתכונת הדבליץ של פיג'י עם התאמת היסטוגרמה (מסלול פיג'י: תמונה | כוונן | תיקון אקונומיקה | התאמת היסטוגרמה | בסדר).
  4. יבא לתוך תוכנת המעקב (עיין בטבלת החומרים). עקוב אחר אשכולות לפי מפרטי התוכנה. ראה סרט 2 לדוגמה.
    הערה: תוצאות המעקב יהיו תלויות בתוכנת המעקב שבשימוש, באלגוריתם שנבחר, בפרמטרים הרצויים של הפלט שנבחרו, וכו '. לדוגמה, בתוכנת המעקב שלנו (ראה את טבלת החומרים), בחרנו לאפשר לתוכנה לעקוב אחר צורות חריגות, במקום להקצות לכל תכונה נקודה אחת, מאחר שאשכולות tcr אינם מאורגנים לתחומים מושלמים. בנוסף, בחרנו לאסוף 35 פרמטרים, כולל מהירות, כיוון, נפח, עוצמה, אזור, מיקום ומעקב אחר מידע משך. עם זאת, שיטות או פרמטרים שונים יהיו מועילים לענות על שאלות שונות.
    1. אם לא רצוי לבצע מעקב, השתמש בתוסף הקול לקבלת המחשה ויצירת סרטים מנתוני היפרמחסנית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כאן, אנו מתארים את הבידוד, ההכנה, והדמיה של העכבר הראשי 5C. התאים C7 T באמצעות סריג במיקרוסקופ האור. במהלך סעיף 3, זה הכרחי ליישר את המיקרוסקופ כראוי, ולאסוף PSF היומי שבו כדי לפרק את הנתונים לאחר האוסף. באיור 2, אנו מציגים את התמונות יישור הנכון שיראו בעת יישור המיקרוסקופ. איור 2A ו- איור 2ב הצגת נתיב הקרן הנכון ויישור הקרן, בהתאמה, כאשר הם מופיעים בתמונה בפלואורואסעין. הסריקה האובייקטיבית צריכה להציג צורת X גדולה בתחזיות XZ ו-YZ שהיא סימטרית ככל האפשר; זה צריך גם להיות מותאם כדי להיות קטן של X ככל האפשר (איור 2ג). זה מושגת בעיקר על ידי התאמת הצווארון היעד הפליטה. הסריקה z galvo צריך להראות אליפסה XZ ו-XY עם נקודה אחת משני צדי (מעל ומתחת עבור XZ ו שמאלה וימינה עבור YZ) (איור 2ד). זה מושגת בעיקר על ידי התאמת הטיה galvo מראה, באופן ידני או עם ההתאמה המונעת בתוכנה. לבסוף, הן z + הסריקה האובייקטיבית ואת הסריקה לדוגמה צריך להראות נקודות שנראות עגול ככל האפשר (איור 2E ואיור 2F, בהתאמה). אלה עשויים להיות X קטן, אבל זה צריך להיות dimished ככל האפשר. אלה צריכים להיות מיושרים היטב אם הסריקה האובייקטיבית ו-z galvo היו מסודרים היטב, אבל אם יש צורך בהתאמות, הם יהיו מתנהלים בעיקר עם המראה galvo. חשוב לציין כי במהלך יישור זה, בכל פעם שהצווארון והגלבו מותאמים, המוקד (מיקרומטר מעל מטרת הפליטה) יהיה צורך לכוונן גם כן.

באמצעות פרוטוקול זה, אנו יכולים לראות את הדינמיקה ארבע-ממדית של TCRs על משטח T-cell (איור 1, סרט 1). היתרון העיקרי של מיקרוסקופ זה טמון ביכולת לעקוב אחר יחידות משטח דמיינו של TCRs, כדי להשיג נתונים כמותית מהגודל שלהם, תנועה, עוצמת אות, וכו ' (ראה לוח חומרים). סרט 2 מציג דוגמה של הרצועות שהתקבלו.

Figure 1
איור 1:4-מימדי הדמיה של T cell-APC סינפסה. (א) דוגמה ייצוגית תלת-ממדית מעידה בזמן llsm תמונות המציגות אינטראקציה תא T עם APC. המוצג הם TCR (ירוק, מתויג על ידי anti-TCR-AF488) דינמיקה בזיהוי אנטיגנים המוצגים על פני השטח של APC (אדום, ציטוסולג mCherry). סרגל קנה מידה = 5 μm. ראה גם סרט 1. (ב) הפרוסה האורתוגלית של (א). שיבוץ היא מסגרת התייחסות של תא שלם. סרגל קנה מידה = 5 μm. (ג) הפרוסה האורתוגנלית yz של (א). שיבוץ היא מסגרת התייחסות של תא שלם. סרגל קנה מידה = 5 μm. (ד) פרוסה אורתוגונלית כפולה של (א). שיבוץ היא מסגרת התייחסות של תא שלם. סרגל קנה מידה = 5 μm. ראה גם סרט 3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: יישור LLSM. (א) דפוס הקרן הרצוי לניסוי הדמיה llsm. (ב) צילום מסך של תהליך יישור הקרן; משמאל הוא חלון המיקוד המציג את הקרן המקומצמת, המתמקדת; בקצה הימני העליון הוא גרף המראה כי הקרן ממורכזת בתוך החלון; בתחתית הימנית היא מצלמת מוצא, אשר אמור להיות גם קרן דק, ממוקדת. (ג) התחזיות האינטנסיביות המרביות (mips) של חרוז על ידי סריקה אובייקטיבית. (ד) התחזיות בעוצמה מרבית (mips) של חרוז של z-galvo סריקה. (ה) הקרנות בעוצמה מקסימלית (mips) של חרוז על ידי z + סריקה אובייקטיבית. (ו) התחזיות האינטנסיביות המרביות (mips) של חרוז על-ידי סריקת דגימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Movie 1
סרט 1: מערך תא סינפסה. שני צבעים עיבוד נפח של האינטראקציה של תא T המסומן עם αTCR-AF488 (ירוק) עם מכשיר APC המבטא ציטוסולג mCherry (אדום) על 70 נקודות זמן במרווח של 1.54 s. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).

Movie 2
סרט 2: מעקב אחר תנועה דינמית של TCR. השווה עם סרט 1. אשכולות המתאימים למבני TCR גלויים מסומנים בתלת-ממד לאורך זמן עם תוכנת דימות. זנבות דרקון מראה עמדות אשכול על ארבע המסגרות הקודמות מסומנות בצבע על ידי אורך הזחה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).

Movie 3
סרט 3: פרוסות אורתוגונאליות של תא ה-סינפא. השווה עם סרט 1 ואיור 1ב-D. פרוסה אורתוגונלית כפולה של סרט 1, המציגה שαTCRβ-AF488 Fab אכן מתייג את משטח התא TCRs. שיבוץ הוא מסגרת התייחסות של תא שלם. סרגל קנה מידה = 5 μm. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול המוצג היה אופטימיזציה לשימוש של CD4+ T תאים מבודדים מ 5c. בשימוש בכלי ה-LLSM משתמשים, ולכן מערכות תאים אחרות ו-Llsm עשויים להיות ממוטבים באופן שונה. עם זאת, פרוטוקול זה מראה את העוצמה של הדמיה 4D, כפי שניתן להשתמש בו כדי לכמת את הדינמיקה של קולטן פני השטח על תא שלם עם עיוות הפחות בתנאים פיסיולוגיים. לכן, קיימים יישומים עתידיים רבים אפשריים של טכניקה זו.

צעד קריטי מאפשר לתאים להתיישב בריכוז מתאים. אם רבים מדי APCs להתיישב על שמיכות ולהיות צפוף מדי, קשה למצוא תא T כי הוא אינטראקציה עם APC אחד בלבד. כאשר תא T יש מספר סינפסות, מעקב ופרשנות של נתונים יכול להיות מסובך מאוד. באופן דומה, אם מעטים מדי יש APCs, מציאת תא T היוצר סינפסה קשה גם. בידינו, המאפשר 50,000 תאים להתפשר על 10 דקות משיגה צפיפות אופטימלית. עם זאת, בעיה זו ניתן להימנע אם באמצעות מערכת עם תאים חסיד. תאים ניתן לגדל בחממה עם שמיכות לתוך השטף הרצוי.

באופן דומה, מספר תאי T ירד לתוך המערכת תלויה בגודל של האמבטיה ואת המרחק שהם יכולים להתפזר. במערכת LLSM נעשה שימוש כאן, יש אמבטיה 12 מ ל ואמבטיה 2.5 mL, בניגוד לגרסה הקודמת של המערכת אשר רק היה 10 מ"ל אמבטיה זמין. אנו משתמשים באמבטיה 12 מ"ל עבור הדמיה fluorescein המקורי ואז לעבור לאמבטיה 2.5 mL עבור הדמיה של התאים. זה מאפשר כביסה יסודית פחות של האמבט לאחר שלב הדמיית קרן, וגם מוריד את מספר תאי T הדרושים עבור כל הפעלה הדמיה. בתורו, זה יאפשר למשתמשים לנצל פחות תאים.

מציאת תאים בנקודת המגע הנכונה היא גם אתגר. בידינו, תאים T לקחת בערך 2 דקות כדי להתיישב APCs על coverslip, אז חשוב להתחיל לחפש את הכיסויים של תאים T דינאמי קרוב APCs. שיפור גדול של זה כבר התוספת האחרונה של אור LED במצלמת מאתר. אם משתמשים במערכת ביתית, אנו ממליצים במיוחד כולל תכונה זו בעיצוב.

בסופו של דבר, אסטרטגיות תיוג פלורסנט הן שיקול חשוב אחר. לכל חלבון פלורסנט או צבע יש תשואה קוונטית שונה ושיעור של פוטוהלהלבנת. צבעי פלורסנט הם בדרך כלל בהירים יותר, אבל אם התאים התעברו באופן בלתי נשכח עם חלבון פלורסנט המכונה מולקולה, התווית היא מתחדש כמו התא ממשיך לייצר את המולקולה. לכן, התיוג האסטרטגי הוא גורם חשוב לשקול בעת עיצוב ניסויים.

אנחנו רוצים לסיים עם דיון על כיוונים עתידיים עבור הטכנולוגיה. LLSM הוא גם מסוגל מיקרוסקופית תאורה מובנית (SIM), אשר התוצאות ברזולוציה 150 ננומטר XY ו 280 nm Z החלטה, והוא לפחות 10 פעמים מהר יותר מאשר שדה שטח של SIM12. לכן, בעוד llsm מספק מהירות חסרת תקדים של הדמיה 4d, זה לא יכול להשיג את הרזולוציה המרחבית של הנוכחי טכניקות ברזולוציה סופר4,5,6. עם זאת, ניתן לשפר רזולוציה זו אם ניתן היה ליצור את האפשרות ' שלסטד LLSM '. האור בגיליון מזורז ו פליטה מגורה דלדול עם מיקרוסקופ התאורה סלקטיבי המטוס (ההיסטד-spim) כבר נוצל, אבל חוסר ברזולוציה הטמפורלית של llsm21,22,23,24. אם סטד-SPIM הותאמו לשלב סריג, יכולנו להשיג 50 ננומטר ברזולוציה עם הרבה פחות הלבנת, ואת התמונה מהר יותר מאשר הטכניקות הזמינות כעת. עם זאת, עם טכנולוגיות זמינות נוכחיות, LLSM נותן לנו את הרזולוציה הטמפורלית המהירה ביותר עם רזולוציה גבוהה בציר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

ברצוני להכיר בעצות ובהדרכה של ד ר וייז בינדוקאס באוניברסיטת שיקגו. אנו מודים למתקן הליבה של מיקרוסקופ אור משולב באוניברסיטת שיקגו לתמיכה ולשמירה על מיקרוסקופ האור הסריג. עבודה זו נתמכת על ידי NIH חדש המייצרת פרס 1DP2AI144245 ו NSF קריירה פרס 1653782 (כדי J.H.). התוכנית למלגות בוגרת NSF מקיימת בתמיכת ג'יי. פי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Syringe BD 309659 For T cell harvest
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148-25ML For T cell culture
5 mm round coverslips World Precision Instruments 502040 For Imaging
70um Sterile Cell Strainer Corning 7201431 For T cell harvest
Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR β chain Antibody BioLegend 109215 For Imaging
Fetal Bovine Serum (FBS) X&Y Cell Culture FBS-500 For T cell culture
Ficoll GE Healthcare 17-1440-02 Denisty gradient reagent for T cell harvest
Fluorescein sodium salt Sigma-Aldrich F6377 For microscope alignment
FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres Thermo Fisher Scientific F8810 For microscope alignment
Imaris Bitplane N/A Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji).
Lattice Light-Sheet Microscope 3i N/A Microscope Used
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red Thermo Fisher Scientific 21083027 For Imaging
L-Glutamine Thermo Fisher Scientific 25030-081 For T cell culture
LLSpy Janelia Research Campus N/A LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/
Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK Elimbio Custom Synthesis For T cell harvest
Penacillin/Streptamycin Life Technologies 15140122_3683884612 For T cell culture
Poly-L-Lysine Phenix Research Products P8920-100ML For Imaging
RBC Lysis Buffer eBioscience 00-4300-54 For T cell harvest
Recombinant mouse IL-2 Sigma-Aldrich I0523 For T cell culture
RPMI 1640 Medium Corning MT10040CV For T cell culture
Slidebook 3i N/A LLSM imaging software
Surgical Dissection Tools Nova-Tech International DSET10 For T cell harvest
T-25 Flasks Eppendorf 2231710126 For T cell culture
Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits Thermo Fisher Scientific 44685 For preparing Fab

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Poulter, N. S., Pitkeathly, W. T. E., Smith, P. J., Rappoport, J. Z. The Physical Basis of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy and Its Cellular Applications. Methods in Molecular Biology. 1251, Clifton, N.J. 1-23 (2015).
  2. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123, Pt 21 3621-3628 (2010).
  3. Axelrod, D. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Methods in Cell Biology. 89, Chapter 7 169-221 (2008).
  4. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3, (10), 793-796 (2006).
  5. Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313, (5793), 1642-1645 (2006).
  6. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19, (11), 780 (1994).
  7. Shroff, H., White, H., Betzig, E. Photoactivated Localization Microscopy (PALM) of Adhesion Complexes. Current Protocols in Cell Biology. 58, (1), 1-28 (2013).
  8. Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level. Molecular Cell. 58, (4), 644-659 (2015).
  9. Ji, N., Shroff, H., Zhong, H., Betzig, E. Advances in the speed and resolution of light microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 18, (6), 605-616 (2008).
  10. Erni, R., Rossell, M. D., Kisielowski, C., Dahmen, U. Atomic Resolution Imaging with a sub-50 pm Electron Probe. Available from: https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr (2019).
  11. Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. Journal of Microscopy. 254, (3), 109-114 (2014).
  12. Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. (2014).
  13. Ni, J., et al. Adoptively transferred natural killer cells maintain long-term antitumor activity by epigenetic imprinting and CD4+ T cell help. Oncoimmunology. 5, (9), 1219009 (2016).
  14. Chaudhri, A., Xiao, Y., Klee, A. N., Wang, X., Zhu, B., Freeman, G. J. PD-L1 Binds to B7-1 Only In Cis on the Same Cell Surface. Cancer Immunology Research. 6, (8), 921-929 (2018).
  15. Forbes, C. A., Scalzo, A. A., Degli-Esposti, M. A., Coudert, J. D. Ly49C-dependent control of MCMV Infection by NK cells is cis-regulated by MHC Class I molecules. PLoS pathogens. 10, (5), 1004161 (2014).
  16. Schöneberg, J., et al. 4D cell biology: big data image analytics and lattice light-sheet imaging reveal dynamics of clathrin-mediated endocytosis in stem cell-derived intestinal organoids. Molecular biology of the cell. 29, (24), 2959-2968 (2018).
  17. Gao, R., et al. Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363, (6424), New York, N.Y. 8302 (2019).
  18. Cai, E., et al. Visualizing dynamic microvillar search and stabilization during ligand detection by T cells. Science. 356, (6338), New York, N.Y. 3118 (2017).
  19. Ritter, A. T., et al. Actin Depletion Initiates Events Leading to Granule Secretion at the Immunological Synapse. Immunity. (2015).
  20. Lim, J. F., Berger, H., Su, I. -H. Isolation and Activation of Murine Lymphocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (116), e54596 (2016).
  21. Huang, J., et al. A Single Peptide-Major Histocompatibility Complex Ligand Triggers Digital Cytokine Secretion in CD4+ T Cells. Immunity. 39, (5), 846-857 (2013).
  22. Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. Direct observation of ligand recognition by T cells. Nature. 419, (6909), 845-849 (2002).
  23. Jansson, A. A mathematical framework for analyzing T cell receptor scanning of peptides. Biophysical journal. 99, (9), 2717-2725 (2010).
  24. Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nature Methods. 11, (9), 919-922 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics