גישה האכלה נוגדן כדי לחקור את הסחר בקולטן גלוטמט בתרבויות היפוקמא העיקרי ההיפוקיים

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

מאמר זה מציג שיטה לימוד קולטן גלוטמט (GluR) סחר בתרבויות היפוקמאל העיקרי הנתק. באמצעות גישה האכלה נוגדן התווית אנדודוגני או קולטנים מוגזם בשילוב עם גישות פרמקולוגית, שיטה זו מאפשרת זיהוי של מנגנונים מולקולריים הוויסות ביטוי המשטח של GluR על ידי מודולים תהליכי הפנמה או מיחזור.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Chiu, A. M., Barse, L., Hubalkova, P., Sanz-Clemente, A. An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures. J. Vis. Exp. (150), e59982, doi:10.3791/59982 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

התגובות הסלולר גירויים חיצוניים להסתמך בכבדות על הסט של קולטנים מבוטא במשטח התא ברגע נתון. בהתאם לכך, אוכלוסיית הקולטנים המתבטאת בפני השטח מסתגלת כל הזמן ובכפוף למנגנונים נוקשים של רגולציה. הדוגמה פרדיגמטי ואחד האירועים ביותר ללמד סחר בביולוגיה היא השליטה מוסדר של הביטוי הסינפטית של קולטני גלוטמט (GluRs). GluRs לתווך את הרוב המכריע של הגירוי הנוירולוגי במערכת העצבים המרכזית ושליטה על פעילות פיזיולוגית התלויים שינויים פונקציונליים ומבניים ברמות סינפטית ועצביים (למשל, הפלסטיות הסינפטית). שינויים במספר, מיקום, והרכב תת יחידת של פני השטח הביע GluRs להשפיע עמוקות על תפקוד עצבי, למעשה, שינויים בגורמים אלה קשורים neuropathies שונים. מוצג כאן הוא שיטה ללמוד סחר GluR בנוירונים היפוקמאל ההיפוסוייםהינתק. גישה "להאכלת נוגדנים" משמשת כדי להמחיש באופן מהותי אוכלוסיות GluR המתבטאים על פני השטח והקרומים הפנימיים. על ידי תיוג קולטני פני השטח על תאים חיים ותיקון אותם בזמנים שונים כדי לאפשר קולטנים endocyציטוזה ו/או מיחזור, תהליכים אלה סחר ניתן להעריך באופן סלקטיבי למד. זהו פרוטוקול רב-תכליתי שניתן להשתמש בו בשילוב עם גישות פרמקולוגית או ביטוי יתר של קולטנים משתנים כדי לקבל מידע חשוב על גירויים ומנגנונים מולקולריים המשפיעים על סחר בסמים. באופן דומה, זה יכול להיות מותאם בקלות כדי ללמוד קולטנים אחרים או פני השטח הביעו חלבונים.

Introduction

תאים לנצל את התהליך הפעיל של סחר כדי לגייס חלבונים מסוימים לוקליזציה subcellular ולהפעיל רגולציה קפדנית הרקתית על הפונקציה שלהם1. תהליך זה חשוב במיוחד עבור קולטנים טרנסקרום, כמו תגובות הסלולר גירויים סביבתיים שונים להסתמך על מפלי תאיים המופעל על ידי הפעלת הקולטן. תאים מסוגלים לשנות את התגובות הללו על ידי שינוי צפיפות, לוקליזציה, והרכב יחידת של קולטנים הביע במשטח התא באמצעות הקולטן יחידת בתקנה הסחר2. החדרת קולטנים החדש מתחת לחומרים לתוך קרום הפלזמה, יחד עם אנדוקציטוזה ומיחזור של קולטנים קיימים הם דוגמאות של תהליכי סחר הקובעים את המאגר הנקי של המשטח הביע קולטנים2. מנגנונים מולקולריים רבים משתפים פעולה כדי לווסת את סחר החלבונים, כולל אינטראקציות חלבונים בחלבון ושינויים פוסט-מפלגתיים כגון זירחון, אוביקוויציה, או פלמיטלציה2.

התקנה של סחר בקולטן נדרש במיוחד תאים מקוטב מאוד עם מבנים מיוחדים מאוד. הדוגמה פרדיגמטי היא השליטה של פונקציה עצבית על ידי סחר מוסדר של קולטני גלוטמט (glurs)3,4. גלוטמט, נוירוטרנסמיטר הגירוי העיקרי, נקשר ומפעיל משטח הביע GluRs לשלוט פונקציות נוירואליות פיזיולוגית היסוד כגון המוח הנוירוטיות והפלסטיות הסינפטית. העובדה ששינוי סחר GluR נצפתה בספקטרום רחב של neuropathies, החל בהפרעות נוירותיות למחלות ניווניות, מדגיש את החשיבות של תהליך זה5. לפיכך, הבנת האירועים המולקולריים השולטים בסחר בגלואר הוא עניין בתחומים רבים של מחקר.

בפרוטוקול זה, האכלה נוגדן שיטה מבוססת משמש כדי לכמת את רמת הקרקע ביטא GluRs בנוירונים היפוקמאל העיקרי, כמו גם להעריך כיצד שינויים הפנמה ומיחזור תוצאה ביטוי נטו הנצפים השטח. השימוש פרמקולוגיה ו/או ביטוי יתר של קולטני אקסוגני מחסה מוטציות ספציפיות הופך פרוטוקול זה גישה רבת עוצמה במיוחד לחקר מנגנונים מולקולריים בבסיס הסתגלות עצבית לגירויים סביבתיים שונים. דוגמה אחרונה של כלי השירות של פרוטוקול זה היא לימוד כיצד שינויים רב-עצרת בסביבה (כגון מודלים של מחלות) משפיעים על סחר בסמים באמצעות בחינת ביטוי המשטח במודלים כאלה.

באמצעות דוגמאות ספציפיות, זה הוכיח בתחילה כיצד מניפולציה פרמקוקולוגי מחקה גירוי פיזיולוגי (ltp כימי (cltp)] מגביר את הביטוי פני השטח של GluA1 יחידת האנדוגניים של ה-אמסוגאס-סוג של glurs (ampars) 6. הסחר של הצורה המבוטאת בצורת פוספאו-מGluN2B של NMDA-סוג של GluRs (NMDARs) מנותח גם כדי להדגים כיצד פרוטוקול זה יכול לשמש כדי ללמוד את הרגולציה של סחר GluR על ידי מסוים מיקוד שינויים. למרות דוגמאות ספציפיות אלה משמשים, פרוטוקול זה יכול בקלות להיות מוחל על GluRs אחרים וקולטנים אחרים וחלבונים בעלי תחומים מורים אנטיגניים. במקרה שאין נוגדנים זמינים עבור תחומים מגלותוניים, ביטוי יתר של אפיוליותאופ-מתויג (למשל, דגל-, Myc-, GFP-tagged, וכו ') חלבונים יכולים לסייע בתיוג חלבונים.

הפרוטוקול הנוכחי מספק הוראות לכימות צפיפות מסוג מסוים של GluR וסחר באמצעות נוגדנים ספציפיים. פרוטוקול זה יכול להיות מנוצל ללמוד 1) הכולל משטח GluR ביטוי, 2) הפנמה GluR, ו 3) מיחזור GluR. כדי ללמוד כל תהליך בנפרד, מומלץ להתחיל בסעיפים 1 ו-2 ולהמשיך בסעיף 3, 4 או 5. בכל המקרים, סיים עם סעיפים 6 ו-8 (איור 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

העבודה הקשורה הכנה התרבות הראשית נבדקה ואושרה על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת נורת'ווסטרן (פרוטוקולIS00001151).

1. הכנה לפני תיוג

  1. הכנה ואחזקה של תרביות היפוקאמאל הראשי
    1. הכנת תרבויות היפוקמאל העיקרי בצפיפות של 150,000 תאים מצופה פולי-D-ליזין-מצופה (0.1 mg/mL) 18 מילימטר לכסות משקפיים. מדריכים מצוינים להכנה לתרבות העצבית המונתק הינם זמינים7,8.
      הערה: במידת הצורך, ניתן לטפל בתרבויות האלה באמצעות מDIV1 הציטוסין (Ara-C, 10 מ"מ מ-היום) כדי למנוע התפשטות גליה בהכנה.
      הערה: ציפוי אלטרנטיבי ריאגנטים כגון fibronectin (1 מ"ג/mL) או למינציה (5 מ"ג/mL) ניתן להשתמש במקום פולי-ליזין.
    2. לשמור על תרבויות בחממה תא ב 37 ° צ' ו 5% CO2 ב 2 מ ל/טוב של מדיה נוירובסיס בתוספת עם B27 ו 2 מ"מ L-גלוטמין.
      הערה: ניתן להשתמש בתחליפים ל-L-גלוטמין (למשל גלוטמקס), במידת הצורך.
    3. על בסיס שבועי, להסיר חצי נפח של מדיה ולהחליף עם אותו כמות של מדיה נוירובסיס שיושלם.
  2. אופציונלי: העברה של מוטציה ו/או אפיפיגים מתויגים קולטנים
    הערה:
    הנוירונים צריכים להיות מזוהמים לפחות 3-4 ימים לפני נקודת הזמן ניתוח כדי לאפשר ביטוי הקולטן. השימוש בנוירונים צעירים [ימים בתוך מבחנה 6 – 9 (DIV6 – 9)] תוצאות היעילות הרבה יותר מאשר מבוגר (DIV15-20) נוירונים, אבל מספר מספיק של תאים מזוהמים (> 20) ניתן להשיג ללא קשר ל-DIV המועסקים.
    1. עבור כל באר של 12-באר צלחת, לדלל 1.5 μg של פלסטלינה המכיל את המבנה של עניין 100 μL של מדיה נוירובסיס טריים ללא B27 או תוספת גלוטמין בצינור מיקרוצנטריפוגה ומערבבים על ידי vortexing במהירות.
      הערה: לצורך העברה מוצלחת, זה קריטי כי התקשורת הנוירובבית שבשימוש הוא טרי ככל האפשר, באופן אידיאלי פחות משבוע 1 לאחר פתיחת בקבוק.
    2. ב שפופרת מיקרוצנטריפוגה השני, לערבב 1 μL של הזיהום המתאים ליפוגל ב 100 μL של מדיה נוירובסיס טרי ולערבב בעדינות.
      הערה: אין לערבולת את התערובת הכימית. שימוש בליפוטריה טרייה יכול לשפר את היעילות של הזיהום.
    3. מודאת הצינורות עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    4. מוסיפים את התערובת הכימית ליפוף לתערובת ה-DNA, מערבבים בעדינות, ו דגירה עבור 20 דקות ב RT.
    5. התאם את נפח המדיה בכל התקן ל-1 מ ל של מדיה ממוזגת.
    6. הוסף את הזיהום ליפואת-התערובת-DNA הדרוד לבאר.
    7. החזר תאים לחממה והרשה לפחות 3-4 ימים לביטוי חלבון.
      הערה: למטרות הפנמה ומיחזור פרוטוקולים המפורטים להלן, נוירונים היפוקמאל היו מנוכר ב DIV11 – 12 עם בנייה ביטוי GluN2B מתויג עם GFP בתחום החילוץ (GFP-GluN2B) ו התמונה ב DIV15 – 16.
  3. אופציונלי: דגירה של תאים עם תרופות (כרוניות או בחריפות) במדיה הממוזגת עד לקיבוע.
    הערה:
    לטיפול אקוטי, התחילו לטפל בתאים לפני תיוג. בהתאם לפרוטוקול טיפול בסמים הנמצא בשימוש, ניתן לתחזק תאים במדיה המכילה סמים במהלך סעיף 2. בדוגמה שלנו, תאים DIV21 היו כפופים פרוטוקול cLTP כדי להגדיל את פני השטח מבוטא AMPAR9.
    1. המרת מדיה ממוזגת לפתרון מסחטות (ECS).
    2. לטפל בתאים עם 300 μM גליצין ב ECS עבור 3 דקות ב RT. כפקד, לטפל שמיכות אחות עם ECS (ללא גליצין).
    3. לשטוף את התאים 3x עם 37 מעלות צלזיוס ECS ולהחזיר את התאים ECS (ללא גליצין) לחממה התא עבור 20 דקות לפני המשך עם סעיף 2.
      הערה: ecs (ב ממ): 150, 2 cacl2, 5 KCL, 10 Hepes, 30 גלוקוז, 0.001 ttx, 0.01 סטריכנין, ו0.03 picrotoxin ב-pH 7.4.

2. לחיות תיוג של משטח המתבטאת קולטנים

  1. הכנת שמיכות לתיוג
    1. כדי לשמור ריאגנטים ולהקל על מניפולציה, העברת כיסוי צד התא עד מגש הסרט מכוסה פרפין.
      הערה: זה קריטי לעולם לא לתת. לדגימות להתייבש
    2. שמור ותחזק מדיה ממוזגת ב-37 ° c לדגירה ושטיפת מדרגות.
      הערה: עבור coverslip 18 מ"מ, דגירה עם 75 – 100 μL של מדיה עבור תיוג נוגדנים 120 – 150 μL עבור הפנמה/מיחזור מומלץ.
  2. התוויות של קולטני פני השטח עם הנוגדן העיקרי
    1. התאים דגירה עם הנוגדן העיקרי מדולל במדיה ממוזג עבור 15 דקות ב RT.
      הערה: עבור קולטני GFP-מתויגים, ארנב אנטי-GFP בדילול של 1:1000 שימש. עבור אנדודוגני GluA1, העכבר נגד GluA1 בדילול 1:200 היה בשימוש.
    2. בזהירות לשאוב את המדיה המכילה נוגדן באמצעות פיפטה ואקום ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם מדיה ממוזג.
      הערה: אם המדיה הממוזגת אינה זמינה, כל שלבי הכביסה עשויים להתבצע באמצעות ה-PBS + (מלוחים באגירה (PBS) המכיל 1 מ"מ MgCl2 ו 0.1 MM cacl2]. שאיפה ידנית באמצעות מיקרופיפטה ניתן לבצע אם שאיפה ואקום עדין לא זמין.

3. ביטוי פני השטח (איור 2)

  1. נוגדן משני תיוג של קולטני משטח הביע
    1. התרחץ פעם אחת עם הערוץ המקביל.
    2. תקן את התאים על-ידי דגירה עם 4% פאראפורמלדהיד (בלסת) ו-4% סוכרוז ב-PBS במשך 7 – 8 דקות.
      הערה: בניגוד לשיטות קיבעון אחרות, כגון דגירה מתנול, לא מחלחל את קרום הפלזמה ולכן מתאים לניתוח ביטוי פני השטח. לקבלת תוצאות מיטביות, השתמש ב-לכדורגלן טרי מוכן. מקום אחסון לטווח קצר בחצי הגמר בשטח של 4 ° צ' או לטווח ארוך (עד 30 יום) בנפח של 20 ° c הוא מתירני לקיבוע נאותה.
      זהירות: מסרטן הוא ידוע. השתמש בציוד הגנה אישי תקין ובמכסה בטיחות בעת הטיפול.
    3. רוחצים את התאים שלוש פעמים עם PBS רגיל.
      הערה: לחילופין, 0.1 M גליצין ניתן להשתמש עבור כביסה בתחתית במקום PBS, כמו גליצין יהיה להרוות את כל התיקונים הנותרים שעשויים להגדיל את הרקע בהכנה.
    4. לחסום אתרי קשירה לא ספציפיים על ידי הדגירה עם 10% סרום עז רגיל (NGS) ב-PBS עבור 30 דקות ב-RT.
      הערה: ניתן להאריך את זמן החסימה ללא תופעות לוואי על תיוג.
    5. דגירה עם פלואור-מתויג נוגדן משני מדולל ב 3% NGS ב-PBS עבור 1 h ב RT כדי לסמן את הקולטנים הראשי נוגדן התווית (כלומר, משטח מבוטא).
      הערה: בדוגמאות אלה, דילול 1:500 של אלקסה 555-מצותת נוגדנים משני: עז אנטי ארנב עבור קולטנים GFP התווית ו עז נגד העכבר עבור GluA1 היה בשימוש.
    6. לשטוף את התאים עם PBS 3x.
  2. תוויות של קולטנים תאיים
    1. תאים מחלחלים עם 0.25% טריטון X-100 בערוץ הPBS במשך 5 – 10 דקות בשעה RT.
      הערה: כדי לבדוק את הסיבוב ההתחלתי של תיוג הנוגדן תופסת את כל משטח האפיסקופים, שלב זה חדירות ניתן לדלג בתרבות אחות. במקרה זה, אין אות עבור קולטנים תאיים יש להשיג. בנוסף, כדי לבדוק כי אין קולטנים פנימיים שסומנו בסעיף הקודם 2 (כלומר, מראה את השלמות של ממברנות פלזמה בתרבות), את השלב החדירות ניתן לדלג בתרבות אחות, ונוגדן עיקרי נגד חלבון תאיים (למשל, PSD-95 או MAP2) יכול להיות מנוצל בשלב 2.2.1. אין לקבל אות מראשוני זה תחת תנאים אלה. במקרה זה, שימש הארנב אנטי PSD-95 נוגדן (1:500).
    2. בלוק עם 10% NGS ב PBS עבור 30 דקות ב RT.
    3. לייבל קולטנים תאיים על ידי התאים החדירות הדגירה עם הנוגדן העיקרי זהה בשימוש בסעיף 2.2 מדולל 3% NGS ב-PBS עבור 1 h ב RT.
      הערה: דילול נוגדנים לתיוג קולטנים תאיים עשוי להיות שונה מזה נדרש עבור תיוג משטח ביטא קולטנים. בדוגמה של GluA1, שימשו את אותו דילול נוגדנים (1:200).
    4. לשטוף את התאים 3x עם PBS.
    5. תווית עם השני fluorescently מתויג משני נוגדנים מדולל ב 3% NGS ב PBS עבור 1 h ב RT.
      הערה: בדוגמאות אלה, דילול 1:500 של עז נגד עכבר אלקסה 647-מעלה נוגדן משני (עבור GluA1) שימש.
    6. לשטוף את התאים 3x עם PBS.

4. הפנמה (איור 3)

  1. הפנמה של קולטני שטח המסומנים בנוגדן
    1. לאחר תיוג של קולטנים מפני השטח ושטיפת נוגדנים (סעיף 2.2), לשמור על תאים במדיה ממוזג ללא נוגדן ולהחזיר אותם לחממה (37 ° c) כדי לאפשר הפנמה.
      הערה: עבור קולטני NMDA, מומלץ לעשות שימוש של 30 דקות עבור הפנמה. בתור שליטה, ניתן לשמור על תרבות אחות עם מדיה ממוזגת ב -4 ° c במהלך תהליך הפנמה. הפנמה קולטן מינימלית צריכה להתרחש תחת תנאים אלה.
  2. תוויות של קולטני פני השטח
    1. שטוף את התאים פעם אחת עם PBS +.
    2. תקן תאים עם 4% בכיוון הערוץ ו -4% סוכרוז ב-PBS במשך 7 – 8 דקות.
      זהירות: השתמשו בציוד הגנה אישי מתאים ובמכסה בטיחות כשאתם מטפלים בלקלטיים.
    3. לשטוף את התאים 3x עם PBS רגיל.
    4. בלוק עם 10% NGS ב-PBS עבור 30 דקות ב-RT כדי למנוע איגוד ספציפי.
    5. דגירה דגימות עם מתויג-נוגדן משני המתויג מדולל ב 3% NGS ב-PBS עבור 1 h ב RT כדי לסמן את הקולטנים הראשי נוגדן התווית (כלומר, קולטני משטח אשר לא הפנימו).
      הערה: לדוגמה זו, אלקסה 555-מצומדת עז אנטי ארנבון משני הארנב (1:500) שימש תיוג.
    6. לשטוף את התאים 3x עם PBS.
  3. תוויות של קולטני הפנימו
    1. תאים מחלחלים עם 0.25% טריטון X-100 ב PBS במשך 5 – 10 דקות.
    2. חסימת איגוד לא ספציפי על ידי דגירה עם 10% NGS ב-PBS עבור 30 דקות ב-RT.
    3. דגירה דגימות עם מתויג בקצב משני נוגדנים משנית מדולל ב 3% NGS ב PBS עבור 1 h ב RT כדי לתייג קולטנים הפנבית נוגדנים המסומנים.
      הערה: לדוגמה זו, אלקסה 647-מצומת עז אנטי ארנבון משני הארנב (1:500) משמש לתיוג.
    4. לשטוף את התאים 3x עם PBS.

5. מיחזור (איור 4)

  1. הפנמה של קולטני שטח המסומנים בנוגדן
    1. לאחר תיוג של קולטנים מפני השטח ושטיפת נוגדנים (סעיף 2.2), לשמור על תאים במדיה ממוזג ללא נוגדן ולהחזיר אותם לחממה (37 ° c) כדי לאפשר הפנמה.
      הערה: עבור קולטני NMDA, מומלץ לעשות שימוש של 30 דקות עבור הפנמה.
  2. חסימת משטח יציב הביע קולטנים
    1. כדי לחסום את האפיסקופים על הנוגדן העיקרי מצורף קולטני משטח שאינם הפנימו, מודקות תאים עם בלתי מובח Fab anti-IgG (H + L) שברי נוגדנים (נגד העיקרי המשמש בסעיף 2.2) מדולל מדיה ממוזג ( 20 μg/mL) עבור 20 דקות ב-RT. טיפול זה מונע אינטראקציה עתידית עם נוגדנים משניים.
      הערה: לדוגמה זו נעשה שימוש בקטעים Fab נגד ארנבת.
      הערה: ניסוי בקרה: כדי להבטיח כי חסימה מלאה של קולטנים מפני השטח אירעה, שמיכות האחות יכול להיות מודקרת עם ובלי Fab. תרבויות צריך להיות קבוע מיד לאחר טיפול Fab, ושתי התרבויות הן מודונות עם אלקסה 555-מצותת נוגדן משני. No 555 האות של אלקסה בתאים הFab-מודתים מציין חסימת נוגדנים נכונה.
    2. לשטוף את התאים 3x עם מדיה ממוזג.
    3. מודלת תאים עם מדיה ממוזג המכיל 80 μM dynasore כדי למנוע הפנמה נוספת ולהחזיר תאים לחממה (37 ° c) כדי לאפשר מיחזור של קולטני הפניתים. Dynasore הוא מעכב GTPase כי מעכב את הדינמיות ולכן מונע הפנמה.
      הערה: 45 דקות עבור מיחזור NMDAR מומלץ. לידיעתכם, Dynasore חוסם באופן בלעדי את תהליך הפנמה תלויי-התלות (למשל, NMDARs הפנמה). עם זאת, הפנמה של חלבון סינפטית אחרים (בלתי תלוי בעצמו) עדיין יכול להתרחש בנוכחות של Dynasore.
  3. תוויות של קולטנים ממוחזרים
    1. שטוף את התאים פעם אחת עם PBS +.
    2. תקן תאים עם 4% בכיוון הערוץ ו -4% סוכרוז ב-PBS במשך 7 – 8 דקות.
      זהירות: השתמשו בציוד הגנה אישי מתאים ובמכסה בטיחות כשאתם מטפלים בלקלטיים.
    3. לשטוף את התאים 3x עם PBS.
    4. בלוק עם 10% NGS ב-PBS עבור 30 דקות ב-RT כדי למנוע איגוד ספציפי.
    5. תווית תאים עם הראשון fluorescently מתויג נוגדן משני מדולל ב 3% NGS ב PBS עבור 1 h ב RT.
      הערה: לדוגמה זו, אלקסה 555-מצומנת (1:500) שימשו לתיוג.
    6. לשטוף את התאים 3x עם PBS.
      הערה: שוטף ארוך יותר עם PBS (5 – 10 דקות) עשוי לסייע להפחית את הרקע בהכנה.
  4. תוויות של קולטני הפנימו
    1. תאים מחלחלים עם 0.25% טריטון X-100 ב PBS במשך 5 – 10 דקות.
    2. בלוק עם 10% NGS ב PBS עבור 30 דקות ב RT.
    3. תווית עם השני fluorescently מתויג משני נוגדנים מדולל ב 3% NGS ב PBS עבור 1 h ב RT.
      הערה: לדוגמה זו, אלקסה 647-מצומנת (1:500) שימשו לתיוג.
    4. לשטוף את התאים 3x עם PBS.

6. הרכבה והדמיה של דגימות

  1. להתאים את התאים על ידי בעדינות למקם את התא הכיסויים למטה על 12-15 mL של מדיה הרכבה המתאים.
    הערה: שאיפה של מדיה להרכבה עודפת ישפר את איכות התמונות.
  2. . תאי תמונה במיקרוסקופ מתאים
    הערה: מומלץ לדמות z-מחסנית בהגדלה 60x עם שלבים 0.35 יקרומטר, המקיף את העובי כולו של תא העצב.

7. שיקולי שעון

  1. זהו פרוטוקול ארוך שניתן לעצור במספר נקודות. במקרה הצורך, לבצע חסימה והדגירה העיקרי הנוגדן שלבים לילה ב 4 ° c בחדר לח.
  2. לחילופין, אם רצונך בכך, השתמש במעבד רקמת מיקרוגל כדי להאיץ את השימוש בזמני הדגירה שלאחר הקיבוע. עבור כל השלבים, השתמש ב-150 W ב -30 ° c עבור הגדרות "On".
    1. כדי לחסום, הפעל את המעבד ב-2 דקות "On," 1 דקות "Off," ו-2 דקות "מופעל.
    2. עבור שלבים ראשיים ומשניים הדגירה הנוגדן, להפעיל את המעבד ב 3 דקות "על," 2 דקות "Off," ו 3 דקות "On."
      הערה: אנו לא צופים בהבדל באיכות על ידי הפיכת השינויים הנ ל לפרוטוקול.

8. ניתוח תמונה

  1. מומלץ להשתמש ב-פיג'י < https:/fil.sa> כדי לבצע ניתוח תמונה, כפי שהוא תואם לתבניות קובץ מרובות. עבור הנתונים שלנו, תמונות בתבנית הקובץ ND2 ניקון נרכשו.
  2. סקריפט מאקרו מסופק לכימות אצווה קלה של פרמטרים שונים שנבחרו מראש על ידי פיג'י. השלבים הבאים נכללים במאקרו:
    הערה: לדוגמאות אלה נמדד "עוצמה משולבת".
  3. פתחו את קובצי התמונה בפיג ובערוצים נפרדים.
  4. פרוייקט Z כל מחסנית ערוץ כהטלה בעוצמה מרבית.
  5. הגדר סף נמוך עבור כל אחד מהערוצים.
    הערה: יש לקבוע במידה מדעית את הספי המידע עבור כל ערכת נתונים ניסויית. בעוד שלכל ערוץ יכול להיות ערך סף תחתון נפרד, הכרחי שערכי הסף של הערוץ יישמרו בעקביות עבור כל התמונות של אותה ערכת נתונים.
  6. בחר שלוש עד חמש דנדרוטים משניים או שלישוני ושמור אותם כאזורי עניין (ROIs).
  7. למדוד את הצפיפות המשולבת של כל ROI ב פני השטח ו תאיים ערוצים.
  8. לנרמל את האות עבור כל ROI על ידי חלוקת ערך הדחיסות המשולבת של ערוץ פני השטח בערוץ תאיים.
  9. חזור על המידות עבור כל הפקדים והתמונות הנסיוניות והמשך לנרמל ערכים ניסיוניים כדי לשלוט בערכים (למשל, GluN2B WT או אי-גליצין תנאים).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול זה כדי לחקור את הסחר בקולטן גלוטמט מבוסס על תיוג דיפרנציאלי של קולטנים ביטא על פני השטח התא ואלה ביטא ממברנות פנימיים. הפרדה מושגת על ידי תיוג הקולטנים לפני ואחרי החדירות הממברנה, באמצעות הנוגדן העיקרי אותו אבל נוגדן משני מצועם שונות fluorophore. כפי שמתואר בצעדים האופציונליים כללו את הפרוטוקול, זוהי שיטה מגוונת מאוד לחקירת תהליכים שונים של סחר בקולטן, כגון הפנמה ומחזור, וניתן להתאים בקלות לצורכי החוקר (איור 1) .

ראשית, שיטה מסופק עבור כימות של קולטנים מבוטא על פני השטח העצבי. פרוטוקול זה מאפשר כימות של ביטוי משטח בסיס, כמו גם לימוד המנגנונים המולקולריים שבהם תרופות שונות או מוטציות לשנות את רמות בסיס של קולטני משטח הביע. קולטנים מפני השטח מסומנים תחילה על ידי הדגירה עם הנוגדן העיקרי והמשני לפני החדירות. לאחר החדירות עם 0.25% טריטון X-100, בריכת תאיים של קולטנים נגיש עבור תיוג נוגדנים. כדי להמחיש את הפרוטוקול הזה, פני השטח מול כתמים תאיים של קולטני אמפא (AMPARs) בתרבויות שליטה ולאחר אינדוקציה של cLTP נערך. באופן ספציפי, תאים חיים שסומנו באמצעות נוגדן נגד האפיליויוטים הGluA1 ביחידת המשנה של AMPAR, ותאים תוקנו אז עם התווית אלקסה 555-משני מצועם. התאים היו לאחר מכן החדיר ומתויג עם נוגדן אותו אנטי AMPAR ו מודבטים עם נוגדן משני מצוירים לאלקסה 647. זה תיוג כפול מאפשר ויזואליזציה ברורה של שתי אוכלוסיות GluA1.

לאחר רכישת תמונות קונפוקלית וקד, האות פלורסנט ניתן לכמת בקלות כדי להראות עלייה ביטוי פני השטח, ביחס לאוכלוסיה תאיים, לאחר cltp (איור 2a, B). כפקד, צעד החדירות היה דילג (דגירה עם 0.25% טריטון X-100) בתוך שמיכות אחות ונוגדן העיקרי היה בשימוש נגד PSD-95, סמן רגיל תאיים עבור הסינפסות מרגש. כפי שמוצג באיור 2C, אין אות עבור PSD-95 ניתן להשיג בתאים לא חדיר, הוכחת שלמות קרום הפלזמה. זה מציין כי האות שהושג עבור "פני השטח GluA1" אכן מתאים קולטנים מפני השטח (כלומר, האות לפני השטח מבוטא GluA1 אינו כולל קולטנים תאיים). חשוב מכך, אות מינימלית ל "פניGluA1" ניתן לצפות תחת תנאים שאינם חדירות, מראה כי כל האפיסקופים משטח כבושים על ידי הסיבוב הראשוני של תיוג נוגדנים (כלומר, האות עבור GluA1 תאיים אינו כולל קולטנים מפני השטח).

תהליך שנייה שניתן לבחון באמצעות פרוטוקול זה הוא הפנמה של קולטנים מפני השטח. באופן ספציפי, קולטני פני השטח מסומנים בתא חי, והנוירונים מוחזרים לחממה במשך זמן נתון כדי לעבור הפנמה קולטן על ידי clathrin מתווך בתיווך. בעקבות שלב זה, התאים הם קבועים כדי לשמר את הביטוי המרחבי של קולטנים הראשי התוויות נוגדן (כלומר, מפני השטח וקולטנים הפנימו). לאחר מכן, קולטני פני השטח (כלומר, אלה אשר לא הפנימו בתקופת העניין), מסומנים בנוגדן משני לפני החדירות. בעקבות החדירות, קולטנים כי הפנימו מסומנים על ידי נוגדן משני עם fluorophore שונים.

בפרוטוקול זה נבדק כיצד זרחון מסוים בתוך הליגלציה של PDZ וביחידת המשנה GluN2B של NMDARs (ב-S1480) גורם NMDAR הפנמה. לשם כך, התרבויות הראשיות היו מזוהמים בקולטן פוספהו-מיטיים, שבו סרין (S1480) הוחלף על ידי גלוטמט (E). המוטציה הנובעת, GluN2B S1480E, משמשת כצורה של GluN2B מבחינה חוקתית. כדי להקל על תיוג של GluN2B ולזהות את המוטציה פוספאו-מינטי, GFP שימש כתגית אפירופה על הצד המגלוני של GluN2B (GFP-GluN2B S1480E). קולטני פני השטח על תאים חיים סומנו עם נוגדן אנטי-GFP עבור 15 דקות ב RT. בשלב הבא, הנוגדן העודף נשטף באמצעות מדיה ממוזגת והחזיר את התאים ל-37 ° צ' למשך 30 דקות כדי לאפשר לאנדוקציטוזה. לאחר מכן, תאים תוקנו כדי להקפיא את תנועת הקולטן. קולטנים שנשארו על פני השטח היו מסומנים אז עם אלקסה 555-מעלה נוגדנים משני מצופנים לפני החדירות.

כדי לזהות קולטנים שהיו הפנימו במהלך הדגירה של 30 דקות, התאים היו מחלחלים, ואת קולטני הפנימו (שכבר מתויג עם נוגדן ראשוני) היו מסומנים אז עם אלקסה 647-מצומת נוגדן. שוב, זו אסטרטגיה כפולה תיוג מאפשר כימות של הפרופורציה של קולטני הפנימו. דוגמה זו מדגישה כי GluN2B זרחון ב S1480 מקדמת הפנמה קולטן, כמו מוטציה זרחן-mimetic S1480E מוצג יחס הפנמה הרבה יותר גבוה לעומת קולטני WT (איור 3A, B). בתור שליטה, תרבות אחות ב -4 ° c נשמרה בתקשורת ממוזגת בזמן הפנמה כדי להאט את התהליך. כצפוי, לא התקבל אות עבור קולטני "פנימו" בתנאים אלה (איור 3 ג).

לבסוף, פרוטוקול זה יכול להיות מנוצל כדי לבחון את מיחזור של קולטנים שפנימו בעבר. וריאציה זו של פרוטוקול היא המשך של פרוטוקול הפנמה, על ידי ביצוע הקולטנים האלה בחזרה למשטח התא. קיימים שני רכיבים קריטיים לווריאציה זו. ראשית, קולטנים אשר נותרו באופן בלתי נשכח על פני השטח במהלך הפרוטוקול כולו (כלומר, קולטנים שלא הפנימו או ממוחזרים) חייב להיות "חסום" כך שהם לא טועים עבור קולטנים ממוחזרים. כדי לעשות זאת, לפני ביצוע מיחזור צעד, הנוירונים לחיות מודגרות עם ריכוזים גבוהים של Fab כי אינטראקציה עם קולטנים העיקרי נוגדן המבוטא על פני השטח כדי למנוע כריכה נוספת של fluorophore-מעלה מצופף משני נוגדן. שנית, יש למנוע את הפנמה בשלב המיחזור, כך שקולטנים ממוחזרים אינם חוזרים על פנימו. זה נעשה על ידי הוספת dynasore לתקשורת במהלך מיחזור כמו זה בלוקים התרופה מבוססת על דינמיות כגון claמתרין-מתווכת endocyציטוזה, כגון הפנמה NMDAR ליזציה. בפרוטוקול זה, לימוד הסחר של המוטציה פוספאו-mimetic GluN2B S1480E בוצע כמו גם תיוג פני השטח של GFP-GluN2B על תאים חיים, אשר אפשרה הפנמה במהלך תקופה של 30 דקות כפי שהוסבר לפני.

לאחר מכן, קולטני פני השטח שלא הפנימו בתקופה זו נחסמו על-ידי דגירה של התאים עם Fab עבור 20 דקות ב-RT. הבא, התאים היו שוב מודבטים ב 37 ° c עבור 45 דקות כדי לאפשר עבור הפנימו בעבר GluN2B להיות ממוחזרים חזרה למשטח התא. Dynasore היה נוכח בתקשורת במהלך מיחזור שלב. קיבוע של התאים בעקבות שלב זה מאפשר זיהוי של קולטנים ממוחזרים (כלומר, אלה שאינם מסומנים ומבוטא על פני השטח התא) ו הפנימו קולטנים (כלומר, אלה הם הנוגדן העיקרי מתויג ו תאיים). על ידי 1) תיוג קולטנים ממוחזרים עם מ555 מעלה מצועם נוגדן משני לפני החדירות ו 2) הפנימו, אבל לא ממוחזר, קולטנים עם אלקסה 647-מעלה הנוגדן המשני, יחס מיחזור נוצר כדי להראות כי ל-GluN2B S1480E אין השפעה על מיחזור NMDAR (איור 4A, B). כפקד, זה היה מובטחת כי חסימה מלאה של קולטנים מפני השטח התרחשו על ידי הדגירה שמיכות האחות בנוכחות או היעדרות של Fab, ואחריו באמצעות קיבעון בחצי הגמר. כפי שמוצג באיור 4C, ניתן לצפות באות חזק לGluN2B בפני השטח בהעדר חסימה Fab. האות הזה נעלם בתרבויות מטופלים Fab, ומוכיחים שהפרוטוקול החוסם מספיק כדי לחסום לחלוטין את האפיסקופים המובטאים על פני השטח וכי אותות פני השטח הנצפים לאחר מיחזור אכן מתאימים לקולטנים הנסחרות בחזרה ל קרום הפלזמה.

Figure 1
איור 1: סכמטית של וריאציות הפרוטוקול כדי ללמוד משטח קולטן הביטוי, הפנמה קולטן (endocyציטוזה), ומיחזור קולטן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: cLTP מגביר את ביטוי פני השטח של GluA1. נוירונים היפוקמאל הראשי ב DIV21 היו חשופים LTP כימיים (cLTP) על ידי הדגירה עם גליצין-המכיל ECS. תיוג ברור של משטח מבוטא (אדום) לעומת התאיים (כחול) אוכלוסיות GluA1 חושף את העלייה צפוי ביטוי פני השטח של AMPAR. (A) מטוס יחיד ו (ב) Z-מוערמים (הקרנת עוצמה מקסימלית) מיקוד תמונות. סרגל ברים = 50 יקרומטר (תא שלם) או 5 יקרומטר (דנדט). Graph מציג את ביטוי המשטח המוגבר של GluA1 לאחר פרוטוקול cLTP. אינדקס ביטוי פני השטח: קולטנים משטח/תאיים (n = 3; מספר התאים: con = 7; cLTP = 7; ערכים מייצגים ממוצע ± SEM; * * * * p < 0.0001 באמצעות מבחן מאן-ויטני U). (ג) ניסוי בקרה שבו המערכת דילגה על צעד החדירות. בנוסף על פני השטח ו GluA1 פנימי, מסמן סינפטית תאיים מרגש PSD-95 הוערך. סרגל ברים = 50 יקרומטר (תא שלם) או 5 יקרומטר (דנדט). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: זירחון של GluN2B ב S1480 מקדמת הפנמה NMDAR. נוירונים היפוקמאל הראשי היו מזוהמים עם או GFP-GluN2B WT או מוטציה זרחן-מינטי-GluN2B S1480E על DIV11-12. בעקבות 3-4 ימים של ביטוי חלבון, משטח GFP היה מתויג על תאים חיים עם הארנב אנטי GFP בתאי ותאים הוחזרו אז 37 ° צ' כדי לאפשר הפנמה קולטן על ידי אנדוקציטוזה. קולטני-משטח בעלי הקרקע היו מודמיינו עם אלקסה 555-נוגדן משני מעלה, ואת האוכלוסייה הפנפנינית שזוהתה לאחר החדירות באמצעות הנוגדן באמצעות אלקסה 647. בשביל הבהירות, פני השטח GFP-GluN2B הוא מדומה בירוק הפנפניב-GluN2B בצבע לבן. (A) מטוס יחיד ו (ב) Z-מוערמים (הקרנת עוצמה מקסימלית) מיקוד תמונות. סרגל ברים = 50 יקרומטר (תא שלם) או 5 יקרומטר (דנדט). גרף מראה את הפנמה מוגבה המוצגת על ידי המוטציה פוספאו-מינטי GluN2B S1480E. מדד הפנמה: קולטנים פניתים/קולטנים על פני השטח (n = 6; מספר התאים: WT = 34; S1480E = 28; ערכים מייצגים ממוצע ± SEM; p < 0.001 באמצעות מבחן מאן-ויטני U). (ג) ניסוי בקרה בו התבצע הצעד הפנמה (כוונת) ב -4 ° c. סרגל ברים = 50 יקרומטר (תא שלם) או 5 יקרומטר (דנדט). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: זירחון של GluN2B ב S1480 אינו משנה את מחזור NMDAR. נוירונים היפוקמאל הראשי היו מזוהמים עם או GFP-GluN2B WT או פוספאו מינטי-מוטציה GFP-GluN2B S1480E על DIV11-12 כפי שמוצג באיור 3. בעקבות 3-4 ימים של ביטוי חלבון, משטח GFP היה מתויג על תאים חיים עם הארנב אנטי GFP בתאי ותאים הוחזרו אז 37 ° צ' כדי לאפשר הפנמה קולטן על ידי אנדוקציטוזה. משטח שנותר הביע קולטנים נחסמו על ידי דגירה הFab ומיחזור הורשו עבור 45 min. משטח זמין הביע קולטנים אקסוגני (ממוחזר) היו מדמיינו עם אלקסה 555-מעלה מעלה נוגדן משני, ואת הפנפניאה אוכלוסיה המזוהה לאחר החדירות באמצעות מ647 הנוגדנים של אלקסה. בשביל הבהירות, פני השטח GFP-GluN2B הוא מדומה בלבן הפניבGluN2B-מדומה בצבע ירוק.  (א) מישור יחיד ו-(ב) Z-מוערמים (הטלה בעוצמה מקסימלית) תמונות קונפוקלית וקד. סרגל ברים = 50 יקרומטר (תא שלם) או 5 יקרומטר (דנדט). גרף מראה את היעדר השפעה GluN2B S1480 זירחון יש על מיחזור. מיחזור אינדקס: קולטנים ממוחזרים/קולטני הפנפניט (n = 5; מספר התאים: WT = 27; ב) S1480E = 24; ערכים מייצגים ממוצע ± SEM; נ = לא משמעותי באמצעות מבחן מאן-ויטני U). (ג) ניסוי בקרה שבו המערכת דילגה על שלב הדגירה החיובי לחסימת האפיסקופים המתבטאת בפני השטח. סרגל ברים = 50 יקרומטר (תא שלם) או 5 יקרומטר (דנדט). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

האינטראקציה בין תא לסביבתו (למשל, תקשורת עם תאים אחרים, תגובה לגירויים שונים וכו '), נשענת בכבדות על ביטוי נכון של קולטנים במשטח התא. התקנה המהירה והטובה ביותר של תוכן הקולטן לפני השטח מאפשרת תגובה תאית נאותה לסביבה שמשתנה ללא הרף. במקרה מסוים של נוירונים, שינויים במספר, לוקליזציה, והרכב יחידת של synaptically הביעו קולטנים המשפיעים בכבדות תקשורת סינפטית, פלסטיות סינפטית, synaptogenesis, ו גיזום סינפטית3, 5,10. לכן, ניתוח מדויק של הביטוי משטח הקולטן ואת המנגנון הבסיסי שלה הרגולציה הוא נושא חשוב של מחקר.

קיימות מספר שיטות שבהן ניתן לחקור את ביטוי משטח הקולטן. באופן כללי, אלה נופלים תחת שלוש קטגוריות עיקריות: (i) הבידוד הביוכימי של פני השטח הביע אוכלוסיית הקולטן, (ii) טכניקות הדמיה כדי להמחיש קולטנים על פני השטח, ו (iii) טכניקות פונקציונלי לפקח על ההשלכות של קולטן הפעלה. גישות אלה הן משלימות יכול להיות מנוצל ביחד כדי לענות על שאלות ספציפיות על ביטוי פני השטח של קולטנים.

דוגמאות של בידוד ביוכימיים של פני השטח המתבטאים כוללים פרוטוקולים ביונילציה בתאים מתורבתים או פרוסות מוח ומשבר בתאי משנה של תאים מתורבתים או רקמה11. ביולציה פני השטח מבוסס על תיוג של קולטנים מפני השטח עם ביוטין על ידי דגירה של תרבויות עם אסתר מופעל ביוטין. קבוצת אסתר מגיבה עם קבוצות אמיניות ראשיות (-NH2) כדי ליצור קשרים אמיד יציב. מכיוון שניתן להתאים את החלבון לתאים, רק חלבונים בעלי משטח מסומנים באמצעות biotin. לאחר לפירוק הסלולר באמצעות דטרגנטים, לקולטן התווית יכול להיות התאושש על ידי הדגירה של התא ליפוסט עם חרוזים agarose מצותמים כדי אבידין או המשתנים שלה אשר יש זיקה חזקה biotin, ולאחר מכן הוערך על ידי חיסוני. שבירה משנית היא פרוטוקול ביוכימיים העושה שימוש בכמה צעדים צנטריפוגה כדי לבודד תאי קרומי סלולריים שונים המבוססים על צפיפויות שונות שלהם12. שתי הטכניקות שימושיות לכמת שינויים ביטוי פני השטח של חלבונים אנדוגניים וניתן להשתמש בשילוב עם גישות פרמקולוגית (הן בvivo והן בתרבות) כדי לקבוע כיצד מניפולציות מולקולריות משפיעות על ביטוי פני השטח של קולטנים. הם שימושיים במיוחד משום ששינויים בקולטנים אנדוגניים מרובים, ביחס לתקן, ניתן לכמת בו זמנית. עם זאת, בניגוד לדרכי הדמיה, כגון זה המתואר בפרוטוקול זה, הרזולוציה המרחבית אובדת באמצעות עיבוד ביוכימיים של דגימות.

הפרוטוקול המתואר כאן שייך לקטגוריית טכניקות ההדמיה. זו קבוצה של גישות (כגון תיוג פני השטח והדמיה של התא החי של מתויג fluorescently אופן מוגזם חלבונים) הם שימושיים לתת רזולוציה זמן ביטוי פני השטח של קולטנים. למשל, על ידי בחינת פני השטח מול ביטוי תאיים של AMPAR, כפי שניתן לבחון בעבר, אפשר לבדוק כיצד שינויים בביטוי מבוטא הדנדריטים (תא הביולוגי של עניין זה יישום מסוים). כמו שבירה ביוכימית, ניתן להשתמש בסמים בעזרת טכניקות דימות כדי לקבוע את ההשפעות של הסם על ביטוי פני השטח. בנוסף, העברה של נוירונים עם קולטנים המכילים שינויים (מוטציות או תגים) עוד מרחיב את האפשרויות להדמיה. הזיהום עם קולטני מוטציה יכול להתוות את ההשפעות של מוטציה מסוימת על פני השטח הביטוי.

גישה שימושית נוספת כדי להמחיש הסחר בקולטן היא מיקרוסקופ הדמיה חיה לאחר הדלקת של התרבויות הראשיות עם בנייה מתויג fluorescently כגון Superהמילורין טיק pHluorin (ספטמבר)-או אחרים fluorescently-מתויג בונה13. ספ-מתויג קולטנים יכול להיות שימושי במיוחד עבור משטח לימוד הביע קולטנים, כמו fluorophore זה יהיה רק fluor, כאשר נחשפים למדיום החילוץ. כמו דוגמאות קודמות, גישות תרופתי ניתן להשתמש, או מוטציות שנעשו על הקולטן, כדי לקבוע אם אלה לשנות את מאפייני הביטוי פני השטח של הקולטן. במקרה של סמים, הדמיה של תא חי יכולה לשמש לניטור השינויים בביטוי פני השטח בזמן אמת. מגבלה על הדמיה חיה היא חוסר תובנה מכניסטית לשינויים בביטוי פני השטח. לדוגמה, ביטוי משטח שצומצם עשוי להיות תוצאה של הפנמה מוגברת של הקולטן, מיחזור קולטן מופחת או שניהם.

כדי לענות על שאלה זו, ניתן להשתמש בפרוטוקול המתואר לעיל. עוד אירוע הסחר החשוב שיכול להיות ניטור באמצעות גישות הדמיה חיה היא דיפוזיה לרוחב של קולטנים בין תאים שונים בקרום פלזמה (למשל, בין האתרים הסינפטית והחוץ הסינפטית). במקרה זה, את הטכניקה של הבחירה היא השימוש בגישות מעקב חד חלקיקים שבו nanocrystal וליך למחצה פלואורסצנטית [i.e., נקודה קוונטית (QD)] מחוברת לנוגדן נגד אפירופה מיורית על חלבון הריבית. QDs מאופיינים ביציבות יוצאת דופן (המאפשר הרבה פחות הלבנה מאשר חלבונים פלורסנט מסורתיים), בהירות חזקה, ואת האלאומה בין מעמד/כיבוי ("מהבהב"). באמצעות הגדרות המיקרוסקופ המתאים, ניתן לעקוב אחר התנועה של QD יחיד (ולכן, חלבון יחיד של עניין) דרך קרום פלזמה הסלולר14.

הפרוטוקול הנוכחי מספק בדיקה של קולטנים באוכלוסיית פני השטח, הפנפנינה ואוכלוסיה ממוחזרת, ומאפשר חישוב של יחסי הגודל כדי לקבוע כיצד תהליכים אלה שולטים בביטוי פני השטח הכולל. יתרה מזאת, עצירת הפנמה או תהליכי המיחזור בנקודות זמן שונות מוסיפה רזולוציה טמפורלית. שיטה זו, לכן, מאפשרת לימודי הבעות פנים מפני השטח. בניגוד טכניקות הדמיה אחרות, רמות ביטוי משטח אנדוגניים ניתן גם ללמוד (למשל, AMPAR), בתנאי קיים נוגדן נגד החלק המולא של הקולטן. עם זאת, מאחר ששיטה זו דורשת קיבעון של תאים, היא אינה תואמת לדימות של תא חי ולכן אינה יכולה לספק מידע בזמן אמת.

לבסוף, גישות פונקציונלי כמו אלקטרופיזיולוגיה15 או סידן הדמיה16 הם חזקים, אם כי לעתים קרובות עקיף, נימוסים כדי ללמוד את הביטוי פני השטח של קולטנים. שיטות אלה מבוססות על כימות של שינויים פונקציונליים בתא לאחר הפעלת הקולטן (למשל, שינוי פוטנציאל ממברנה או ריכוז סידן). שימוש פרמקולוגיה כדי לבודד את התגובה של קולטן נתון, שיטות אלה מאפשרים הערכה של קולטנים מבוטא במשטח התא בצורה מדויקת, באופן מדויק וזמני. שיטות אלו הן רב-תכליתיות ומאפשרות לחקר תאים בתרבות ובתנאים פיזיולוגיים יותר לשעבר vivo (למשל, פרוסות מוח חריפה) ובvivo. עם זאת, כמו במקרה של גישות הדמיה חיה, מידע מכונאי מחמיץ לעתים קרובות כאשר משתמשים בגישות פונקציונלי.

לסיכום, שילוב של טכניקות כדי ללמוד משטח הקולטן הביטוי יכול להיות מועסק כדי להבין באופן מלא איך ביטוי פני השטח נשלטת. הפרוטוקול המוצג כאן הוא חזק במיוחד כפי שהוא מספק הבנה מכניסטית של ביטוי המשטח הזמני של קולטנים בתרבויות הראשיות שאינן מקבילות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

אנו מודים למרכז הצפון מערבי למיקרוסקופיה מתקדמת לשימוש במיקרוסקופ הconfocal של ניקון A1 ובעזרתם בתכנון ובניתוח הניסויים. מחקר זה נתמך על ידי כלאמים (T32GM008061) (א. מ. ג.), ו-NIA (R00AG041225) ומענק החוקר הצעיר NARSAD מן המוח & התנהגות המחקר הקרן (24133) (א. ס.-ג.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 mm dia. #1.5 thick coverglasses Neuvitro GG181.5
Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary Life Technologies A21424
Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary Life Technologies A21429
Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary Life Technologies A21236
Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary Life Technologies A21245
B27 Gibco 17504044
CaCl2 Sigma C7902
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates Corning 3513
Dynasore Tocris 2897
Glucose Sigma G8270
Glycine Tocris 0219
Goat anti-rabbit Fab fragments Sigma SAB3700970
HEPES Sigma H7006
KCl Sigma P9541
L-Glutamine Sigma G7513
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
Mouse anti-GluA1 antibody Millipore MAB2263
NaCl Sigma S6546
Neurobasal Media Gibco 21103049
NGS Abcam Ab7481
Parafilm Bemis PM999
PBS Gibco 10010023
Pelco BioWave Ted Pella 36500
PFA Alfa Aesar 43368
Picrotoxin Tocris 1128
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma P7280
ProLong Gold Antifade Mountant Life Technologies P36934
Rabbit anti-GFP antibody Invitrogen A11122
Rabbit anti-PSD-95 antibody Cell Signaling 2507
Strychnine Tocris 2785
Sucrose Sigma S0389
Superfrost plus microscope slides Fisher 12-550-15
Triton X-100 Sigma X100
TTX Tocris 1078

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Enns, C. Overview of protein trafficking in the secretory and endocytic pathways. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 15, Unit 15 11 (2001).
  2. Bedford, F. K. Encyclopedia of Neuroscience. Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. Springer Berlin Heidelberg. 3385-3389 (2009).
  3. Diering, G. H., Huganir, R. L. The AMPA Receptor Code of Synaptic Plasticity. Neuron. 100, (2), 314-329 (2018).
  4. Lussier, M. P., Sanz-Clemente, A., Roche, K. W. Dynamic Regulation of N-Methyl-d-aspartate (NMDA) and alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic Acid (AMPA) Receptors by Posttranslational Modifications. The Journal of Biological Chemistry. 290, (48), 28596-28603 (2015).
  5. Traynelis, S. F., et al. Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function. Pharmacological Reviews. 62, (3), 405-496 (2010).
  6. Molnar, E. Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22, (5), 506-513 (2011).
  7. Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  8. Nunez, J. Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats. Journal of Visualized Experiments. (19), (2008).
  9. Lu, W., et al. Activation of synaptic NMDA receptors induces membrane insertion of new AMPA receptors and LTP in cultured hippocampal neurons. Neuron. 29, (1), 243-254 (2001).
  10. Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. Diversity in NMDA Receptor Composition: Many Regulators, Many Consequences. The Neuroscientist: A Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry. 19, (1), 62-75 (2013).
  11. Tham, D. K. L., Moukhles, H. Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
  12. Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient. Journal of Visualized Experiments. (91), e51896 (2014).
  13. Makino, H., Malinow, R. AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis. Neuron. 64, (3), 381-390 (2009).
  14. Bailey, D. M., Kovtun, O., Rosenthal, S. J. Antibody-Conjugated Single Quantum Dot Tracking of Membrane Neurotransmitter Transporters in Primary Neuronal Cultures. Methods in Molecular Biology. 1570, 165-177 (2017).
  15. Trussell, L. Recording and analyzing synaptic currents and synaptic potentials. Current Protocols in Neuroscience. Chapter 6, Unit. Chapter 6, Unit 6 10 (2001).
  16. Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM. Journal of Visualized Experiments. (23), e1067 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics