Adoptiv immunterapi av iNKT-celler i glukos-6-fosfatisomeras (G6PI)-inducerad RA Möss

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Detta protokoll använder G6PI blandade peptider för att konstruera reumatoid artrit modeller som är närmare den mänskliga reumatoid artrit i CD4+ T celler och cytokiner. Hög renhet invariant naturlig mördare T-celler (främst iNKT2) med specifika fenotyper och funktioner erhölls genom in vivo induktion och in vitro rening för adoptiv immunterapi.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Meng, M., Chen, S., Gao, X., Liu, H., Wang, Y., Zhang, J., Dou, H., Li, W., Chen, D. Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase (G6PI)-Induced RA Mice. J. Vis. Exp. (155), e60048, doi:10.3791/60048 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Reumatoid artrit (RA) är en komplex kronisk inflammatorisk autoimmun sjukdom. Patogenesen vid sjukdomen är relaterad till invariant naturliga mördare T (iNKT) celler. Patienter med aktiv RA presenterar färre iNKT-celler, defekt cellfunktion och överdriven polarisering av Th1. I denna studie, en RA djurmodell fastställdes med hjälp av en blandning av hGPI325-339 och hGPI469-483 peptider. INKT-cellerna erhölls genom induktion och in vitro-rening, följt av infusion till RA-möss för adoptivimmunterapi. Den in vivo imaging system (IVIS) spårning visade att iNKT celler huvudsakligen distribuerades i mjälte och lever. Dag 12 efter cellbehandling avtog sjukdomsprogressionen signifikant, de kliniska symtomen lindrades, överflödet av iNKT-celler i brässökade, andelen iNKT1 i brässminskade och nivåerna av TNF-α, IFN-γ och IL-6 hos serumet minskade. Adoptiv immunterapi av iNKT-celler återställde balansen i immunceller och korrigerade den överdrivna inflammationen i kroppen.

Introduction

Reumatoid artrit (RA) är en autoimmun sjukdom som kännetecknas av kronisk, progressiv invasivitet med 0,5–1% incidens1,2. Den underliggande patogenesen tillskrivs den onormala spridningen av autoreaktiva CD4+ och CD8+ T-celler, manifesteras av en ökning av andelen CD4+IFN-γ+ och CD4+IL-17A+ T-celler, och det minskade antalet CD4+IL-4+ och CD4+CD25+FoxP3+ T celler. Därför ökar utsöndrandet av inflammatoriska cytokiner, och en överdriven inflammatorisk reaktion förstör den inhemska balansen och toleransfunktionen i kroppens immunsystem. Dessutom, hjälparen T-lymfocyter (Th) 1 celler som tränger in i leden förvärra den inflammatoriska reaktionen och ledskador. Därför är hämning av överdriven inflammatorisk reaktion och återställande av immuntolerans och immunbalans nyckeln till behandling av RA3,4.

INKT-cellerna har både NK-cell- och T-cellfunktioner och egenskaper. INKT-cellerna hyser en distinkt, invariant T-cellsreceptor (TCR) α-kedja med begränsad TCR β-kedja repertoar5 och känner igen glykolipidantigenet som presenteras av det större histokompatibilitetskomplexet (MHC) klass I-molekylen CD1d på ytan av de antigenpresenterande cellerna. Mitsuo et al.6 upptäckte ett stort antal iNKT-celler och funktionella defekter vid många autoimmuna sjukdomar, inklusive RA. Aurore et al.7 visade att iNKT-celler har en positiv effekt på att upprätthålla autoimmun tolerans och att när antalet och funktionen hos iNKT-celler återställs lindras sjukdomen. Dessutom fann Miellot-Gafsou et al.8 att iNKT celler inte bara upphävs sjukdomen utan också ökat utvecklingen av sjukdomen. Dessa motstridiga resultat tyder på att iNKT-celler är heterogena T-celler, och funktionen hos olika undergrupper kan vändas. I en klinisk studie av RA korrelerade frekvensen av iNKT-celler med poängen för sjukdomsaktiviteten9. Resultaten bekräftade också att frekvensen av iNKT minskade hos RA-patienter, antalet CD4+IFN-γ+ T-cellundergrupper ökade och sekretoriska nivåer av inflammatoriska cytokiner IFN- γ och TNF- α ökade10,11. Dessutom undersökte Sharif et al.12 typ 1-diabetes (T1D) och fann att selektiv infusion av iNKT-celler uppreglerade uttrycket av den inflammatoriska cytokinEN IL-4, bibehållen immuntolerans och förhindrade utvecklingen av typ 1-diabetes. Därför ökar adoptivinfusion av specifika iNKT-celler eller riktad aktivering av iNKT-celler nivån av iNKT-celler hos RA-patienter, vilket kan vara ett genombrott vid RA- behandling.

Cellulär immunterapi är för närvarande av stort intresse och har använts i stor utsträckning i cancerbehandling. INKT-celler är dock sällsynta, heterogena immunoregulatory celler (endast 0,3% av det totala antalet PBMCs)13, vilket begränsar potentiella kliniska tillämpningar. Dessa celler är huvudsakligen indelade i tre subpopulationer: 1) iNKT1 celler, som har ett högt uttryck för promyelocytisk leukemi zink-finger protein (PLZF) och T-box transkription faktor (T-bet); 2) iNKT2 celler med mellanliggande uttryck för PLZF och GATA bindande protein 3 (GATA3); 3) iNKT17-celler med lågt uttryck för PLZF och retinoidrelaterad särnukleär receptor (ROR)-γt som utsöndrar IFN-γ, IL-4 och IL-1714. Aktiverade iNKT-celler utsöndrar Th1, Th2 och Th17-liknande cytokiner, som bestämmer de olika immunmodulerande effekterna av iNKT-celler15. Immunmodulerande och immunoterapeutiska effekterna av specifik aktivering av olika subpopulationer av iNKT celler är olika. Därför kan valet av specifika fenotyper av iNKT-celler (främst iNKT2) med antiinflammatoriska funktioner för att reglera kroppens immunsvar korrigera immunobalansen och immunsjukdomarna i RA.

Inrättandet av en idealisk djurmodell är av stor betydelse för behandling och studier av RA patogenes. För närvarande, de vanligaste och mogna djurmodeller inkluderar kollagen-inducerad artrit, adjuvans artrit, zymosan-inducerad artrit, och polysackarider-inducerad artrit1617. Det finns dock ingen modell som helt kan simulera alla funktioner i mänskliga RA. Typ II kollagen-inducerad artrit (CIA) är en klassisk artrit modell. CIA induceras av immunisering av möss med typ II kollagen-specifika monoklonala antikroppar, vilket återspeglar antikroppsberoendet av denna sjukdommodell. Benurs et al. beskrev en modell med ett systemiskt immunsvar mot glukos-6-fosfatisomeras (G6PI), som inducerar perifer symmetrisk polyartrit i känsliga musstammar18,19. I denna modell beror utvecklingen av artrit på T-celler, B-celler och medfödd immunitet18,19,20. Horikoshi21 fann att RA-modeller till följd av immunisering av DBA/1 möss med G6PI polypeptidfragment är mer lika mänskliga RA i termer av CD4+ T-celler och cytokiner (dvs IL-6 och TNF-α) än CIA-modellerna. För att öka den stimulerande effekten på TCR erkännande webbplats, blandade polypeptid fragment av G6PI (hGPI325-339 och hGPI469-483) användes för att vaccinera DBA/1 möss för att konstruera RA musmodell. Framgången för detta tillvägagångssätt kan hög eftersom hGPI325-339 och hGPI469-483 är immundominanta för I-A q-begränsad T-cell svar. Därför kan denna modell simulera överproliferation av CD4+ T-celler och iNKT celldefekter hos RA-patienter22. Den grundläggande forskningen av RA immunopathology lade grunden för vår ytterligare fördjupade undersökning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla experimentella möss (totalt 150) var friska manliga DBA/1 möss, 6–8 veckor gamla (20,0 ± 1,5 g), som växte upp i en specifik patogenfri miljö (SPF). Det finns ingen särskild behandling före modellering. Experimentet delades in i en hälsosam kontrollgrupp (15 möss), en modellkontrollgrupp (15 möss) och en cellterapigrupp (55 möss). Denna studie godkändes av Hebeis universitets djurskydds- och etikkommitté.

1. Konstruktion av sjukdomsmodellen

  1. Duplicera RA djurmodell
    1. Väg 1,75 mg av både hG6PI 325-339 och hG6PI 469-483 fragment och lös upp dem i 5,25 ml av 4 °C trippeldestillerat vatten.
    2. Lös upp fullständig Freunds adjuvans (CFA) i ett 50 °C vattenbad, dra 5,25 ml i ett annat 10 ml centrifugrör och kyl det för användning.
    3. Lägg blandningen av hG6PI-lösning och CFA-lösning i en konstgjord emulgeringsenhet med två glassprutor anslutna.
    4. Tryck sprutan med en konstant hastighet och frekvens på 10–20x per min för att helt emulgera den blandade peptidlösningen och CFA-lösningen. Utför operationen i ett isbad och förvara emulsionsdropparna i vattnet i 10 min efter slutförandet av emulgeringen utan spridning.
    5. Injicera 150 μL emulgerat hG6PIs i musens svansrot subkutant.
    6. Injicera 200 mg Pertussis toxin i musen intraperitonealt vid 0 h och 48 h efter hG6PI injektion.
  2. Experimentell verifiering av RA-modellen
    1. Mät tjockleken på musens tass med en Vernier ok (2x per dag).
    2. Observera och markera graden av rodnad och svullnad i foten. Använd följande bedömningskriterier: 1) tår med mild svullnad; 2) dorsum pedis och fotdyna med klar röd svullnad; 3) fotled med röd svullnad.
    3. Avliva mössen under djup anestesi genom intraperitoneal injektion av 1% natrium pentobarbital (50 mg/kg kroppsvikt) 14 dagar efter modellering och ta bort tassarna för HE färgning.
    4. Bestäm sekretionnivåerna för serum IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, TNF-α och IFN-γ med hjälp av en kommersiell cytometrisk pärlmatris (CBA) enligt tillverkarens protokoll.

2. Erhålla iNKT celler med adoptivcellulär terapi

  1. Riktad induktion av iNKT-celler
    1. Injicera normala möss intraperitonalt med α-GalCer (0,1 mg/kg kroppsvikt).
  2. Isolering av iNKT-celler
    1. Tre dagar efter modellering, injicera möss intraperitoneally med 1% natrium pentobarbital (50 mg/kg kroppsvikt) för anestesi. Tillräckligt söte möss visar inte en baktas tillbakadragande svar på en tå nypa.
    2. Isolera mjälten av en DBA/1 mus efter att ha injicerat den intraperitonalt med α-GalCer. Förbered en enda cell suspension genom att skära och mala mjälte i en 200 mesh sikt.
    3. Tvätta cellsuspensionen med PBS, centrifug vid 200 x g i 5 min och kassera supernatanten. Upprepa.
    4. Omblanda cellerna med 1 ml helblods- och vävnadsutspädningslösning. Tillsätt 3 ml mus lymfocyt separation medium, och sedan centrifug cellerna i 20 min vid 300 x g vid rumstemperatur.
    5. Samla lagret av mjölkiga vita lymfocyter (dvs. det andra lagret från toppen), tvätta den 2x med PBS, och räkna med en automatiserad cellräknare.
  3. Magnetisk aktiverad cellsortering (MACS)positiv urvalsstrategi för rening av iNKT-celler
    OBS: För förbehandling av CD1d-tetramerer späddes 1 mg/ml α- galcer till 200 μg/ml med 0,5 % tween-20 och 0,9 % av NaCl och 5 μL av den resulterande lösningen tillsattes till 100 μl av CD1d tetramer-lösningen. Blandningen inkuberades i 12 timmar i rumstemperatur och placerades vid 4 °C för användning. TCR β späddes ut 80x med avjoniserat vatten. Alla andra antikroppar användes som en stamlösning.
    1. Omblanda 107 celler med 100 μl 4 °C PBS, tillsätt 10 μl α-GalCer-belastad CD1d Tetramer-PE och inkubera dem vid 4 °C i 15 min i mörkret.
    2. Tvätta cellerna 2x med PBS och blanda om dem i 80 μl PBS.
    3. Tillsätt 20 μL anti-PE-MicroBeads och inkubera dem vid 4 °C i 20 min i mörkret.
    4. Tvätta dem 2x med PBS och blanda om cellerna med 500 μl PBS.
    5. Placera sorteringskolonnen i det magnetiska fältet på MACS-sorteraren och skölj med 500 μl PBS.
    6. Lägg till cellsuspensionen från steg 2.3.4 i sorteringskolumnen, samla in flowthrough och skölj 3x med PBS-buffert.
    7. Ta bort magnetfältet och samla in cellerna från sorteringskolumnen. Lägg vid det här laget 1 ml PBS-buffert till sorteringskolonnen och tryck snabbt kolven vid ett konstant tryck för att driva de märkta cellerna till samlingsröret och få renade iNKT-celler. Räkna med en automatiserad cellräknare.
  4. Identifiering av iNKT-cellfenotyp
    1. Ta 1 x 106 celler från steg 2.2.5 respektive 2.3.7 och omfördela dem i 50 μL PBS.
    2. Antikroppsinkubation: Tillsätt inte antikroppen i det negativa kontrollröret, tillsätt inte 0,5 μL α-GalCer-PE-CD1d Tetramer eller 10 μl FITC-TCR β i det enda positiva kontrollröret. Tillsätt 0,5 μL α-GalCer-PE-CD1d tetramer och 10 μl FITC-TCR β i provröret. Inkubera dem vid 4 °C i 30 min i mörkret.
    3. Tvätta cellerna i PBS och sedan centrifug vid 200 x g i 5 min.
    4. Kassera supernatanten, tillsätt 1 ml Foxp3 Foxation/Permeabilization arbetslösning och inkubera cellerna i 45 min vid 4 °C i mörkret.
    5. Tillsätt 1 ml 1x permeabilisering Buffertarbetslösning och centrifugera cellerna vid rumstemperatur i 500 x g vid rumstemperatur i 5 min.
    6. Kasta supernatanten. Tillsätt 1 μL Alexa Fluor 647 mus Anti-PLZF och 1 μL PerCP-Cy 5,5 mus anti-T-bet (eller 1 μL PerCP-Cy 5,5 mus anti-RORΥt) i 30 min vid rumstemperatur i mörkret.
    7. Lägg till i 2 ml Permeabilisering Buffert arbetslösning för rengöring.
    8. Kassera supernatanten, omblanda cellerna i 500 μl PBS och mät efter flödescytometri.
  5. Funktionell identifiering av iNKT-celler
    1. Ta 3 x 106 iNKT-celler från steg 2.3.7 och omfördela dem i 12 brunnsplattor med 1,5 ml RPMI-1640 ofullständigt medium (dvs. utan serum).
    2. Tillsätt phorbolester (PMA, 50 ng/ml) och jonomycinkalcium (IO, 1 μg/ml) och placera i en CO 2-inkubator i 24 timmar.
    3. Samla in cellsupernatanten och upptäck sekretionsnivåerna il-2, IL-17A, TNF-α, IL-6, IL-4, IFN-γ och IL-10 med hjälp av en kommersiell CBA-analys enligt tillverkarens protokoll.
  6. Experimentell studie om migreringsvägen för iNKT-celler hos RA-möss
    1. Lös dir-färg (2,5 mg/ml) i DMSO.
    2. Omdu återuppställer iNKT-celler i 6 brunnsplattor med RPMI-1640 ofullständigt medium. Densiteten är 1 × 106 celler/ml.
    3. Tillsätt DiR-lösning (5 μg/ml) och inkubera i en CO 2-inkubator i 25 min.
    4. Tvätta med PBS och doppa cellerna (3 x 106/300 μL) för att få DiR-märkta iNKT-celler (DiR-iNKT).
    5. Injicera 1% natriumpentobarbital (50 mg/kg kroppsvikt) intraperitonealt för att söcera mössen. Tillräckligt luftstrupiga möss visar inte en baktastillbakadragande till tå nypa. Applicera veterinärsalva på musögonen för att förhindra torrhet under anestesi för avbildning.
    6. Injicera DiR-iNKT-cellerna 3 x 106 per mus i svansvenen med RA-modellen i 8 dagar. Övervaka iNKT-cellerna hos möss efter injektion i 0 min, 10 min, 30 min, 60 min och dag 0 (efter 3 h), 1, 3, 6, 12, 26, 34, 38 och 42 dagar med hjälp av ett litet djur in vivo imaging system (IVIS). Excitationsvåglängden som användes var 748 nm, utsläppsvåglängden var 780 nm och exponeringstiden var automatisk.
    7. Placera varje mus i en separat bur efter varje observation och upprätthålla sternala recumbency. Observera tills återhämtning från anestesi.

3. Utvärdering av adoptivimmunterapi av RA Möss med iNKT Celler

  1. iNKT cell adoptiv immunterapi för RA möss
    1. Injicera 3 x 106 celler iNKT celler per mus genom svansvenen. Välj slumpmässigt 15 möss som modellerades 8 dagar före och få iNKT-celler utan DiR-märkning från steg 2.3.7 genom bakveninfusionen.
  2. Utvärdera effekten av adoptivimmunterapi för iNKT-celler.
    1. Mät tjockleken på musens tass, kvantifiera svullnaden i fotledsleden och gör systematiskt poäng efter infusionen av iNKT-celler enligt beskrivningen i steg 1.2.1–1.2.2.
    2. Observera den inflammatoriska cellinfiltrationen och gemensamma förändringar av muslederna enligt beskrivningen i steg 1.2.3.
    3. Bestäm sekretionnivåerna IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, TNF-α och IFN-γ enligt beskrivningen i steg 1.2.4.
  3. Bestäm frekvensen för iNKT-celler och delmängder.
    1. Isolera musbrässen och förbered en enda cellsuspension.
    2. Separera lymfocyterna med lymfocytseparationsvätska.
    3. Bestäm iNKT-cellfrekvens och undergruppsfrekvens enligt beskrivningen i steg 2.4.
  4. Statistisk analys
    Obs! Alla data presenteras som medelvärde ± SD. Värden för P < 0,05 ansågs statistiskt signifikanta.
    1. Använd enfaktorsanalys av varians (ANOVA). Om variansen är nöjd, använd LSD-testet för ytterligare jämförelse.
    2. Om variansen inte är enhetlig, använd det ickeparametriska testet. Använd Kruskal-Wallis H-testet för vidare jämförelse31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Artrit index poäng och tass tjocklek ökade efter modellering. Jämfört med kontrollgruppen började tårna i RA-modellgruppen visa röd svullnad vid 6 dagar efter modellering, med gradvis försämring. Vid 14 dagar, den röda svullnaden i fotleden leden nådde sin topp, följt av gradvis lättnad. Tjockleken på tassen ändrades på samma sätt (P < 0,05) (figur 1).

Den inflammatoriska cellinfiltrationen ökade betydligt efter modellering. De patologiska resultaten visade att infiltrationsgraden av inflammatoriska celler i fotleden synovial vävnad av RA-modellen möss var olika i olika skeden. Toppinflammation inträffade dag 14 efter modellering (figur 2).

Inflammatoriska cytokiner ökade och antiinflammatoriska cytokiner minskade i serum. I RA-modellgruppen ökade serumnivåerna av proinflammatoriska cytokiner (TNF-α, IFN-γ och IL-6) signifikant (P < 0,05), medan antiinflammatoriska cytokiner (IL-4 och IL-10) signifikant minskade (P < 0,05) (figur 3).

INKT-cellerna som erhölls genom induktion och in vitro-rening bestod huvudsakligen av iNKT2-cellundergrupper, som utsöndrar antiinflammatoriska cytokiner. Intraperitoneal injektion av α-GalCer ökade frekvensen av iNKT celler i kroppen, främst iNKT2 undergruppen. Frekvensen av mjälte iNKT-celler i normala DBA/1-möss var cirka 2% av lymfocyterna( iNKT2 var ca 5%, iNKT1 ca 15%, iNKT17 ca 10%). Tre dagar efter intraperitoneal injektion av α-GalCer, frekvensen av iNKT celler var ca 6% av lymfocyterna, (iNKT2 var ca 82%, iNKT1 ca 1,5% och iNKT17 ca 0,5%). Efter rening av MACS var renheten hos iNKT-celler över 85 %, varav iNKT2 var cirka 92 %, iNKT1 ca 0,4 %, och iNKT17 ca 0,2 %(figur 4).

De skördade iNKT-cellerna utsöndrade mer antiinflammatoriska cytokiner och färre inflammatoriska cytokiner. INKT-cellerna isolerades från mjälte av normala möss och intraperitonealt injicerade med α-GalCer 3 dagar efter att musmjältan (α-GalCer-gruppen) och cytokinnivåerna i cellkulturens supernatant undersöktes. Jämfört med kontrollgruppen minskade de inflammatoriska cytokinerna (IL-17A, TNF-α, IFN-γ och IL-6) i α-GalCer-gruppen signifikant (P < 0,05) och den antiinflammatoriska cytokinil-4-nivån ökade signifikant (P < 0,05). Det fanns ingen signifikant skillnad i IL-10(P > 0,05). IFN-γ/IL-4-förhållandet minskade signifikant(P < 0,05) (figur 5).

IVIS spårning bekräftade att DiR-iNKT celler var adoptivt infunderas i RA möss och omedelbart dök upp i lungorna efter injektion. Fluorescens upptäcktes i levern vid 10 min och i mjälten vid 60 min(figur 6AI, 6AII, 6AIII). I de isolerade organen fanns det ingen fluorescens i bräss och tuinal lymfkörtlar inom 1 h. Fluorescens upptäcktes i lungorna vid 0 min, fluorescensintensiteten var den största på 10 min, och sedan gradvis försvagades. Det var svag fluorescens i levern vid 0 min, och sedan ökade det gradvis. Fluorescensen i mjälten upptäcktes vid 30 min och sedan gradvis ökas(figur 6AIV, 6C).

Efter infusionav DiR-iNKT-celler till RA-möss koncentrerades fluorescens främst till lever n och mjälte (figur 6BI, 6BII, 6BIII), men det fanns ingen fluorescens i brässoch elitela lymfkörtlar. Mjälte och lever hade den högsta fluorescensintensiteten dag 1 efter cellinfusion, men den försvagades gradvis. Dag 34 försvann ytlysen. Dag 42 försvann fluorescensen hos de isolerade organen. Den genomsnittliga fluorescenssignalintensiteten i levern efter cellinfusionen var högre än mjälten(figur 6BIV, 6D).

Adoptiv infusion av iNKT-celler i RA-möss kan lindra sjukdomsprogression och förbättra kliniska symtom. iNKT-cellerna förbättrade de kliniska symptomen på RA-möss efter adoptivinfusion. Jämfört med den obehandlade RA-modellgruppen var svullnaden i fotledsleden lättad i cellbehandlingsgruppen, och poängen minskade signifikant från dag 10 till dag 20 efterinjektion. Under samma period i cellbehandlingsgruppen minskade inflammatorisk cellinfiltration i synovialvävnaden jämfört med RA-modellgruppen (figur 2).

Framgången för tymus iNKT celler ökade avsevärt (P < 0,05). Jämfört med den friska kontrollgruppen minskade i RA-modellgruppen i iNKT-cellerna i bränet vid förloppet (dag 11), topp (dag 14) och återhämtning (dag 20). Vid toppinflammation var dessa värden minimala och återhämtade sig i remissionfasen. Cellterapigruppen visade signifikant ökade iNKT-celler vid topp (dag 14) och återhämtningsstadier (dag 20) jämfört med RA-modellgruppen (P < 0,05) (figur 7).

Efter iNKT cell infusion, framgången för iNKT1 och iNKT17 i bräss minskade och iNKT2 ökade. Jämfört med kontrollgruppen ökade i RA-modellgruppen dag 11 iNKT1 och iNKT17 i brässsignifikant(P < 0,05) och iNKT2 minskade signifikant (P < 0,05). Dag 14 ökade iNKT1 och iNKT2 i bränet signifikant(P< 0,05) och iNKT17 minskade signifikant(P< 0,05). Dag 20 ökade iNKT1 i bräken signifikant(P < 0,05), iNKT2 inte signifikant förändring(P > 0,05) och iNKT17 minskade signifikant (P < 0,05). INKT1/iNKT2-kvoten ökade signifikant under alla tre etapperna(P < 0,05).

Jämfört med RA-modellgruppen var iNKT1 och iNKT17 signifikant lägre(P < 0,05) dag 11 i α-GalCer- och cellterapigrupperna. Dag 14 minskade i α-GalCer-gruppen iNKT1 och iNKT17 signifikant(P < 0,05) och iNKT2 ändrades inte nämnvärt (P > 0,05). i cellbehandlingsgruppen iNKT1 och iNKT17 minskade signifikant(P < 0,05) och iNKT2 ökade signifikant(P < 0,05). Dag 20 minskade iNKT2 i gruppen α-GalCer signifikant(P < 0,05) iNKT2 signifikant (P > 0,05) och iNKT17 ökade signifikant (P < 0,05). i cellbehandlingsgruppen iNKT1 och iNKT17 minskade signifikant(P < 0,05) och iNKT2 ökade signifikant(P < 0,05). Förhållandet mellan iNKT1/iNKT2 minskade signifikant under alla tre etapperna(P < 0,05) (figur 7).

Nivåerna av inflammatoriska cytokiner ökade i serum och de antiinflammatoriska cytokinerna minskade efter infusion av iNKT-celler. I RA-modellgruppen ökade nivåerna av TNF-α, IFN-γ och IL-6in serum signifikant(P < 0,05), medan IL-4 och IL-10 visade markant minskade mängder (P < 0,05) jämfört med kontrollgruppen. I gruppen iNKT-cellterapi minskade nivåerna av TNF-α, IFN-γ och IL-6 i serum signifikant i förlopps- och toppstadierna av inflammation (P < 0,05), medan IL-4 och IL-10 ökade signifikant (P < 0,05) jämfört med RA-modellgruppen (figur 3).

Figure 1
Figur 1: Den gemensamma svullnadpoäng och tasstjocklekförändring hos möss. (A)Svullnad av fotledsleden hos möss. (B,D) Paw tjocklek i olika grupper. (C) Ändringar i kliniska poäng i olika grupper. Musartrit poängen och tjockleken på tassen minskade signifikant i cellterapigruppen på dagar 10–20 (dvs. 2–12 dagar efter behandling) efter modellering. *P < 0,05 vs kontroll, **P < 0,05 vs RA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Histopatologiska förändringar av fotledsleden. Infiltrationen av inflammatoriska celler minskade signifikant i cellterapigruppen och ökade signifikant i RA-gruppen dag 14. ◊ = inflammatoriska celler. A100x (B) 400x. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Nivåerna av serumcytokiner i varje grupp. (A)Serumcytokiner nivåer hos möss dag 11 efter modellering (pg/ml). (B)Serumcytokiner nivåer hos möss dag 14 efter modellering (pg/ml). Nivåerna av TNF-α, IFN-γ och IL-6 minskade signifikant och nivåerna il-4 och IL-10 ökade signifikant i cellterapigruppen. aP < 0.05 vs. kontroll. bP < 0.05 vs. RA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Andelen iNKT-celler och andel iNKT-celldelmängder. (A, B , C) Hastigheten på iNKT2 hos normala möss är ~5%. - Jag är ledsen, men detär inte. Graden av iNKT2 är ca 82% efter induktion av in vivo. (G, H, I) Graden av iNKT2 är mer än 92% efter MACS rening. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Cytokinnivåer i kultursupernatant av musmjen-härledda iNKT celler. Il-4-nivån ökade signifikant och nivåerna il-17A, TNF-α, IFN-γ och IL-6 minskade signifikant. aP < 0.05 vs. kontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Distribution och metabolism av iNKT-celler som spåras med ok IVIS lumina II. ( A,B) Migreringssökväg för iNKT-celler. (C) Förändringen av den genomsnittliga fluorescenssignalintensiteten i mjälte, lever och lunga. (D)Förändringen av den genomsnittliga fluorescenssignalintensiteten i mjälte och lever. Fluorescensen upptäcktes i lungorna och levern vid 0 min, och sedan gradvis ökat. Fluorescensintensiteten var starkast vid 10 min i lungorna och minskade sedan. Fluorescensen av mjälte upptäcktes vid 30 min, sedan gradvis ökat. Fluorescensen av alla organ försvann på dag 42. Den genomsnittliga fluorescenssignalintensiteten i levern är högre än mjälten efter cellinfusion (I: supin; II: laterala lögner; III: benägen; IV: isolerad vävnad; a: kontrollgrupp; b: cellinfusionsgrupp; 1, 2, 3, 4, 5 är bräss, mjälte, lever, inguinal lymfkörtlar, lungor). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: INKT-hastigheterna och dess undergrupper i musbrässen. (A)Andelen iNKT-celler vid 11, 14 och 20 dagar efter modellering. (B)Förhållandet mellan iNKT1/iNKT2. - Jag har intetid med dethär. Hastigheten på iNKT1, iNKT2 och iNKT17. På dag 11, 14 och 20 (dag 3, 6 och 12 efter cellterapi) ökade frekvensen av iNKT-celler signifikant, iNKT1 och iNKT17 av brässen minskade signifikant i cellterapigruppen och iNKT2 ökade signifikant. aP < 0.05 vs Kontroll. bP < 0.05 vs RA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

iNKT celler är speciella T-celler som överbryggar medfödda och adaptiva immunitet och är huvudsakligen utvecklade från CD4++/ CD8+ thymocytes. iNKT celler har olika immunoregulatory funktioner och interagera med andra immunceller genom direkt kontakt och utsöndring av olika cytokiner23, som påverkar dendritiska celler (DCs), makrofager, neutrofiler, B-celler, T-celler och NK cell differentiering och utveckling24. α-GalCer är en klassisk iNKT cell-specifik aktivator utvinns ur svampar. Flera studier visar att cellfrekvensen mjälta når en topp efter en enda intraperitoneal injektion av α-GalCer i 3 dagar25. Våra experimentella resultat visade dominans en iNKT2 delmängd hos möss mjälte i 3 dagar efter en intraperitoneal injektion av α-GalCer, som huvudsakligen utsöndrar antiinflammatoriska cytokiner IL-4 och IL-10. Vi fann också att överflödet av iNKT2 celler minskade och att iNKT1 och iNKT17 celler ökade i RA-modellen möss under den inflammatoriska fasen. Därför isolerade vi iNKT cellerna i musen mjälte genom intraperitoneal injektion av α-GalCer i 3 dagar. Dessa användes för att behandla RA-modellen möss. INKT2-delmängdens hastighet var 82 % efter induktion av in vivo. Efter rening av MACS översteg iNKT2-hastigheten 92%.

Den specifika aktiveringen av iNKT-celler används som en ny biologisk behandling för RA. Horikoshi et al.21 visade att intraderdermal injektion av α-GalCer hämmade GPI peptid-inducerad artrit genom att avsevärt hämma antalet CD4+ T celler. Chiba et al.26 visade att upprepade injektioner av den syntetiska iNKT2 selektivaktivatorn OCH hämmade CIA, medan α-GalCer visade en lätt hämmande effekt. Vi injicerade mjälte-härledda iNKT i RA modell möss, och resultaten visade att graden av svullnad av fotled lederna i cellterapi gruppen och antalet inflammatoriska celler infiltrera i lederna minskade. Nivån av antiinflammatoriska cytokiner i serum (t.ex. IL-4 och IL-10) ökade och utsöndraren av proinflammatoriska cytokiner (t.ex. minskade IFN-γ och TNF- α). den riktade aktiveringen av iNKT-celler kunde lindra utvecklingen av RA och hämma den inflammatoriska reaktionen. Dessutom upptäckte vi frekvensen av iNKT i bräss och fann att antalet iNKT-celler i RA-modellgruppen minskade signifikant, medan frekvensen i brässökade efter infusion av iNKT-cellerna. På grund av närvaron av blod-bräss barriärsystemet, ansåg vi inte adoptivt infunderas ökning av nivån på iNKT i bräss som bekräftades i senare experiment. Ytterligare upptäckt av subpopulationerna av iNKT-celler i bräss visade att antalet iNKT1-celler i RA-modellgruppen ökade betydligt under de tre stadierna av inflammation och maximalt under toppen av inflammation, medan andelen iNKT2-delmängdbörjade öka på toppen av inflammation. Noterbart är att iNKT1-delmängden kan vara involverad i den tidiga inflammationen i RA, och iNKT2-deluppsättningen kan spela en viktig roll för att hämma inflammationen. Jämfört med RA-modellgruppen minskade iNKT1-delmängden i cellterapigruppen signifikant under den inflammatoriska fasen och iNKT2-delmängden ökade signifikant i det tidiga och eftergiftstadiet av inflammation. Dessa resultat visade att adoptivinfusion av specifika fenotyper och funktionella iNKT-celler avsevärt ökade frekvensen av iNKT-celler i RA och förändrade andelen iNKT-celldelmängder.

Vi använde IVIS för att observera fördelningen av iNKT-celler hos möss efter adoptivinfusion och fann den högsta fluorescensintensiteten i lungorna 10 minuter efter infusion, som bleknade gradvis. Levern visade svag fluorescens, som ökade gradvis och minskade gradvis efter 2 dagar. Fluorescens upptäcktes i mjälte vid 30 min, som ökade gradvis och minskade efter 2 dagar. Den genomsnittliga fluorescensintensiteten i levern var starkare än mjälten. Dock upptäcktes ingen fluorescens i bräss och inguinal lymfkörtlar. Detektion av fluorescens i lungorna kan tillskrivas infusion av iNKT-celler i svansvenen. Dessa celler cirkuleras till lungorna med blodet. Levern fluoresces tidigare än mjälte, och den genomsnittliga fluorescensintensiteten i levern är starkare än mjälte. Denna preferensackumulering av iNKT-cellerna kan bero på de rikliga blodkärlen i levern, det huvudsakliga metaboliska organet. Fluorescens upptäcktes inte i bräss. Detta kan bero på den hematologiska barriären, vilket kan hindra inträdet av iNKT-celler. Fluorescens upptäcktes aldrig i euinal lymfkörtlar, kanske för att färre iNKT celler in lymfkörtlarna och inte nådde den lägsta nivån av detektion. Det kan också spekuleras i att iNKT-cellerna infunderas i svansvenen kanske inte kommer in i lymfkörtlarna. Därför tantar vi att utvecklingen och differentieringen av iNKT-celler i bräss kan regleras genom cytokinvägar efter adoptivinfusion i mössen. Detta måste klargöras ytterligare.

GPI finns i serum och synovialvätska hos de flesta RA-patienter och är ett vanligt test för klinisk RA-diagnos27. Bruns et al.28 används peptider av olika längder från GPI sekvensoch immuniserade DBA/1 möss för att identifiera sex immunodominant T cell epitoper. Av dessa var tre arthritogenic. Peptiderna med >95% förekomst av artrit är hGPI 325-339 och hGPI469-483. Våra tidigare studier visade att användningen av en blandning av de två peptiderna för att upprätta en RA-modell är bättre än en enda peptid. I de resulterande RA-modellerna började mössens tår och leder att framstå som röda dag 6 och nådde en topp av inflammation dag 14. Den inflammatoriska cellinfiltrationåtföljdes av vävnad hyperplasi i synovialvävnad i lederna, och den inflammatoriska cellinfiltrationen var allvarligast dag 14. Antalet iNKT-celler minskade signifikant i brässen på toppen av inflammation, vilket var förenligt med trenden för iNKT-celler hos RA-patienter29. Ytterligare detektion av iNKT-cellundergrupper visade att frekvensen av iNKT1 och iNKT17 i bräjslan ökade och frekvensen av iNKT2 minskade under progressionen av inflammation (dag 11). Dessutom ökade nivåerna av serumcytokiner IFN-γ och IL-17A under progressionen (dag 11) och toppen av inflammation (dag 14), vilket tyder på en liknande polarisering av undergrupperna Th1 och Th17 i RA-modellmöss30. Därför uppvisade RA-musmodellen som framkallades av hGPI325-339 och hGPI469-483 blandade polypeptidfragment egenskaperna hos CD4+ T-cellhyperproliferation och iNKT-celldefekter, som liknade ra-patienternas, och kunde användas som en idealisk djurmodell för att undersöka ra-cellernas immunitet. Dessa resultat var överens med dem från våra tidigare studier och visade stabiliteten i hGpIs-inducerad RA modell31.

I allmänhet kan RA-musmodellen som induceras av de blandade G6PI-peptiderna simulera förändringarna i CD4+ T-celler, iNKT-celler och relaterade cytokiner hos RA-patienter. Detta ger en bra modell för fördjupad undersökning av RA. I följd användes iNKT (främst iNKT2) genom intraperitoneal injektion av α-GalCer och renad in vitro vid behandling av RA. Det kan korrigera immun obalans orsakas av onormal spridning av Th subsets, lindra utvecklingen av RA, och i framtiden kan ge nya metoder för klinisk behandling av RA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar ingen finansiering eller intressekonflikter.

Acknowledgments

Vår studie stöddes av National Natural Science Foundation of China (NSFC) (81771755), Högskolor och universitetets vetenskap och teknik viktiga forskningsprojekt i Hebei-provinsen (ZD2017009) och Animal Lab of Medical Experiment Center, Hebei University. Vi är tacksamma för deras stöd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 647 Mouse Anti-PLZF BD 563490 America
Anti-PE MicroBeads Miltenyi 130-048-801 Germany
Columns Miltenyi MS Germany
Cryogenic Centrifuge Beckman Allegra® X-15R America
DiR Thermo Fisher Scientific D12731 America
Embedding Center Tianjin Aviation Electromechanical Co., Ltd. BMJ-1 China
FITC Hamster Anti-Mouse TCR β Chain BD 553170 America
Flow cytometer BD Accuri C6 America
Freund's complete adjuvant Sigma F5881 America
hGPI325-339 (IWYINCFGCETHAML) Karebay Biochem 18062202 China
hGPI469-483 (EGNRPTNSIVFTKLT) Karebay Biochem 18062203 China
In Vivo Imaging System PerkinElmer caliper IVIS lumina II America
Ionomycin Calcium Cayman 10004974 America
KRN7000 AdipoGen AG-CN2-0013 America
Mouse CD1d Tetramer-PE MBL TS-MCD-1 Japan
Mouse percoll Solarbio P8620 China
Optical Microscope Olympus Olympus-II Japan
PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-ROR-ϒt BD 562683 America
PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-T-bet BD 561316 America
Pertussis toxin Sigma P7208 America
phorbol esters Cayman 10008014 America
Red Blood Cell Lysis Buffer BD 555899 America
RPMI-1640 Biological Industries 01-100-1ACS Israel
Th1/Th2/Th17 cytokines kit BD 560485 America
Ultramicrotome Leica Leica EM UC6 Germany

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tobón, G. J., Youinou, P., Saraux, A. The environment, geo-epidemiology, and autoimmune disease: Rheumatoid arthritis. Autoimmunity Reviews. 35, (1), 0-14 (2010).
  2. Cross, M., et al. The global burden of rheumatoid arthritis: estimates from the Global Burden of Disease 2010 study. Annals of the Rheumatic Diseases. 73, (7), 1316-1322 (2014).
  3. Kanashiro, A., Bassi, G. S., Queiróz Cunha, F. D., Ulloa, L. From neuroimunomodulation to bioelectronic treatment of rheumatoid arthritis. Bioelectronics in Medicine. 1, (2), 151-165 (2018).
  4. Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature Reviews Immunology. 13, (2), 101-117 (2013).
  5. Bianca, B. S. Unraveling Natural Killer T-Cells Development. Frontiers in Immunology. 8, 1950 (2018).
  6. Mitsuo, A., et al. Decreased CD161+CD8+ T cells in the peripheral blood of patients suffering from rheumatic diseases. Rheumatology. 45, (12), 1477-1484 (2006).
  7. Miellot, A., et al. Activation of invariant NK T cells protects against experimental rheumatoid arthritis by an IL-10-dependent pathway. European Journal of Immunology. 35, (12), 3704-3713 (2005).
  8. Miellot-Gafsou, A., et al. Early activation of invariant natural killer T cells in a rheumatoid arthritis model and application to disease treatment. Immunology. 130, (2), 296-306 (2010).
  9. Tudhope, S. J., Delwig, A. V., Falconer, J., Pratt, A., Ng, W. F. Profound invariant natural killer t-cell deficiency in inflammatory arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 69, (10), 1873-1879 (2010).
  10. Ming, M., et al. Effects on immunoregulation of iNKT cells in RA by novel synthetic immunostimulator CH1b. Chinese Journal of Immunology. 32, (02), 218-222 (2016).
  11. Ming, M., et al. Study of the correlation between the percentage of iNKT cells and the ratio of IFN-γ/IL-4 in patients with rheumatoid arthritis. Chinese Journal of Microbiology Immunology. 35, (3), 213-218 (2015).
  12. Sharif, S., et al. Activation of natural killer T cells by α-galactosylceramide treatment prevents the onset and recurrence of autoimmune Type 1 diabetes. Nature Medicine. 7, 1057-1062 (2010).
  13. Gapin, L. Development of invariant natural killer T cells. Current Opinion in Immunology. 39, 68-74 (2016).
  14. Kwon, D. I., Lee, Y. J. Lineage Differentiation Program of Invariant Natural Killer T Cells. Immune Network. 17, (6), (2017).
  15. Thapa, P., et al. The differentiation of ROR-γt expressing iNKT17 cells is orchestrated by Runx1. Scientific Reports. 7, (1), 7018 (2017).
  16. Schurgers, E., Billiau, A., Matthys, P. Collagen-induced arthritis as an animal model for rheumatoid arthritis: focuson interferon-γ. Interferon Cytokine Research. 31, (12), 917-926 (2011).
  17. Van Haalen, H. G. M., Severens, J. L., Tran-Duy, A., Boonen, A. How cost-effectiveness A systematic review and stepwise approach for selecting a transferable health economic evaluation rheumatoid arthritis. Pharmacoeconomics. 32, (5), 429-442 (2014).
  18. Schubert, D., Maier, B., Morawietz, L., Krenn, V., Kamradt, T. Immunization with glucose-6-phosphate isomerase induces T cell-dependent peripheral polyarthritis in genetically unaltered mice. Journal of Immunology. 172, 4503-4509 (2004).
  19. Bockermann, R., Schubert, D., Kamradt, T., Holmdahl, R. Induction of a B-cell-dependent chronic arthritis with glucose-6-phosphate isomerase. Arthritis Research, Therapy. 7, 131613-131624 (2005).
  20. Kamradt, T., Schubert, D. The role and clinical implications of G6PI in experimental models of rheumatoid arthritis. Arthritis Research, Therapy. 7, 20-28 (2005).
  21. Horikoshi, M., et al. Activation of Invariant NKT Cells with Glycolipid Ligand α-Galactosylceramide Ameliorates Glucose-6-Phosphate Isomerase Peptide-Induced Arthritis. PlosOne. 7, (12), 51215 (2012).
  22. Zhang, X. J., et al. Immunization with mixed peptides derived from glucose-6-phosphate isomerase induces rheumatoid arthritis in DBA /1 mice. Chinese Journal of Pathophysiology. 32, (3), 569-576 (2016).
  23. Motohashi, S., Nakayama, T. Invariant natural killer T cell-based immunotherapy for cancer. Immunotherapy. 1, (1), 73 (2017).
  24. Jung, S., et al. The requirement of natural killer T-cells in tolerogenic APCs-mediated suppression of collagen-induced arthritis. Experimental and Molecular Medicine. 42, (8), 547-554 (2010).
  25. Luc, V. K., Lan, W. Therapeutic Potential of Invariant Natural Killer T Cells in Autoimmunity. Frontiers in Immunology. 9, 519-526 (2018).
  26. Chiba, A., et al. Suppression of collagen-induced arthritis by natural killer T cell activation with OCH, a sphingosine-truncated analog of α-galactosylceramide. Arthritis, Rheumatism. 50, (1), 305-313 (2004).
  27. Tudhope, S. J., Delwig, A. V., Falconer, J., Pratt, A., Ng, W. F. Profound invariant natural killer t-cell deficiency in inflammatory arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 69, (10), 1873-1879 (2010).
  28. Bruns, L., et al. Immunization with an immunodominant self-peptide derived from glucose-6-phosphate isomerase induces arthritis in DBA/1 mice. Arthritis Research, Therapy. 11, (4), (2009).
  29. Parietti, V., et al. Rituximab treatment overcomes reduction of regulatory iNKT cells in patients with rheumatoid arthritis. Clinical Immunology. 134, (3), 331-339 (2010).
  30. Yoshida, Y., et al. Functional mechanism(s) of the inhibition of disease progression by combination treatment with fingolimod plus pathogenic antigen in a glucose-6-phosphate isomerase peptide-induced arthritis mouse model. Biological, Pharmaceutical Bulletin. 38, (8), 1120-1125 (2015).
  31. Chen, D., et al. Study of the adoptive immunotherapy on rheumatoid arthritis with Thymus-derived invariant natural killer T cells. International Immunopharmacology. 67, 427-440 (2019).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics