Techniques de spectrométrie de mobilité-masse d'ion pour déterminer la structure et les mécanismes de la reconnaissance d'ion de métal et de l'activité de Redox des Oligopeptides de liaison de métal

Chemistry

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Summary

Les techniques de spectrométrie et de modélisation moléculaire de la mobilité des ions peuvent caractériser la performance sélective du chélage métallique des peptides de liaison métallique conçus et la méthanoacttine du peptide liant le cuivre. Le développement de nouvelles classes de peptides de chélage de métal aidera à mener aux thérapies pour des maladies liées à l'déséquilibre d'ion métallique.

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Yousef, E. N., Sesham, R., McCabe, J. W., Vangala, R., Angel, L. A. Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides. J. Vis. Exp. (151), e60102, doi:10.3791/60102 (2019).

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Abstract

L'ionisation par électrospray (ESI) peut transférer un peptide ou un peptide en phase aqueuse à la phase gazeuse tout en conservant sa masse, sa charge globale, ses interactions métal-liantes et sa forme conformationnelle. L'accouplement de l'ESI avec la spectrométrie de masse de mobilité ionique (IM-MS) fournit une technique instrumentale qui permet de mesurer simultanément la section transversale de masse à charge (m/z) d'un peptide (m/z) qui se rapportent à son état de stoichiométrie, de protonation, et la forme conformationnelle. La charge globale d'un complexe de peptides est contrôlée par la protonation de 1) les sites acides et de base du peptide et 2) l'état d'oxydation de l'ion métallique(s). Par conséquent, l'état de charge global d'un complexe est fonction du pH de la solution qui affecte l'affinité de liaison d'ion métallique de peptides. Pour les analyses ESI-IM-MS, les solutions peptidiques et d'ions métalliques sont préparées à partir de solutions aqueuses seulement, le pH ayant été ajusté avec de l'acide acétique aqueux dilué ou de l'hydroxyde d'ammonium. Cela permet de déterminer la dépendance au pH et la sélectivité des ions métalliques pour un peptide spécifique. En outre, le m/z et le CSC d'un complexe de peptides peuvent être utilisés avec la modélisation moléculaire B3LYP/LanL2DZ pour discerner les sites de liaison de la coordination des ions métalliques et de la structure tertiaire du complexe. Les résultats montrent comment ESI-IM-MS peut caractériser la performance sélective de chélage d'un ensemble de peptides alternatifs de méthanobactine et les comparer à la méthanobacttine de peptide cuivre-contraignante.

Introduction

Les ions de cuivre et de zinc sont essentiels pour les organismes vivants et cruciaux pour les processus comprenant la protection oxydative, la croissance de tissu, la respiration, le cholestérol, le métabolisme de glucose, et la lecture de génome1. Pour activer ces fonctions, des groupes tels que le thiolate de Cys, l'imidazole de ses2,3, (plus rarement) thioether de méthionine, et carboxylate de Glu et Asp incorporer sélectivement des métaux comme cofacteurs dans les sites actifs de metalloenzymes. La similitude de ces groupes de coordination soulève une question intrigante quant à la façon dont les ligands His et Cys intègrent sélectivement Soit Cu(I/II) ou Zn(II) pour assurer un bon fonctionnement.

La liaison sélective est souvent accomplie par l'acquisition et le trafic de peptides, qui contrôlent les concentrations d'ionz(II) ou Cu(I/II)4. Cu(I/II) est très réactif et cause des dommages oxydatifs ou une liaison aventurière aux enzymes, de sorte que sa concentration libre est étroitement réglementée par les chaperons de cuivre et les protéines régulatrices du cuivre qui le transportent en toute sécurité à divers endroits dans la cellule et étroitement contrôler son homéostasie5,6. La perturbation du métabolisme du cuivre ou de l'homéostasie est directement impliquée dans Menkes et la maladie de Wilson7 ainsi que les cancers7 et les troubles neuronaux, tels que le prion8 et la maladie d'Alzheimer9.

La maladie de Wilson est associée à des niveaux accrus de cuivre dans les yeux, le foie et les sections du cerveau, où les réactions redox de Cu(I/II) produit des espèces réactives d'oxygène, causant la dégénérescence hépatolentique et neurologique. Les thérapies existantes de chélation sont la petite pénicillamine d'acide aminé de thiol et la triéthylenetetramine. Alternativement, les peptides de cuivre-acquisition méthanotrophiques methanobactin (mb)10,11 présentent un potentiel thérapeutique en raison de leur affinité de liaison élevée pour Cu(I)12. Lorsque la méthanobacttine (mb-OB3b) de Methylosinus trichosporium OB3b a été étudiée dans un modèle animal de la maladie de Wilson, le cuivre a été efficacement retiré du foie et excrété par la bile13. Des expériences in vitro ont confirmé que mb-OB3b pourrait chélater le cuivre de la métallothionein de cuivre contenue dans le cytosol de foie13. L'ablation au laser a inductivement couplé les techniques d'imagerie par spectrométrie de masse plasmatique ont étudié la distribution spatiale du cuivre dans les échantillons de foie de la maladie de Wilson14,15,16 et ont montré que mb-OB3b enlève le cuivre avec de courtes périodes de traitement de seulement 8 jours17.

Le mb-OB3b se liera également avec d'autres ions métalliques, y compris Ag(I), Au(III), Pb(II), Mn(II), Co(II), Fe(II), Ni(II), et Zn(II)18,19. La concurrence pour le site de liaison physiologique Cu(I) est exposée par Ag(I) parce qu'il peut déplacer Cu(I) du complexe mb-OB3b, avec à la fois Ag(I) et Ni(II) montrant également une liaison irréversible à Mb qui ne peut pas être déplacé par Cu(I)19. Récemment, une série d'oligopeptides alternatifs de méthanobacttine (amb) avec le motif de liaison 2His-2Cys ont été étudiés20,21, et leurs propriétés de liaison Zn(II) et Cu(I/II) caractérisées. Leurs séquences primaires d'acides aminés sont similaires, et elles contiennent toutes le motif 2His-2Cys, Pro et un n-terminus acétylé. Ils diffèrent principalement de mb-OB3b parce que le motif 2His-2Cys remplace les deux sites de liaison enethiol oxazolone de mb-OB3b.

L'ionisation de l'électrospray couplée à la spectrométrie de masse de mobilité ionique (ESI-IM-MS) fournit une technique instrumentale puissante pour déterminer les propriétés métalliques-contraignantes des peptides parce qu'elle mesure leur masse-à-charge (m/z) et collision section transversale (CSC) tout en conservant leur masse, leur charge et leur forme conformationnelle à partir de la phase de solution. Le m/z et le CSC se rapportent à la stoichiométrie des peptides, à l'état de protonation et à la forme conformationnelle. La stoichiométrie est déterminée parce que l'identité et le nombre de chaque élément présent dans l'espèce sont explicitement identifiés. La charge globale du complexe de peptide se rapporte à l'état de protonation des emplacements acides et de base et à l'état d'oxydation de l'ion métal(s). Le CSC donne des informations sur la forme conformationnelle du complexe peptidique parce qu'il mesure la taille moyenne par rotation qui se rapporte à la structure tertiaire du complexe. L'état de charge global du complexe est également fonction du pH et affecte l'affinité de liaison d'ion métallique du peptide parce que les sites de base ou acides déprotonated tels que le carboxyl, his, Cys et Tyr sont également les emplacements de liaison potentiels pour l'ion métallique. Pour les analyses, le peptide et l'ion métallique sont préparés en solutions aqueuses avec le pH ajusté par l'acide acétique aqueous dilué ou l'hydroxyde d'ammonium. Cela permet de déterminer la dépendance au pH et la sélectivité des ions métalliques pour le peptide. En outre, le m/z et le CSC déterminés par ESI-IM-MS peuvent être utilisés avec la modélisation moléculaire B3LYP/LanL2DZ pour découvrir le type de coordination des ions métalliques et la structure tertiaire du complexe. Les résultats montrés dans cet article révèlent comment ESI-IM-MS peut caractériser la performance sélective de chélage d'un ensemble de peptides d'amb et les comparer au mb-OB3b de peptide cuivre-contraignant.

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Protocol

1. Préparation des réactifs

  1. Culture Methylosinus trichosporium OB3b, isoler le Cu(I)-free mb-OB3b18,22,23, lyophiliser l'échantillon et stocker à -80 oC jusqu'à utilisation.
  2. Synthétiser les peptides amb (98% de pureté pour amb1, amb2, amb4; '70% pureté pour amb7), lyophiliser les échantillons, et les stocker à -80 oC jusqu'à l'utilisation.
  3. Achat de manganèse de pureté de la pureté de la pureté de 98 % (II) chlorure, cobalt(II) chlorure, nickle(II) chlorure, cuivre(II) chlorure, cuivre(II) nitrate, argent (I) nitrate, zinc(II) chlorure, fer(III) chlorure et plomb(II) chlorure.
  4. Achetez les polymères poly-DL-alanine utilisés comme calibrants pour mesurer les sections transversales de collision de l'espèce en amb et l'hydroxyde d'ammonium de qualité HPLC ou plus élevé, l'acide acétique glaciaire et l'acétonitrile.

2. Préparation de la solution de stock

  1. Solution d'actions Peptide
    1. Peser avec précision, en utilisant au moins trois chiffres significatifs, la masse de 10,0 à 20,0 mg du mb-OB3b ou amb dans un flacon en plastique de 1,7 ml.
      REMARQUE : La masse pesée doit produire soit 12,5 mM, soit 1,25 mM, selon la solubilité du peptide, lorsque 1,00 mL d'eau déionisée (DI) est ajoutée.
    2. À l'aide d'un pipet, ajouter 1,00 ml d'eau déionisée (17,8 cm) à l'échantillon de peptide pesé pour produire soit la solution de 12,5 mM, soit 1,25 mM. Placez le bouchon solidement et mélangez-le bien avec au moins 20 inversions.
    3. À l'aide d'un micropipet, dispenser 50,0 aliquots de l'échantillon de peptide dans des flacons de 1,5 ml étiquetés individuellement et les stocker à -80 oC jusqu'à leur utilisation.
  2. Solutions de stock d'ion siens métalliques
    1. Peser avec précision, à l'aide d'au moins trois chiffres significatifs, la masse de 10,0 à 30,0 mg de chlorure de métal ou de nitrate d'argent dans un flacon de 1,7 ml.
      REMARQUE : La masse pesée devrait donner 125 mm lorsque 1,00 ml d'eau DI est ajouté.
    2. Ajouter les 1,00 ml d'eau DI à l'échantillon de métal pesé dans le flacon de 1,7 ml pour donner la solution de 125 mm. Placez le bouchon solidement et mélangez-le bien avec au moins 20 inversions.
  3. Solutions de stock d'hydroxyde d'ammonium: préparer une solution d'acide acétique de 1,0 M en diluant 57 L de la solution d'acide acétique de 99,5% avec de l'eau DI à un volume final de 1,00 ml. Préparer une solution d'hydroxyde d'ammonium de 1,0 M en diluant 90 l de la solution d'hydroxyde d'ammonium de 21 % avec de l'eau DI à un volume final de 1,00 ml. Faire deux dilutions successives de chaque solution en prenant 100 L des solutions de 1,0 M pour préparer des solutions d'acide acétique et d'hydroxyde d'ammonium de 0,10 M et 0,010 M.
  4. Solution de stock poly-DL-alanine: préparer la poly-DL-alanine (PA) en pesant 1,0 mg de PA et en se dissolvant dans 1,0 mL d'eau DI pour donner 1 000 ppm. Mélanger. À l'aide d'un micropipet, dispenser 50,0 aliquots ll et placez-les dans un flacon de 1,7 ml et entreposez-les à -80 oC.

3. Analyse de spectrométrie mobilité-masse Electrospray-ion

  1. Nettoyez soigneusement le tube d'entrée et le capillaire d'aiguille d'ESI avec environ 500 l d'acide acétique glaciaire de 0,1 M, 0,1 M d'hydroxyde d'ammonium et, enfin, de l'eau DI.
  2. Décongeler un aliquot de 50,0 L de la solution de stock PA de 1 000 ppm et le diluer avec 450 l'eau DI pour donner une PA de 100 ppm. Pipet 100,0 L de cette solution et le diluer à 1,00 ml avec 500 l d'eau DI et 500 l d'acétonitrile pour donner 10 ppm solution PA.
  3. Recueillir les spectres ion négatifs et positifs IM-MS de la solution PA de 10 ppm pendant 10 min chacun en utilisant des conditions ESI-IM-MS natives telles que décrites dans la section de discussion.
  4. Décongeler un aliquot de 50,0 L de la solution de stock de 12,5 mM ou 1,25 mmb et faire des dilutions successives avec de l'eau DI pour donner une concentration finale de 0,125 mm amb. Bien mélanger chaque dilution.
  5. Pipet 100,0 L de la solution de stock d'ion métallique de 125 mM, placer dans un flacon de 1,7 ml et diluer à 1,00 mL avec de l'eau DI pour donner 12,5 mM d'ion métallique. Répétez l'opération avec deux dilutions successives de plus pour donner une concentration finale d'ion séquestre de 0,125 mM. Bien mélanger chaque dilution.
  6. Pipet 200,0 L de la 0.125 mm amb dans un flacon de 1,7 ml, diluer avec 500 l d'eau DI, et mélanger la solution à fond.
  7. Ajustez le pH de l'échantillon à 3,0 en ajoutant 50 L de solution d'acide acétique de 1,0 M.
  8. Ajouter 200,0 L de l'ion métallique de 0,125 mM à l'échantillon corrigé du pH. Ajouter de l'eau DI pour produire un volume final de 1,00 ml de l'échantillon, bien mélanger et permettre à l'échantillon d'alquer pendant 10 min à RT.
  9. À l'aide d'une seringue nasale émoussée, prenez 500 l'échantillon et recueillez les spectres ES-IM-MS d'ion négatif et positif pendant 5 min chacun. Utilisez les 500 ll restants de l'échantillon pour enregistrer son pH final à l'aide d'une électrode de micro pH calibrée.
  10. Répétez les étapes 3.6-3.9, tout en modifiant l'étape 3.7 pour ajuster le pH à 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, ou 10.0 en ajoutant de nouveaux volumes des solutions de 0.010 M, 0.10 M, ou 1.0 M d'acide acétique ou d'hydroxyde d'ammonium.
  11. Recueillir les spectres eSI-IM-MS ion négatif et positif de la solution PA 10 ppm pour 10 min chacun.

4. Préparation de la titration d'ion métallique des échantillons d'amb

  1. Suivez les étapes décrites dans les étapes 3.1-3.5.
  2. Pipet 200,0 L de la 0.125 mM amb dans un flacon de 1,7 ml, diluer avec 500,0 L d'eau DI et mélanger la solution à fond.
  3. Ajustez le pH de l'échantillon à pH 9,0 en ajoutant 80 L de la solution d'hydroxyde d'ammonium de 0,010 M.
  4. Ajouter 28 L de la solution d'ions métalliques de 0,125 mM pour donner 0,14 équivalent molaire de l'ion métallique, ajouter de l'eau DI pour faire le volume final de l'échantillon 1,00 ml, bien mélanger, et permettre à l'échantillon d'équilibrer pendant 10 min à RT.
  5. À l'aide d'une seringue nasale émoussée, prenez 500 l'échantillon et recueillez les spectres ESI-IM-MS négatifs et positifs pendant 5 min chacun. Utilisez les 500 ll restants de l'échantillon pour enregistrer son pH final à l'aide d'une électrode de micro pH calibrée.
  6. Répéter les étapes 4.2-4.5, tout en modifiant l'étape 4.3 pour ajouter un volume approprié de la solution d'ion métallique de 0,125 mM pour donner soit 0,28, 0,42, 0,56, 0,70, 0,84, 0,98, 1,12, 1,26 ou 1,40 équivalent molaire.
  7. Recueillir les spectres ion négatif et positif IM-MS de la solution PA 10 ppm pour 10 min chacun.

5. Analyse des données de titration de pH ESI-IM-MS

  1. À partir des spectres IM-MS, identifier les espèces chargées d'ambs qui sont présentes en les faisant correspondre à leurs modèles théoriques d'isotopes m/z.
    1. Ouvrez MassLynx et cliquez sur Chromatogram pour ouvrir la fenêtre Chromatogram.
    2. Rendez-vous dans le menu Fichier et ouvrez pour localiser et ouvrir le fichier de données IM-MS.
    3. Extraire le spectre IM-MS en cliquant à droite et en faisant glisser à travers le chromatogramme et en libérant. La fenêtre de spectre s'ouvrira montrant le spectre IM-MS.
    4. Dans la fenêtre du spectre, cliquez sur Le modèle Outils et Isotope. Dans la fenêtre de modélisation des isotopes, entrez la formule moléculaire de l'espèce amb, cochez la boîte d'ions chargées Show et entrez dans l'état de charge. Cliquez OK.
    5. Répétez l'opération pour identifier toutes les espèces du spectre IM-MS et enregistrer leur aire de répartition des isotopes m/z.
  2. Pour chaque espèce amb, séparez toutes les espèces m/z fortuites et extrayez leurs distributions d'heures d'arrivée (ATD) en utilisant leurs modèles d'isotopes m/z pour les identifier.
    1. Dans MassLynx cliquez sur DriftScope pour ouvrir le programme. Dans DriftScope, cliquez sur Fichier et Ouvrez pour localiser et ouvrir le fichier de données IM-MS.
    2. Utilisez la souris et cliquez à gauche pour zoomer sur le modèle isotopique m/z de l'espèce amb.
    3. Utilisez l'outil De sélection et le bouton de la souris gauche pour sélectionner le modèle isotopique. Cliquez sur le bouton Acceptez le bouton de sélection actuelle.
    4. Pour séparer toute espèce m/z fortuite, utilisez l'outil De sélection et le bouton de la souris gauche pour sélectionner l'ATD aligné sur le modèle isotopique de l'espèce en amb. Cliquez sur le bouton Acceptez le bouton de sélection actuelle.
    5. Pour exporter l'ATD, rendez-vous sur File Exportez vers MassLynx, puis sélectionnez Conserver le temps de dérive et enregistrer le fichier dans le dossier approprié.
  3. Déterminer le centroïde de l'ATD et intégrer la zone sous la courbe ATD comme mesure de la population d'espèces.
    1. Dans la fenêtre Chromatogram de MassLynx ouvrez le fichier exporté enregistré. Cliquer sur Le processus Intégrer dans le menu. Vérifiez la case d'intégration ApexTrack Peak et cliquez sur OK.
    2. Enregistrez le centroïde ATD (tA) et la zone intégrée comme indiqué sur la fenêtre Chromatogram. Répétez l'opération pour tous les fichiers de données amb et PA IM-MS enregistrés.
  4. Utilisez l'ATD intégré pour toutes les espèces extraites d'amb des ions positifs ou négatifs à chaque point de titration pour normaliser à une échelle de pourcentage relative.
    1. Entrez l'identité de l'espèce amb et leur ATD intégré à chaque pH dans une feuille de calcul.
    2. Pour chaque pH, utilisez la somme des DAt intégrés pour normaliser l'ATD de l'amb individuel à une échelle de pourcentage.
    3. Tracer les intensités pour cent de chaque espèce amb vs pH dans un graphique pour montrer comment la population de chaque espèce varie en fonction du pH.

6. Sections transversales de collision

  1. À l'aide d'une feuille de calcul, convertir les CSC (MD) de25,26 et27 ions positifs mesurés dans le gaz tamponHe 28 en CPS corrigé(c)en utilisant l'équation 1 ci-dessous, où : z - charge ion; e (en) c charge d'électrons (1,602 à 10-19 C); m (en) N (en) 2 - masse de gaz N2 (Da); et mion - masse ionique. 29 Ans et plus

Equation 1

  1. Convertir les temps d'arrivée moyens (tA) des calibrants PA et des espèces en amb en temps de dérive (tD) en utilisant l'équation 2 ci-dessous, où : c - le coefficient de retard du cycle de service amélioré (1,41), et le m/z est la masse à la charge de l'ion peptidique.

Equation 2

  1. Terrain de l'AP calibrants' tD vs leurc. Ensuite, à l'aide d'un ajustement de régression de moindre set de l'équation 3 ci-dessous, déterminez les valeurs A' et B, où: A' est la correction pour la température, la pression et les paramètres de champ électrique; et B compense l'effet non linéaire du dispositif de GI.

Equation 3

  1. L'utilisation de ces valeurs A' et B et la valeur centroïde tD de l'ATD des ambs déterminent leur'c en utilisant l'équation 3 et leur 'en utilisant l'équation 1. Cette méthode fournit des CSC pour les espèces de peptides avec des erreurs absolues estimées d'environ 2%25,26,27.

7. Méthodes de calcul

  1. Utilisez le niveau de théorie B3LYP/LanL2DZ, composé des fonctions hybrides 3 paramètres Becke30 et de la base Dunning défini31 et des potentiels de noyau d'électrons32,33,34 pour localiser conformateurs optimisés pour tous les types possibles de coordinations de l'espèce m/z amb observée35.
    REMARQUE: Pour plus de détails sur la façon de construire et de soumettre des calculs se référer à l'utilisation GaussView dans le fichier supplémentaire.
  2. Comparez l'énergie libre prévue de chacun des conformistes et calculez leurs CSC théoriques à l'aide de la méthode Lennard-Jones (LJ) à l'échelle ionique du programme Sigma36.
  3. À partir de la plus faible énergie libre, les conformateurs déterminent quel consécration présente le LJ CCS qui est d'accord avec le CSC mesuré par IM-MS pour identifier la structure tertiaire et le type de coordination pour les conformateurs observés dans l'expérience.

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Representative Results

Fixation métallique d'amb1
L'étude IM-MS20 de l'amb1 (Figure 1A) a montré que les ions de cuivre et de zinc liés à amb1 d'une manière pH-dépendante (figure 2). Cependant, le cuivre et le zinc liés à amb1 par différents mécanismes de réaction à différents sites de coordination. Par exemple, l'ajout de Cu(II) à l'amb1 a entraîné l'oxydation de l'amb1 (amb1ox) par la formation de pont de disulfure, et à un pH de 'gt;6, le [amb1ox'3H'Cu(II)]- ion (Figure 2A) a été formé. Ceci a indiqué la déprotonation de deux imidazoliums, groupe de carboxyl, et de deux emplacements additionnels qui coordonnaient Cu(II).

La modélisation moléculaire de l'ion à l'aide de B3LYP/LanL2DZ a déterminé que le complexe énergétique le plus bas était Cu(II) coordonné par l'intermédiaire de l'imidazole N de son1 et des azotes déprotonatisés des groupes d'amide sydorsales de Cys2 et Gly3. Cependant, en dessous d'un pH de 6, l'ajout de Cu(II) à amb1 a formé un modèle d'isotope m/z qui ne pouvait être expliqué que par la liaison Cu(I), formant le [amb1ox'Cu(I)]' ion (Figure 2B). En revanche, un pH supérieur à 6 a fait diminuer le modèle isotopique m/z de 1 m/z, en raison del'ion chargé positif [amb1ox'H-Cu(II)] L'ajout de Zn(II) n'a pas oxydé amb1, et zn(II) de liaison a été observée à un pH de 'gt;6, formant principalement le [amb1'3H'Zn(II)]- ion (Figure 2C). Ceci a indiqué la déprotonation des groupes d'imidazoliums, de thiol, et de carboxyl. La modélisation moléculaire de la coordination [amb1-3H-Zn(II)]- ion a déterminé que les conformateurs d'énergie les plus faibles étaient soit la coordination tétraèdre Zn(II) via 2His-2Cys ou His-2Cys et le carboxylate du C-terminus.

Liaison Multiple Cu(I) d'amb2
Les réactions redox entre Cu(II) et amb2 (Figure 1B) ont abouti à Cu (I) de liaison. Ceci a été étudié plus en détail en utilisant IM-MS, UV-Vis spectrophotometry, et B3LYP modélisation moléculaire37. Les principaux produits de la titration Cu(II) d'amb2 à un pH de 5 étaient l'oxydation amb2 (par la formation de pont disulfure) et les espèces non oxydées amb2 coordonnant trois Cu(I) ions.

Une recherche utilisant la méthode B3LYP/LanL2DZ a localisé deux complexes de faible énergie qui se disputaient les espèces coordonnées 3Cu(I). Le premier était le complexe montré dans la figure 3A, où les ions 3Cu (I) ont été coordonnés par l'intermédiaire des groupes de thiolate de transition38 de Cys2 et Cys6 (de son1) ainsi que N1 et N5 (de ses5 ). Le deuxième complexe (3c) a un pont salé entre le groupe latéral protoné son1 et le groupe de carboxylate C-terminal. Ces résultats suggèrent qu'à un pH de 3,0 à 6,0, le complexe principal amb2'3Cu(I) est la structure à pont salé, qui peut être transférée avec succès de la solution à la phase de gaz avec seulement un minimum de réarrangement structurel.

Le CCS théorique LJ de 209 à 6 x2, calculé à l'aide du programme Sigma36 pour le complexe 3c, est d'accord avec le CCS mesuré IM-MS, ce qui indique que 3c représente [amb2'2H'3Cu(I)]- conformation au pH 3.0-6.0. Cependant, à un pH de 6, ce complexe n'a pas été observé par IM-MS, probablement parce que la déprotonation de son1 (pKa6,0) se traduit par un complexe neutre global. Une fois que le groupe d'imidazoleum de Son1 est déprotonated, la coordination 3Cu(I) peut convertir aux groupes de thiolate de pontage des Cys2 et Cys6 ainsi que de N1 et N5 de son1 et son5, respectivement (3a).

La dépendance au pH de l'activité de liaison et de redox amb4 Cu(I/II)
Les techniques IM-MS et B3LYP ont été utilisées pour étudier les titrations Cu(II) et pH d'amb4 (figure 1C) et ont identifié des complexes monomères, dimères, trimères et tétramères de l'amb4 contenant jusqu'à trois cu(I) ions ou deux Cu(II ) ions pour chaque sous-unité monomère39. Les complexes contenaient également divers nombres de ponts de disulfure, et ces produits ont été produits si oui ou non les réactions De Cu(II) avec amb4 ont été menées dans des solutions anaérobies ou aérobies aqueuses.

À l'aide de la technique IM-MS, il a été démontré que ces espèces individuelles pouvaient être séparées et quantifiées même si elles avaient des schémas isotopiques qui se chevauchaient en raison de différences dans leurs heures d'arrivée (figure 4). L'identification et la quantification de ces espèces étroitement apparentées est une tâche qu'aucune autre technique instrumentale ou analytique ne peut accomplir. Ces études IM-MS fournissent un aperçu considérable des réactions redox dépendantes du pH et identifient exactement le nombre de ponts de disulfure inter- ou intramoléculaires, le nombre d'ions Cu(I) ou Cu(II) et le nombre de sites de déprotonation dans chacun des complexes ( Figure 5).

En outre, la mesure des complexes CCS a également permis de déterminer de chacune des espèces spécifiques de taille conformationnelle, qui a été utilisé avec une recherche étendue B3LYP/LanL2DZ pour localiser les conformistes avec des structures qui sont d'accord avec les deux moléculaires corrects stoichiométrie et csc mesurés par IM-MS. Grâce à cette méthode, la coordination Cu(I/II) des différents complexes a été identifiée. Les réactions entre Cu(II) et amb4 ont inclus la formation des dimers, des garnitures, et des tetramers coordonnant cu (I) ou Cu(II), selon le pH de la solution.

Par exemple, dans les solutions qui étaient légèrement acides (pH de 3,0 à 6,0), ils liaient principalement les ions Cu(I) et n'étaient pas oxydés, tandis que dans les solutions qui étaient légèrement basiques (pH - 8,0 à 11,0), ils liaient principalement les ions Cu(II) et étaient oxydés par tous les Cys formant le disulfure obligations (figure 6). Le B3LYP/LanL2DZ a déterminé que les ions Cu(I) étaient linéaires et pontés par les groupes de thiolate et d'imidazole, tandis que les ions Cu(II) étaient chélatés par des géométries planaires en forme de T ou carrées déformées par un imidazole ainsi que par les azotes de l'épine dorsale déprotonated de groupes amide.

Analyse IM-MS de mb-OB3b
Les études IM-MS19,40 de mb-OB3b (Figure 1D) ont montré que dans la phase gazeuse, Cu(I)-free mb-OB3b existe comme trois espèces chargées négativement: [mb-OB3b-H]-, [mb-OB3b-2H]2 ,et [mb-OB3b-3H] 3,conformément au comportement prévu en phase de solution. Des titrations individuelles d'ions métalliques ont été effectuées19 pour déterminer la sélectivité de l'ion métallique du mb-OB3b. La figure 7 montre les résultats des titrations d'ion séniors et montre que la sélectivité de liaison apparente du mb-OB3b peut être classée dans trois grands groupes : 1) Cu(I) et Ag(I); 2) Ni(II), Zn(II) et Co(II); et 3) Pb(II), Fe(II) et Mn(II). Cet ordre de sélectivité contraignante s'est avéré être en accord général avec celui trouvé par les expériences d'étanchéité à la fluorescence19 et la calorimétrie de titration isothermale18.

Comparaison de mb-OB3b et amb 7 Annonces sélectivité de liaison métallique
La sélectivité de liaison apparente du mb-OB3b a été comparée à la sélectivité de liaison de l'amb7 à un pH de 7. L'amb7 a été conçu avec la même séquence d'acide aminé que mb-OB3b, mais avec les deux groupes d'oxazolone enéthiol remplacés par deux groupes His-Cys. L'amb7 (Figure 1E) a un lien unique disulfure entre Cys6 et Cys12. Les résultats de la formation de complexes chargés négatifs (figure 8) ont montré que l'amb7 préférait la sélectivité contraignante pour Ni(II) et Zn(II) (60 %), suivie de Co(II) et pb(II) (40 %). En outre, il y avait environ 20% Cu(II) contraignant. Il y avait soit trace ou pas amb7 liaison d'Ag(I), Mn(II), ou Fe(II). Ceci par rapport à la sélectivité de liaison préférée de mb-OB3b de plus de 90% pour la liaison Cu(I) et Ag(I).

Figure 1
Figure 1 : Structures primaires des peptides alternatifs de méthanobacttine (amb) et de méthanobacttine (mb-OB3b). (A) Acetyl-His1-Cys2-Gly3-Pro4-His5-Cys6 (amb1); (B) acetyl-His1-Cys2-Tyr3-Pro4-His5-Cys6 (amb2); (C) acetyl-His1-Cys2-Gly3-Ser4-Tyr5-Pro6-His7-Cys8-Ser9 (amb4); (D) 1-(N-[mercapto-(5-oxo-2-(3-methylbutanoyl)oxazol-(Z)-4-ylidene)methyl]-Gly1Ser2'Cys3'Tyr4)-pyrrolidin-2-yl-(mercapto-[5-oxo-oxazol-(Z)-4-ylidene]methyl)-Ser5 -Cys6-Met7 (mb-OB3b); et (E) acetyl-Leu1-His2-Cys3-Gly4-Ser5-Cys6-Tyr7-Pro8-His9-Cys10-Ser11-Cys12-Met 13 (amb7). L'ombrage montre les sites de liaison : 2His-2Cys ou enethiol-oxazolone ( );Icon charnières proline ou pyrrolidine ( );Icon groupe d'acétyl ou de méthylbutanol N-terminus ( );Icon et la tyrosine, qui peut stabiliser la coordination des ionsIconmétalliques par une deuxième coque de solvation et une interaction de cation (). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Intensités relatives moyennes de la méthanobacttine alternative (amb1) acétyl-His1-Cys2-Gly3-Pro4-His5-Cys6 and metal-bound complex (amb1x) (où X et Cu ou Zn). Des observations ont été faites lors d'analyses négatives et positives de spectrométrie de masse d'ions de la solution de rapport molaire 1:1 de l'amb :XCl2 sur la plage de pH de 3,0 à 11,0. Les barres d'erreur montrent des écarts types des moyens de l'intensité relative et du pH de trois expériences de titration de pH de répétition. La solution molaire 1:1 d'amb:CuCl2 a eu comme conséquence l'oxydation de l'amb(amb ox) avec Cys2 et Cys6, formant un pont de disulfure. (A) Analyse négative des ions de l'amb:CuCl2 montrant[bœufamb H]et [amb ox'3H'Cu(II)]. (B) Analyse positive des ions d'amb:CuCl2 montrant[amb ox]et [amb ox(I/II)]; l'état d'oxydation de Cu dans le complexe était dépendant du pH, étant [ambbœufCu(I)];  en dessous d'un pH de 8 et [ambox'H'Cu(II)]; au-dessus d'un pH de 8. (C) Analyse négative des ions de l'amb:ZnCl2 montrant [amb]net et [amb-Zn(II)]n.. (D) Analyse positive des ions d'amb:ZnCl2 montrant [amb]net et [amb-Zn(II)]n . Ce chiffre a été adapté d'une publication précédente20. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Structures proposées de [amb2'3Cu(I)]- utilisant les structures les plus basses optimisées en énergie et en géométrie situées à partir du niveau de théorie B3LYP/LanL2DZ. (A) 3 Cu (I) coordination via 'N1'N5 de son1 et ses5 et thiolate reliant les groupes de thiolate de Cys2 et Cys6 avec une section théorique de 217 '6 '2. (B) Illustration de la coordination de pontage de n1N n5 et de thiolate. (C) Structure pontée de sel montrant la coordination 3 Cu(I) via le terminal carboxylate (Cys6), N5, et le pont ageavec une section transversale théorique de 209 à 6x 2. (D)Illustration du terminal carboxylate, N5, et coordination de pontage thiolate. Les distances de liaison A, B, C, D, E et F sont indiquées dans l'unité d'O. Ce chiffre a été adapté d'une publication précédente37. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Analyse IM-MS des produits du mélange 1:1 d'amb4:Cu(II) au pH 4,4.  (A) Modèles d'isotopes extraits pour les [amb4'2H'3Cu(I)]', [diamb4'4H'6Cu(I)]2 ',[triamb4'6H'9Cu(I)]3 et [tétraamb4'8H '12Cu(I)]4 '. (B) Intégration des heures d'arrivée extraites de [amb4'2H '3Cu(I)],[diamb4'4H '6Cu(I)]2 ',[triamb4'6H '9Cu(I)]3 'et [tétraamb4'8H '12Cu(I)]4 ont été utilisés pour calculer leur intensité relative. Pour calculer le pourcentage d'intensités relatives, la somme de la zone intégrée pour toutes les espèces extraites pour chaque point de titration a été utilisée pour normaliser à l'échelle de pourcentage. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Modification du modèle isotopique pour le Cu (I/II) lié à l'amb4 observé au cours de la titration du pH des équivalents molaires de Cu(II):amb4 au pH 4,04, 6,02 et 9,98. Au pH 4,04, le résultat expérimental correspond principalement au modèle isotopique pour [amb4'Cu(I)]'. Au pH 6,02, il y a un décalage de -2 m/z, signifiant la formation du pont de disulfure (indiqué comme oxydation de l'amb4ox)et un accord avec le modèle d'isotope pour [amb4oxCu(I)]. Au pH 9,98, il y a un autre décalage de -1 m/z, signifiant la liaison Cu(II) et l'enlèvement d'un proton pour maintenir l'état de charge no 1, qui correspond ensuite au modèle isotopique pour [amb4ox'H'Cu(II)]. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Modification des intensités relatives des identités des complexes Cu(I/II) du monomère, du dimère et du trimère de l'amb4 au-dessus de la plage de pH de 3,0 à 11,0.  (A) Monomer avec un ion Cu(I/II), (B) dimère avec 2 ions Cu(I/II) et (C) trimère avec 3 cu(I/II) ions. Les légendes indiquent combien d'obligations disulfures étaient présentes dans le complexe. Ce chiffre a été adapté d'une publication précédente39. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7
Figure 7 : Pourcentage de formation des complexes Cu(I), Ag(I), Zn(II), Ni(II), Co(II), Mn(II), Pb(II) ou Fe(II) de méthanobacttine. Observé pendant les titrations d'ions métalliques individuelles de la méthanobacttine. Il convient de noter que la liaison Cu(I) a résulté de l'ajout de Cu(II) et Fe(II) de liaison de l'ajout de Fe(III). Ce chiffre a été adapté d'une publication précédente19. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 8
Figure 8 : Comparaison du pourcentage de chélation De Cu(I/II), Ag(I), Zn(II), Ni(II), Co(II), Mn(II), Pb(II) ou Fe(II) chelation par mb-OB3b et amb7 au pH 7. La comparaison est pour la formation d'ions chargés négativement. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Supplementary File
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Discussion

Étapes critiques : conservation des comportements en phase de solution pour examen via ESI-IM-MS
Les paramètres instrumentaux eSI indigènes doivent être utilisés pour conserver la stoichiométrie des peptides, l'état de charge et la structure conformationnelle. Pour les conditions indigènes, les conditions dans la source ESI telles que les tensions du cône, les températures et les flux de gaz doivent être optimisées. En outre, les pressions et les tensions dans la source, le piège, la mobilité ionique, et les ondes de déplacement de transfert (en particulier le biais de piège DC qui contrôle la tension d'injection dans la cellule de GI) doivent être vérifiés pour leurs influences sur les distributions de mobilité d'état de charge et d'ion.

Voici les conditions d'exploitation typiques qui ont été utilisées dans ce travail. Les échantillons de peptides aqueux ont été injectés à l'aide d'une seringue émoussée de 1,0 mL à l'aide d'un débit de 10 min1, d'une tension capillaire de 2,0 kV pour les ions positifs (MD) ou de 1,8 kV pour les ions négatifs (-), la température de source de 130 oC, la désolvation de 20 V et le cône d'échantillonnage de 2,0 V et de 4,0 V. cône d'extraction. La section DE GI a été actionnée avec la tension d'entrée de 6.0 V à la cellule de piège avec une pression d'argon de 2.25 x 10-2 mbar utilisant un débit de 1.5 mL/min. La tension pour l'injection d'ions (biais de piège DC) dans la cellule de GI a été fixée à 12 V pour éviter la dissociation des ions comme ils sont entrés en collision initiale avec le gaz tampon d'azote. La cellule IM séparait les ions en fonction de leur charge et de leur collision transversale et utilisait une pression d'azote de 0,52 mbar et un débit de 20,0 ml min1. La GI a été actionnée avec des vitesses d'onde de 12,0 à 20,0 V (en 20,0 V) ou de 8,0 à 30,0 V (-MD) et a atteint une vitesse de 800 à 1 500 m s 1 (en1) ou de 250 à 1 000 m s1 (m) pour chaque balayage à travers la cellule de l'onde de déplacement de la MESSAGERIE. La cellule de transfert a été actionnée avec la même pression d'argon que la cellule de piège et a guidé les ions résolus de GI à l'analyseur orthogonale de masse-à-charge de temps-de-vol. Les spectres de masse de mobilité ionique ont été acquis en synchronisant la libération fermée des ions dans la cellule de GI avec l'analyseur de masse à charge de temps de vol.

À l'aide de conditions ESI natives, les propriétés en phase de solution telles que l'état de charge et l'état de conformation ne sont pas conservées lors des analyses IM-MS. Par exemple, les états de charge de mb-OB3b et d'ambs observés lors des analyses IM-MS20,37 étaient étroitement liés aux états de charge attendus dans la phase de solution40. Le peptide mb-OB3b est tétraprotique et ne forme que des ions chargés négativement au cours de l'analyse IM-MS40, qu'il s'agisse de Cu(I) lié ou Cu(I)-libre, parce qu'il contient le C-terminus (pKa lt; 1,7), deux groupes d'oxazolone enethiol (pKa 5,0 et 9.7), et le groupe Tyr (pKa 11,0)42. Les ambs dans leur forme entièrement protonée auront une charge globale de 2 en raison du C-terminus (pKa 2), deux Son (pKa 6,0), deux Cys (pKa 8,3), et Tyr (pKa 11,0) sites19,41. Ainsi, ils forment généralement des ions chargés positivement à un pH de 'lt;6 et des ions chargés négativement à un pH de 'gt;6.

Les ambs ont également montré le comportement de liaison Cu(I/II) clairement pH-dépendant et l'activité redox dans laquelle Cu (I)-contraignant à un pH bas transitioned à Cu(II) liant à un pH plus élevé. Les réactions de Cu(I/II) comprenaient la formation de l'espèce d'amb oxydée(amb ox) qui contenait des liaisons de disulfure et divers multimères et de multiples liaisons Cu(I/II)(figure 5 et figure 6). Ces réactions redox sont dépendantes du temps et il a été démontré que plus l'intervalle de temps (jusqu'à 210 min) entre la préparation de l'échantillon et les analyses IM-MS a été observé37. Par conséquent, un examen attentif de la dépendance au temps de réaction à l'observation des produits est également nécessaire.

Limitations : Les transversaux IM-MS et les collisions théoriques identifient le type de coordination que chaque ion métallique préfère
Pour aider à interpréter les données IM-MS m/z et CCS, une recherche approfondie a été effectuée à l'aide du niveau de théorie B3LYP/LanL2DZ. Les conformateurs optimisés en géométrie avec différents sites de coordination ont été comparés entre leur énergie libre prévue et leur accord avec le CSC mesuré par IM-MS. La modélisation moléculaire de ces peptides et de leurs complexes est limitée par le type d'électronique calculs de structure qui peuvent être appliqués à ces systèmes relativement grands. D'autres méthodes qui ont été étudiées ou recommandées comprennent les travaux de Truhlar et coll.43, qui ont constaté que M05-2X était le meilleur DFT fonctionnel et PM7 et MNDO/d étaient de bonnes méthodes semi-empiriques NDDO pour Zn(II)-contenant des composés44. Ces peptides ont un grand espace conformationnel et une enquête approfondie pour localiser les plus faibles conformations d'énergie doivent inclure la comparaison des différents sites de chélage de métal, diverses liaisons cis- et trans-peptides, ponts de sel, liaison d'hydrogène, et '-cation interaction entre le groupe aromatique du côté Tyr et la cation métallique.

Importance en ce qui concerne les méthodes existantes : Cu(I/II) et d'autres liaisons d'ions métalliques sélectionnées par rapport à mb-OB3b et ambs
La cristallographie aux rayons X et la spectroscopie RMN sont les techniques les plus courantes utilisées pour déterminer la résolution atomique de la structure tertiaire des peptides. Cependant, les études de cristallographie aux rayons X des métallopeptides sont rares en raison de problèmes avec la cristallisation de ces complexes45. La RMN ne convient pas non plus à l'interprétation d'un échantillon où des oligopeptides individuels étroitement apparentés sont présents46. Par conséquent, la modélisation moléculaire IM-MS et DFT sont des techniques alternatives pour étudier les réactions peptidiques en particulier celles qui résultent de réactions complexes de redox et de Cu(I/II)20,37,40, 47. La force de la SIm est qu'elle peut résoudre chacun des produits et identifier leur composition moléculaire en mesurant simultanément leur m/z et les heures d'arrivée qui se rapportent à la stoichiométrie, à l'état de protonation et à la structure conformationnelle.

Par exemple, le mb-OB3b chélateunera une variété d'ions métalliques, et sa sélectivité à l'égard de chaque ion a été affichée par les titrations d'ions métalliques IM-MS (figure 7). Les résultats ont montré la préférence mb-OB3b pour la liaison Cu(I) et Ag(I), tout en comparant les résultats à un pH de 7 avec amb7. La figure 8 montre amb7 chélates préférentiellement Zn(II) et Ni(II). En général, les études amb ont montré que le remplacement des deux enéthol-oxazolones par 2His-2Cys n'excluait pas Cu (I/II)-contraignant, mais il a eu comme conséquence multiple Cu(I)-contraignant par la coordination linéaire-pontage (figure 3) par opposition au Cu mononucléaire (I) la coordination tétraèdre de mb-OB3b48. La réduction de Cu(II) a également été négociée par l'oxydation de thiol et la formation de pont de disulfure contrairement au pont disulfure existant dans apo-mb-OB3b et au potentiel élevé de réduction pour le mb-OB3b chargé de cuivre, qui soutient la forte préférence pour Cu(I)49 .

Applications futures
D'autres études IM-MS des peptides d'amb sont en cours, dans lesquelles leur séquence primaire est modifiée en remplaçant le His ou Cys par Gly ou Asp, tandis que le résidu de Tyr est remplacé par Gly ou Phe. Ces études sont également menées dans 10,0 mM d'acétate d'ammonium, avec le pH modifié avec de l'hydroxyde d'ammonium (pour le pH 7, 8 et 9) pour maintenir la force ionique totale constante pour chaque échantillon. Ces résultats seront publiés sous peu.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ce matériel est basé sur les travaux soutenus par la National Science Foundation en vertu de 1764436, le soutien des instruments NSF (MRI-0821247), la Fondation Welch (T-0014), et les ressources informatiques du ministère de l'Énergie (TX-W-20090427-0004-50) et L3 Communications . Nous remercions le groupe Bower de l'Université de Californie - Santa Barbara pour le partage du programme Sigma et Ayobami Ilesanmi pour la démonstration de la technique dans la vidéo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
acetonitrile HPLC-grade Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A998SK-4
ammonium hydroxide (trace metal grade) Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A512-P500
cobalt(II) chloride hexahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 255599-5G
copper(II) chloride 99.999% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203149-10G
copper(II) nitrate hydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 229636-5G
designed amb1,2,3,4,5,6,7 peptides Neo BioLab (neobiolab.com) designed peptides were synthized by order
designed amb5B,C,D,E,F peptides PepmicCo (www.pepmic.com) designed peptides were synthized by order
Driftscope 2.1 software program Waters (www.waters.com) software analysis program
Freeze-dried, purified, Cu(I)-free mb-OB3b cultured and isolated in the lab of Dr. DongWon Choi (Biology Department, Texas A&M-Commerce)
glacial acetic acid (Optima grade) Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A465-250
Iron(III) Chloride Anhydrous 98%+ Alfa Aesar (www.alfa.com) 12357-09
lead(II) nitrate ACS grade Avantor (www.avantormaterials.com) 128545-50G
manganese(II) chloride tetrahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203734-5G
MassLynx 4.1 Waters (www.waters.com) software analysis program
nickel chloride hexahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203866-5G
poly-DL-alanine Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) P9003-25MG
silver nitrate 99.9%+ Alfa Aesar (www.alfa.com) 11414-06
Waters Synapt G1 HDMS Waters (www.waters.com) quadrupole - ion mobility- time-of-flight mass spectrometer
zinc chloride anhydrous Alfa Aesar (www.alfa.com) A16281

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