Etiquetado de inmunofluorescencia de trampas extracelulares de neutrófilos humanos y murinos en tejido incrustado por parafina

Medicine
 

Summary

Las trampas extracelulares de neutrófilos (NET) son estructuras tridimensionales generadas por granulocitos neutrófilos estimulados. En los últimos años ha quedado claro que los NET están implicados en una amplia variedad de enfermedades. La detección de NETs en el tejido puede tener relevancia diagnóstica, por lo que se requieren protocolos estandarizados para etiquetar los componentes NET.

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Abu Abed, U., Brinkmann, V. Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue. J. Vis. Exp. (151), e60115, doi:10.3791/60115 (2019).

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Abstract

Los granulocitos neutrófilos, también llamados leucocitos polimorfonucleares (PMN) debido a su núcleo lobulado, son el tipo más abundante de leucocitos. Maduran en la médula ósea y se liberan en la sangre periférica, donde circulan durante aproximadamente 6 x 8 h; sin embargo, en el tejido, pueden sobrevivir durante días. Por diapedesis a través del endotelio, salen del torrente sanguíneo, entran en los tejidos y migran hacia el sitio de una infección después de gradientes quimiotácticos. Los neutrófilos pueden combatir los microorganismos invasores por fagocitosis, desgranulación y generación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET). Este protocolo ayudará a detectar NETs en tejido incrustado en parafina. Los NET son el resultado de un proceso llamado NETosis, que conduce a la liberación de componentes nucleares, granulares y citoplasmáticos, ya sea de neutrófilos vivos (NETosis vital) o moribundos (NETosis suicida). In vitro, los NET forman estructuras similares a las nubes, que ocupan un espacio varias veces mayor que el de las células de las que descendieron. La columna vertebral de los NETs es la cromatina, a la que se unen una selección de proteínas y péptidos procedentes de gránulos y citoplasma. De este modo, se mantiene una alta concentración local de compuestos tóxicos para que los NET puedan capturar e inactivar una variedad de patógenos, incluyendo bacterias, hongos, virus y parásitos, mientras que la difusión de los componentes de LA NET altamente activos que conducen a daños en tejido vecino es limitado. Sin embargo, en los últimos años se ha hecho evidente que las NET, si se generan en abundancia o se borran insuficientemente, tienen un potencial patológico que va desde enfermedades autoinmunes hasta cáncer. Por lo tanto, la detección de NETs en muestras de tejido puede tener significación diagnóstica, y la detección de NETs en tejido enfermo puede influir en el tratamiento de los pacientes. Dado que las muestras de tejido incrustadoen de parafina son la muestra estándar utilizada para el análisis patológico, se buscó establecer un protocolo para la tinción fluorescente de componentes NET en tejido incrustado en parafina utilizando anticuerpos disponibles comercialmente.

Introduction

Las trampas extracelulares de neutrófilos (NET) tienen una estructura tridimensional compleja. El análisis microscópico de escaneo electrónico de alta resolución reveló que consisten en fibras lisas con un diámetro de 15 a 20 nm (cromatina) salteada con dominios globulares de >25 nm que presumiblemente consisten en una variedad de aproximadamente 30 granulares y citoplasmáticas proteínas y péptidos1,2. Cuando se generan in vitro a partir de neutrófilos aislados, las NET se pueden identificar mediante la tinción de dos o más de sus componentes por inmunofluorescencia (por ejemplo, histonas y neutrófilos elastasa [NE]). En leucocitos polimorfonucleares no estimulados (PMN), las histonas se encuentran exclusivamente en el núcleo, mientras que NE está contenida en gránulos. Durante la NETosis, NE entra en el núcleo, donde procesa las histonas3,4. Los NET se caracterizan por la colocación de componentes, que están claramente separados en neutrófilos no estimulados. Dado que actualmente no existen anticuerpos que detecten exclusivamente epítopos específicos de NET (es decir, no reaccionan con neutrófilos ingenuos), la detección de la colocalización de proteínas neutrófilas en los NET es la única manera de identificar los NET.

En el tejido, las NET difícilmente pueden ser detectadas por las manchas histológicas convencionales (por ejemplo, manchando con hematoxilina/eosina [H&E], que representa los NET como un tinte azulado pálido difuso). Sólo cuando son muy abundantes, los NET se pueden distinguir claramente con la tinción de H&E, como en thrombi5. Dado que los NET son difusos per se, la estructura tisular tiene que ser preservada de manera óptima, por lo que las criopreparaciones que son propensas a inducir artefactos de congelación son subóptimas para el análisis de NETs en el tejido. En su lugar, se ha demostrado que la fijación de formaldehído y la incrustación de parafina conservan la estructura NET en el pozo de tejido2. (La inspección inmuno-)histológica de secciones de tejido incrustado en parafina es el método estándar para el análisis patológico. Como el tejido en bloques de parafina se conserva incluso a temperatura ambiente (RT), los especímenes de tejido del trabajo de diagnóstico diario se pueden comparar con muestras que se han preparado hace años, con preguntas y técnicas que han surgido recientemente. Los NET en el tejido no se han detectado hasta hace poco, y el análisis detallado de la formación y eliminación de redes de redes en el curso de las enfermedades puede dar lugar a nuevos conocimientos sobre la patogénesis. El uso de tejido incrustado en parafina tiene la ventaja inestimable de permitir el análisis de material de archivo y para llevar a cabo estudios retrospectivos6. Innegablemente, estos beneficios tienen un costo. Antes de incrustarlo en parafina, el tejido debe ser fijado por formaldehyde, deshidratado y calentado por encima de 50oC. Estos procedimientos inducen la autofluorescencia tisular, así como el enmascaramiento de epítopos.

Para limitar los artefactos de fijación, el tiempo de fijación debe mantenerse al mínimo, por lo que el tamaño de las muestras de tejido no debe exceder un área de 20 mm x 30 mm con un grosor de 3 mm. Las muestras de este tamaño se fijan completamente después de la incubación durante la noche en RT en formaldehído, idealmente seguidas de deshidratación directa e incrustación de parafina. Alternativamente, las muestras fijas se pueden almacenar durante 1 o 2 días en el búfer. Para estudios de inmunofluorescencia, el fijador debe prepararse recién a partir de paraformaldehído disuelto en un tampón adecuado (por ejemplo, solución salina con búfer de fosfato [PBS] o solución salina con tris tampón [TBS]). Durante la preparación fijadora, la temperatura debe mantenerse por debajo de 60 oC para evitar la formación de ácido fórmico. La formalina, que es un fijador estándar para la patología, no debe utilizarse ya que contiene metanol, otros aldehídos, cetonas y ácido fórmico. Estas impurezas conducen a un aumento del enmascaramiento del epítopo y a una autofluorescencia significativa del tejido.

Para un inmunoetiquetado exitoso, el enmascaramiento de epítopos tiene que revertirse en un proceso llamado recuperación de antígenos. Las secciones de tejido se calientan en un tampón adecuado, que se cree que rompe los puentes de metileno, por lo que los epítopos se vuelven accesibles a los anticuerpos7. Para la detección de NETs, la recuperación de epítopos inducidapor por calor (HIER) se prefiere a otros métodos como el uso de enzimas proteolíticas. Habitualmente, el inmunoetiquetado de las secciones de parafina se lleva a cabo con un único anticuerpo seguido de un anticuerpo secundario etiquetado con peroxidasa, que se detecta con un sustrato precipitante. En comparación con la inmunofluorescencia, los métodos de detección basados en enzimas tienen una resolución espacial más baja debido a la difusión del precipitado de sustrato, y generalmente, la detección simultánea de más de un antígeno está limitada6.

Como actualmente no existen anticuerpos que se unan exclusivamente a los NET, este protocolo se utiliza para etiquetar dos proteínas, la histona 2B, que es nuclear, y la aslostasa de neutrófilos, que se localiza en gránulos. En los neutrófilos no estimulados, estas proteínas se separan, pero se colocalizan en neutrófilos sometidos a NETosis y en NETs. La detección simultánea de dos antígenos se puede lograr con dos anticuerpos primarios criados en diferentes huéspedes y dos anticuerpos secundarios específicos de cada especie etiquetados con diferentes fluorocromos. Este informe es una estandarización de nuestro protocolo8 publicado anteriormente y utiliza una combinación de dos anticuerpos disponibles comercialmente que manchan de forma fiable los componentes de NET en tejido incrustado en parafina, tanto frescocomo como de archivo, de origen humano y murino.

Protocol

Los protocolos de tejidos fueron aprobados por Landesamt f'r Gesundheit und Soziales, Berlín, Alemania (G0121/16). Los experimentos se llevaron a cabo de conformidad con la directiva europea 2010/63/UE sobre cuidado, bienestar y tratamiento de los animales.

1. Fijación, deshidratación, incrustación de parafina, seccionamiento, montaje de secciones

  1. Preparar una solución de formaldehído al 2% disolviendo paraformaldehído en TBS (pH 7.4). Evitar el calentamiento por encima de 60 oC. Cool to RT. La solución de formaldehyde se puede almacenar a -20 oC.
  2. Coloque el tejido fresco (aquí: pulmón de ratón) en un plato de vidrio de Petri con TBS. Con un bisturí, diseccione en trozos que no superen los 20 mm x 30 mm x 3 mm de tamaño. Sumerja la muestra en una solución de formaldehida del 2% en TBS.
    NOTA: El volumen de fijador debe ser al menos 20 veces el del tejido.
  3. Fijar en RT para 8 x 20 h. Transfiera las muestras a TBS.
  4. Deshidratar usando una serie de etanol (70%, 80%, 90%, 96%, 100%, 100%), con cada paso que dura 1 h.
  5. Muestras claras 2x en 100% xileno (dimetilbenceno), cada paso 1 h.
  6. Sumergir en parafina 2x a 60 oC (temperatura de fusión 54 o 56 oC), cada paso 1 h.
  7. Monte las muestras utilizando moldes de incrustación, utilice la parte inferior del cassette como cubierta.
  8. Deje que la parafina se solidifique y elimine los moldes de incrustación.
  9. Preparar las secciones de tejido de 3 m y dejarlas flotar en un baño de agua a 37 oC.
  10. Flotar secciones sobre la superficie del agua sobre los portaobjetos de vidrio adhesivo(Tabla de materiales).
  11. Incubar secciones en los portaobjetos durante la noche a 40 oC para unir el tejido al vaso.

2. Rehidratación, recuperación de epítopos inducidos por calor, tinción, montaje, análisis microscópico

  1. Colocar secciones en los portaobjetos de vidrio en bastidores y sumerjalos en los medios utilizados para la deshidratación y la limpieza, en orden inverso, con cada paso durante 5 min: 2x 100% xileno, serie de etanol (2x 100%, 96%, 90%, 80%, 70%).
  2. Calentar un baño de agua con una placa caliente de temperatura controlada a 70 oC. Colocar un frasco lleno de epítopos inducidos por calor (HIER)-buffer (pH 9; Tabla de Materiales), que contiene 10% de glicerol como tampón de temperatura, en un baño de agua. Cuando el búfer HIER haya alcanzado los 70 oC, coloque el bastidor con diapositivas en el frasco del tampón.
  3. Incubar toboganes durante 120 min a 70oC.
  4. Retire el frasco del baño de agua y déjelo enfriar a RT. Enjuague las secciones 3x con agua desionizada y una vez con TBS (pH 7.4).
  5. Retire cuidadosamente el líquido de las diapositivas entre las secciones con papel de filtro laminado o hisopo de algodón, dejando las secciones hidratadas.
  6. Cree barreraalrededores con una pluma de barrera hidrófoba.
  7. Incubar secciones en tampón de bloqueo (1% albúmina sérica bovina [BSA], 2% de suero de burro normal, 5% gelatina de pescado de agua fría y detergentes [Tabla de materiales] en TBS) a RT durante 30 minutos para evitar la unión inespecífica.
  8. Diluir los anticuerpos primarios a una concentración de 1 g/ml en el tampón de bloqueo.
    NOTA: Para los NET humanos y de ratón, se puede utilizar una combinación de anticuerpos de conejo contra la elastasa de neutrófilos y anticuerpos de pollo contra Histone 2B(Tabla de materiales).
  9. Coloque los portaobjetos en una cámara húmeda. Retire el tampón de bloqueo y agregue los anticuerpos primarios diluidos sin lavar los platos con el volumen suficiente para evitar el secado. Selle la cámara húmeda con película de parafina e incuba durante la noche en RT.
  10. Lave las secciones 3x con TBS durante 5 min cada una.
  11. Preparar la solución de trabajo de anticuerpos secundarios en el tampón de bloqueo. Para la detección de anticuerpos primarios, utilizar anticuerpos secundarios criados en burro y pre-absorbidos contra proteínas séricas de múltiples especies(Tabla de Materiales). Cubra las secciones de tejido con solución de trabajo de anticuerpos secundarios. Transfiera los portaobjetos a la cámara húmeda, selle con película de parafina. Incubar durante 1 h a RT.
    NOTA: Burro anti conejo conjugado con Cy2 y burro anti pollo conjugado con Cy3 se puede combinar con una contramancha de ADN.
  12. Lavar las secciones 3x durante 5 min cada una con TBS, luego una vez durante 5 min con agua desionizada.
  13. Cubra las secciones con medio de montaje(Tabla de materiales)y aplique el vidrio de la cubierta evitando la formación de burbujas.
  14. Deje que el medio de montaje se solidifique y, a continuación, analice la inmunofluorescencia utilizando un microscopio de campo ancho con filtros de paso de banda apropiados o un microscopio confocal.

Representative Results

Con este protocolo, los componentes de NET se pueden detectar correctamente en el tejido incrustado en parafina, tanto de origen humano como murino. En neutrófilos no estimulados, H2B se encuentra exclusivamente en el núcleo y laastasa de neutrófilos en gránulos; consecuentemente, sus señales de fluorescencia no se superponen. Por el contrario, durante la NETosis y después de la formación de LA NET, NE, H2B, y ADN colocalizan parcialmente. Si se imaginan como señales verdes, rojas y azules, las áreas de colocación se representan como superposición blanquecina(Figura 1G, Figura 2Dy Figura 3D). Esta superposición también se puede cuantificar mediante el software de análisis de imágenes. Los píxeles de las señales superpuestas que son positivas para verde, rojo y azul se han utilizado para crear una superposición púrpura que representa las áreas NET en la Figura 1G', Figura 2D', y Figura 3D'. Algunas de las células de la Figura 1 y la Figura 2 tienen núcleos lobulados, pero son negativas para NE. Se cree que estas células son granulocitos eosinófilos.

Si las secciones de tejido tienen un espesor de 2-3 m, se pueden analizar mediante microscopía de campo ancho utilizando objetivos de 10x o 20x. Un ejemplo se presenta en la Figura 1, que representa una sección de tejido de apendicitis humana manchada para NE (verde), H2B (rojo) y Hoechst 33342 (azul). Los paneles A, C, E y G proceden de un área de la sección que contiene NETs, mientras que los paneles B, D, F y H proceden de un área diferente de la misma sección, que contiene numerosos neutrófilos(Figura 1B,NE) pero sin NETs. Las áreas con formación masiva de REDES se pueden encontrar fácilmente incluso en aumentos bajos, ya que los tres componentes NET colocalizan, a menudo en estructuras extracelulares rígidas, que en la superposición de los tres canales aparecen como fibras extracelulares blanquecinas(Figura 1G ), superposición púrpura en la Figura 1G'.

Los patrones de tinción de ambas áreas tisulares son claramente diferentes, con NE contenido en gránulos(Figura 1B)y ADN en núcleos(Figura 1F). Curiosamente, la tinción de H2B es bastante débil en áreas ricas en neutrófilos(Figura 1D)en comparación con el tejido que contiene NET (Figura 1C). Esto podría deberse al tamaño del anticuerpo (IgY tiene 180 kD en comparación con 150 kD para IgG), lo que puede impedir la unión a la cromatina compacta en núcleos intactos, mientras que el acceso a H2B se facilita si la cromatina se descondensa como es el caso en los NET(Figura 1C).

Para una resolución más alta, los microscopios confocales o los microscopios de campo ancho con desconvolución deben utilizarse para minimizar el desenfoque fuera de foco. La Figura 2 representa un área rica en REDES del mismo espécimen de apendicitis humana. Es una proyección máxima de una pila confocal. NE (verde, Figura 2A)se encuentra en gránulos pero también es abundante extracelularmente, donde coloca con H2B (rojo, Figura 2B)y ADN (azul, Figura 2C). La colocalización extracelular da como resultado una combinación de colores blanquecina(Figura 2D). Estos píxeles positivos para verde, rojo y azul se han utilizado para crear una superposición púrpura que presenta NETs en la Figura 2D'.

La Figura 3 es un detalle de una sección central de un pulmón ratón infectado con Mycobacterium tuberculosis (M. tb). Las condiciones de recuperación y tinción de antígenos son las mismas que para la Figura 1 y la Figura 2. Una vez más, la colocación de los tres componentes de LA NET es claramente visible como áreas blanquecinas entre los neutrófilos, que se ha utilizado para crear una capa púrpura que indica NETs en la Figura 3D'.

La especificidad de la tinción se demuestra en la Figura Suplementaria 1, que representa la tinción insignificante con anticuerpos de control, y la Figura Suplementaria 1A,B representa el suero no inmune del conejo (verde) y el pollo anti-GFP IgY (rojo). Figura 1 C,D muestra la tinción con anticuerpos secundarios solo, la combinación fue la misma que se utilizó en la Figura 1, Figura 2y Figura 3. Figura suplementaria 1A,C muestra una sección de apendicitis humana similar a la Figura 1 y la Figura 2. Figura suplementaria 1B,D es tejido pulmonar de ratón similar a la Figura 3. El ADN está manchado con Hoechst 33342. La barra de escala representa 25 m.

Figure 1
Figura 1: Microscopía de fluorescencia de campo ancho de una sección de parafina de una muestra de apendicitis humana.
Los paneles A, C, E y G representan un área de tejido con NET, mientras que los paneles B, D, F y H muestran un área diferente de la misma sección que es rica en neutrófilos pero sin formación NET. La tinción es contra NE(A,B; verde), H2B(C,D; rojo), y EL ADN(E,F; azul). La Figura 1G, H representa la superposición de los tres canales. Los píxeles con una intensidad entre 80 y 256 en todos los colores representan áreas de tinción superpuesta para NE, H2B y ADN y se consideran derivados de NETs o neutrófilos sometidos a NETosis. Estos píxeles han sido pseudo-coloreados como púrpura en el panel G',donde forman un área grande; y en el panel H',donde sólo se encuentran pequeños puntos. Las imágenes se tomaron con un microscopio de campo ancho utilizando un objetivo de 20x, y la barra de escala representa 25 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Microscopía de fluorescencia confocal de componentes NET en una muestra de apendicitis humana.
Se utilizó la misma sección de tejido utilizada en la Figura 1. (A) Mancha contra NE, (B) Representación de H2B y (C) Tinción Hoechst 33342 de ADN. (D) La superposición de los tres canales. La colocación de las tres señales es de color púrpura pseudocolor en el panel D'. Para ello, se detectaron píxeles con una intensidad >80 en los tres colores utilizando Volocity 6.3. El área púrpura representa NETs o neutrófilos sometidos a NETosis. Las imágenes fueron tomadas con una microscopía confocal como pilas Z y presentadas como máxima proyección. La barra de escala representa 25 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Microscopía de fluorescencia confocal de componentes NET en un pulmón de ratón infectado con M. tb.
Es un detalle de la parte central de una sección de un pulmón completo con infiltración masiva de neutrófilos. (A) Tinción NE, (B) Tinción H2B y (C) tinción de ADN. (D) La superposición de los tres canales. La superposición púrpura en el panel D' indica píxeles con valores de intensidad de >80 en los tres colores que indican neutrófilos sometidos a NETosis, así como NETs. Las imágenes fueron tomadas como una S-stacks con un microscopio confocal y presentadas como máxima proyección. La barra de escala representa 25 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria 1: Control de tinción con anticuerpos primarios no relacionados. El tejido humano (A,C) y el tejido murino (B,D) como se utilizó para la Figura 1 y la Figura 2, y la Figura 3, respectivamente, se teñiron con anticuerpos primarios no relacionados (A,B) o sin anticuerpos primarios (C,D). Como anticuerpos primarios de control en los paneles A y B, se aplicó el suero de un conejo no inmunizado y un IgY de pollo contra gFP. Los anticuerpos secundarios eran los mismos que se muestran en todas las demás tinción y también se utilizaron en los paneles C y D. Como era de esperar, en todas las condiciones, se detectó una tinción de fondo insignificante, ilustrando la especificidad de los anticuerpos utilizados para la Figura 1, la Figura 2y la Figura 3. Las imágenes fueron tomadas con un microscopio confocal, ADN teñido con Hoechst 33342, y la barra de escala representa 25 m. Por favor, haga clic aquí para descargar esta figura.

Discussion

Con la creciente conciencia del papel de las NETs durante la patogénesis9,su detección en el tejido de pacientes o animales experimentales está ganando cada vez más importancia. Las muestras de tejido incrustado en parafina tienen una serie de ventajas en comparación con otras preparaciones de tejido (por ejemplo, secciones de muestras crioconservadas). La preservación de tejidos en muestras incrustadas en parafina es claramente superior, y una vez incrustadas, las muestras se conservan durante décadas, lo que permite estudios retrógrados. Para la detección de NETs, que son estructuras de filigrana, una buena conservación de muestras es una condición previa que descarta el uso de material crioconservado, que es propenso a daños tisulares debido a la formación de cristales de hielo que pueden dar lugar a artefactos morfológicamente parecidos Redes.

Para una preservación óptima, el tejido de los animales experimentales debe fijarse poco después de la muerte, idealmente por perfusión, para evitar la autolisis. Como soluciones fijativas, recién preparadas o recién desawed de paraformaldehído en un tampón adecuado como TBS o PBS mineral óptimo. Esto se define químicamente en contraste con las preparaciones de formalina utilizadas para la histología estándar, e induce menos autofluorescencia tisular. Por el contrario, el tejido humano a menudo no se fija directamente después de la escisión, y como fijador, normalmente se utiliza una dilución del 10% de la formalina que contiene 10% a 15% de metanol como estabilizador para prevenir la polimerización, así como ácido fórmico, otros aldehídos y cetonas . A menudo, el tejido se almacena en este fijador durante largos períodos de tiempo antes de la incrustación. El resultado puede ser la autolisis (dependiendo del tiempo entre la escisión y la fijación), y la formación excesiva de puentes de metileno debido a la sobrefijación. La fijación de formaldehído induce cambios en la estructura terciaria de las proteínas mediante la formación de puentes de metileno intra eintermoleculares 10. Los componentes celulares no proteicos como los ácidos nucleicos, los carbohidratos y los lípidos no se fijan directamente, sino que se inmovilizan en la red de proteínas tridimensionales. Para un etiquetado exitoso, los enlaces de metileno deben romperse para exponer los epítopos en el proceso de recuperación de antígenos. Esto se logra calentando las secciones de tejido montadas en diapositivas de microscopio en un tampón de recuperación de antígenos inducido por calor adecuado (buffer HIER)11. Nuestro estudio anterior analizó la influencia del pH y la temperatura de los tampones HIER en la detección de componentes NET en tejido parafinado, y se encontró que el pretratamiento exitoso de tejidos para un componente a menudo es subóptimo para un segundo componente8.

Mientras tanto, se ha encontrado que calentar el tejido a 70 oC en tampón HIER a un pH de 9 es un buen compromiso para muchos componentes de la RED y conservará una buena preservación del tejido, que a menudo se ve comprometida a temperaturas más altas. Se propone utilizar el tiempo de recuperación indicado como punto de partida, pero especialmente con muestras de archivo de parámetros de fijación desconocidos, la intensidad de tinción puede ser insatisfactoria. En este caso, la prolongación o mayor temperatura durante el procedimiento de recuperación puede mejorar la eficiencia de la tinción. Esto también puede influir en la tinción histona 2B del anticuerpo IgY utilizado en nuestro protocolo. Como se muestra en la Figura 1,la cromatina descondensada se puede encontrar en neutrófilos sometidos a NETosis, así como en las manchas NETs mucho más fuertes con este anticuerpo en comparación con la cromatina en neutrófilos en reposo. Esto es probablemente debido al acceso restringido de la molécula IgY de 180 kDa a núcleos compactos y puede diferir después de una mayor recuperación del epítopo. Esto puede intensificar la eficiencia de unión incluso en áreas de cromatina condensada, lo que resultará en una fluorescencia más fuerte en los núcleos normales de los neutrófilos y otras células. La diferencia en la eficiencia de tinción entre los neutrófilos sometidos a NETosis y los neutrófilos no estimulados podría ser menos pronunciada de lo que se muestra en la Figura 1. Las áreas de formación de NET todavía se identificarían mediante la colocalización de NE, H2B y DNA.

El procedimiento de fijación también puede inducir una autofluorescencia significativa del tejido, principalmente en la parte azulada/verdosa del espectro. Es importante evitar la mayor parte de esta autofluorescencia mediante el uso de conjuntos adecuados de filtros de fluorescencia de paso de banda estrecho (campo ancho) o ajustes de detector (confocal) que coincidan con el máximo de emisión del fluorocromo utilizado con excitación azul, por ejemplo, Cy2, Alexafluor Alexafluor 488. En casos extremos de autofluorescencia, debe evitarse la parte azulada/verdosa del espectro. En su lugar, las señales de fluorescencia se pueden detectar más fácilmente en la parte roja del espectro (por ejemplo, anticuerpos secundarios acoplados a Cy 5 o Alexafluor 635), pero esto requiere cámaras blancas y negras sin filtros o microscopios confocales. Dado que el ojo humano es bastante insensible más allá de 600 nm, las señales de fluorescencia de extremo rojo difícilmente se pueden detectar usando oculares. En cualquier caso, es importante utilizar controles negativos (por ejemplo, controles de suero/isotipo no inmunes en lugar de anticuerpos primarios u omisión de anticuerpos primarios) para determinar los tiempos de exposición adecuados o la configuración del detector.

Las secciones de tejido de 1 x 2 m se pueden analizar con microscopios de campo ancho utilizando objetivos de 10x o 20x. Estas lentes proporcionan una gran profundidad focal, por lo que (casi) toda la sección del tejido estará enfocada. Esto se puede utilizar para escanear rápidamente secciones de tejido en busca de áreas de formación de REDES si son lo suficientemente grandes (como en la Figura 1). La colocación de los canales verde (NE), rojo (H2B) y azul (ADN) da como resultado una tinción blanca que indica áreas de formación NET(Figura 1G). Para aumentos más altos, son necesarios microscopios confocales o de campo ancho con desconvolución. La Figura 2 muestra los detalles del espécimen de apendicitis humana también utilizado para la Figura 1. En la Figura 2A,NE localiza en pequeños puntos (gránulos), pero una gran proporción es extracelular, a menudo formando rayas que se superponen con H2B(Figura 2B)y ADN(Figura 2C). Esta colocación da lugar a una superposición blanquecina que indica NETs (Figura 2D). Un patrón muy similar se puede encontrar en la sección pulmonar de un ratón infectado con M. tuberculosis (Figura 3).

Los especímenes presentados aquí se caracterizan por áreas con un alto grado de formación neta que se pueden identificar incluso con bajo aumento. Dependiendo de la densidad tisular y el estímulo respectivo, la formación de REDES puede ser mucho menos pronunciada, hasta la formación NET de pequeños grupos de neutrófilos (por ejemplo en la miocarditis, véase una publicación anterior12). Se cree que este protocolo ayudará a fomentar más investigaciones sobre las NETs en el tejido y, con suerte, ayudará a desentrañar roles no reconocidos de las NET en la formación o prevención de enfermedades.

Disclosures

La fuente de financiación de este trabajo es la Sociedad Max Planck. Agradecemos a Arturo Zychlinsky por leer críticamente el manuscrito y a Philippe Saikali por el tejido del ratón.

Acknowledgments

Los autores no tienen nada que revelar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
bovine serum albumine Sigma A7906
chicken anti Histone 2B antibody Abcam ab 134211
cold water fish gelatine Sigma-Aldrich G7765
donkey anti chicken antibody, Cy3 conjugated, for multiple labelling Jackson Immuno Research 703-165-155
donkey anti rabbit antibody, Cy2 conjugated, for multiple labelling Jackson Immuno Research 711-225-152 alternatively Cy5 conjugate, 711-175-152
embedding cassettes Roth K116.1
embedding molds Sakura 4162
embedding station Microm AP280
ethanol Roth 9065.4
filter paper, rolled OCB
forceps Dumont 7a
glass cylinder with 20 cm diameter VWR 216-0075
glycerol Roth 3783.1
HIER buffer pH 9 Scytek TES999
Hoechst 33342 Sigma 14533
incubator (dry, up to 40 °C) Memmert MMIPP30
moist chamber (plastic box with tight lid) Emsa 508542
Mowiol 40-88 Aldrich 32.459-0
normal donkey serum Merck S30
PAP-pen ImmEdge Vector Lab H-4000
paraffin microtome Microm 355S water bath included
paraformaldehyde Aldrich 16005
petri dishes Schubert /Weiss 7020051
rabbit anti ELANE antibody Atlas HPA068836
racks, jars for microscope slides Roth H554.1 H552.1
scalpel Braun Fig.22
Superfrost Plus glass slides Thermo Scientific J1800AMNZ
temperature-controlled hot plate NeoLab D6010
tissue processor for paraffin embedding Leica TP1020
Tris buffered saline TBS VWR 788
Triton X100 Roth 3051.4
Tween 20 Fluka 93773
water bath 37 °C GFL 1052
widefield or confocal microscope Leica DMR, SP8
xylene (dimethylbenzene) Roth 9713.3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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