Immunofluorescenssmärkning av humana och murina neutrofila extracellulära fällor i paraffin-inbäddade vävnad

Medicine
 

Summary

Neutrofila extracellulära fällor (NETs) är tredimensionella strukturer som genereras av stimulerade neutrofila granulocyter. De senaste åren har det blivit tydligt att nät är inblandade i en mängd olika sjukdomar. Detektering av nät i vävnad kan ha diagnostisk relevans, så standardiserade protokoll för märkning av netto komponenter krävs.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Abu Abed, U., Brinkmann, V. Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue. J. Vis. Exp. (151), e60115, doi:10.3791/60115 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Neutrofila granulocyter, även kallad polymorfonukleära leukocyter (PMN) på grund av deras lobulated kärna, är den vanligast förekommande typen av leukocyter. De mognar i benmärgen och släpps ut i perifert blod, där de cirkulerar i ca 6 − 8 h; men i vävnad, de kan överleva i dagar. Genom diapedesis genom endotelet, de lämnar blodet, ange vävnader, och migrera mot platsen för en infektion efter kemotaktisk gradienter. Neutrofiler kan bekämpa invaderande mikroorganismer genom fagocytos, degranulering, och generering av neutrofila extracellulära fällor (nät). Detta protokoll kommer att bidra till att upptäcka nät i paraffin-inbäddade vävnad. NETs är resultatet av en process som kallas Netos, vilket leder till frisättning av nukleära, granulat, och cytoplasmiska komponenter antingen från levande (Vital NETosis) eller döende (suicidnetos) neutrofiler. In vitro-nät bildar molnliknande strukturer, som upptar ett utrymme flera gånger större än de celler som de härstammade från. Ryggraden i NETs är kromatin, som ett urval av proteiner och peptider som härrör från granulat och cytoplasma är bundna. Därmed upprätthålls en hög lokal koncentration av giftiga föreningar så att näten kan fånga upp och inaktivera en mängd olika patogener, inklusive bakterier, svampar, virus och parasiter, medan spridningen av de högaktiva netto komponenterna leder till skador i angränsande vävnad är begränsad. Under de senaste åren har det dock blivit uppenbart att näten, om de genereras i överflöd eller inte tillräckligt, har patologiska möjligheter som sträcker sig från autoimmuna sjukdomar till cancer. Sålunda kan detektering av nät i vävnadsprover ha diagnostisk betydelse, och upptäckten av nät i sjuk vävnad kan påverka behandlingen av patienter. Eftersom paraffin-inbäddade vävnadsprover är standardpreparat som används för patologisk analys, försökte man upprätta ett protokoll för fluorescerande färgning av netto komponenter i paraffin-inbäddad vävnad med hjälp av kommersiellt tillgängliga antikroppar.

Introduction

Neutrofila extracellulära fällor (nät) har en komplex tredimensionell struktur. Högupplöst skanning-elektron Mikroskopisk analys visade att de består av släta fibrer med en diameter på 15 − 20 nm (kromatin) överdel med klotformig domäner > 25 nm som förmodligen består av ett sortiment av ca 30 granulat och cytoplasmiska proteiner och peptider1,2. När det genereras in vitro från isolerade neutrofiler, kan nät identifieras genom färgning av två eller flera av deras komponenter genom immunofluorescens (t. ex. histoner och neutrofila elastase [Ne]). I ostimulerade polymorfonukleära leukocyter (PMN), histoner ligger uteslutande i kärnan, medan Ne finns i granulat. Under netosis, kommer Ne in i kärnan, där den bearbetar histoner3,4. NETs kännetecknas av samlokalisering av komponenter, som är tydligt åtskilda i ostimulerade neutrofiler. Eftersom det för närvarande inte finns några antikroppar som enbart detekterar NETTOSPECIFIKA epitoper (dvs. inte reagerar med naiva neutrofiler), är det enda sättet att identifiera nät att detektera

I vävnad kan nät knappast upptäckas genom konventionella histologiska fläckar (t. ex. genom färgning med hematoxylin/Eosin [H & E], som skildrar nät som en diffus blek blåaktig nyans). Endast när mycket riklig, nät kan tydligt särskiljas med H & E färgning, såsom i Trombi5. Eftersom näten är diffusa måste vävnadsstrukturen bevaras optimalt, så Cryo-preparat som är benägna att inducera frys artefakter är suboptimala för analys av nät i vävnad. Istället har formaldehydfixering och paraffin inbäddning visats bevara nätstrukturen i vävnad väl2. (Immuno-) histologisk inspektion av delar av paraffin-inbäddad vävnad är standardmetoden för patologisk analys. Eftersom vävnad i paraffinblock bevaras även vid rumstemperatur (RT), kan vävnadsprover från dagligt diagnostiskt arbete jämföras med prover som har förberetts för åratal sedan, med frågor och tekniker som nyligen har uppstått. Nät i vävnad har inte upptäckts förrän nyligen, och detaljerad analys av netto bildning och avlägsnande under sjukdomsförloppet kan leda till nya insikter i patogenes. Användningen av paraffin-inbäddade vävnad har den ovärderliga fördelen att möjliggöra analys av arkivmaterial och genomföra retrospektiva studier6. Onekligen, dessa fördelar kommer till en kostnad. Innan inbakning i paraffin, vävnad måste formaldehyd-fast, dehydratiserad och upphettas över 50 ° c. Dessa förfaranden framkalla vävnad autofluorescence samt epitop maskering.

För att begränsa fixeringsartefakter, bör fixeringstid hållas till ett minimum, så storleken på vävnadsproverna bör inte överstiga en yta på 20 mm x 30 mm med ~ 3 mm tjocklek. Prover av denna storlek är helt fixerade efter övernattning inkubering vid RT i formaldehyd, helst följt av direkt uttorkning och paraffin inbäddning. Alternativt kan fasta prover lagras i 1 eller 2 dagar i bufferten. För immunofluorescenstest bör fixativ beredas nypreparerad från PARAFORMALDEHYD upplöst i en lämplig buffert (t. ex. fosfatbuffrad saltlösning [PBS] eller Tris-buffrad saltlösning [TBS]). Under fixativ beredning skall temperaturen hållas under 60 ° c för att förhindra bildandet av myrsyra. Formalin, som är en standard fixativ för patologi, bör inte användas eftersom det innehåller metanol, andra aldehyder, ketoner, och myrsyra. Dessa föroreningar leder till ökad epitop maskering och betydande vävnad autofluorescence.

För lyckad immunolabelling, epitop maskering måste återställas i en process som kallas antigen hämtning. Vävnad sektioner värms upp i en lämplig buffert, som tros bryta metylenblått broar, så epitoper bli tillgängliga för antikropparna7. För detektion av nät, värmeinducerad epitop hämtning (HIER) är att föredra framför andra metoder såsom användning av proteolytiska enzymer. Rutinmässigt, immunolabelling av paraffin sektioner utförs med en enda antikropp följt av en peroxidasmärkt sekundär antikropp, som upptäcks med ett utfällning substrat. Jämfört med immunofluorescens, enzymbaserade detektionsmetoder har en lägre rumslig upplösning på grund av diffusion av substratet fällningen, och i allmänhet, samtidig detektion av mer än en antigen är begränsad6.

Som för närvarande finns inga antikroppar som uteslutande binder till nät, detta protokoll används för att märka två proteiner, Histon 2b, som är kärnkraft, och neutrofila elastase, som är lokaliserad i granulat. I ostimulerade neutrofiler separeras dessa proteiner, men de är samlokaliserade i neutrofiler som genomgår Netos och i nät. Samtidig detektion av två antigener kan uppnås med två primära antikroppar som är uppburna i olika värdar och två artspecifika sekundära antikroppar märkta med olika fluorochromes. Denna rapport är en standardisering av vår tidigare publicerade protokoll8 och använder en kombination av två kommersiellt tillgängliga antikroppar som tillförlitligt fläcken netto komponenter i paraffin-inbäddade vävnad, både färskt och arkivering, av mänskligt och murina ursprung.

Protocol

Vävnads protokollen godkändes av Landesamt für gesundheit und Soziales, Berlin, Tyskland (G0121/16). Experiment genomfördes i enlighet med det europeiska direktivet 2010/63/EU om vård, välfärd och behandling av djur.

1. fixering, uttorkning, paraffin inbäddning, snittning, montering av sektioner

  1. Bered 2% formaldehydlösning genom att lösa PARAFORMALDEHYD i TBS (pH 7,4). Undvik upphettning över 60 ° c. Svalna till RT. formaldehydlösning kan förvaras vid-20 ° c.
  2. Placera färsk vävnad (här: muslunga) i ett glas petriskål med TBS. Med en skalpell, dissekera i bitar som inte överstiger 20 mm x 30 mm x 3 mm i storlek. Doppa preparatet i 2% formaldehydlösning i TBS.
    Anmärkning: volymen av fixativ bör vara minst 20x den av vävnaden.
  3. Fix på RT för 8 − 20 h. överför exemplar till TBS. Placera i kassetter.
  4. Torka med en serie etanol (70%, 80%, 90%, 96%, 100%, 100%), med varje steg som varar 1 h.
  5. Klara exemplar 2x i 100% xylen (dimetylbensen), varje steg 1 h.
  6. Blötlägg i paraffin 2x vid 60 ° c (smälttemperatur 54 − 56 ° c), varje steg 1 h.
  7. Montera prover med inbäddning formar, använda kassetten botten som ett omslag.
  8. Låt paraffin stelna och ta bort inbäddning formar.
  9. Förbered 3 μm vävnad sektioner, och låt dem flyta på 37 ° c vattenbad.
  10. Float sektioner på vattenytan på självhäftande glas diabilder (tabell över material).
  11. Inkubera sektioner på glas rutschbanor över natten vid 40 ° c för att binda vävnaden till glaset.

2. rehydrering, värmeinducerad epitophämtning, färgning, montering, Mikroskopisk analys

  1. Placera sektioner på glas rutschbanor i rack och dränera dem i media som används för uttorkning och clearing, i omvänd ordning, med varje steg för 5 min: 2x 100% xylen, etanol serien (2x 100%, 96%, 90%, 80%, 70%).
  2. Värm ett vattenbad med en temperaturkontrollerad värmeplatta till 70 ° c. Placera en burk fylld med värmeinducerad epitop hämtning (HIER)-buffert (pH 9; Material), innehållande 10% glycerol som temperaturbuffert, i ett vattenbad. När HIER buffert har nått 70 ° c, placera rack med bilder i buffertburk.
  3. Inkubera diabilder för 120 min vid 70 ° c.
  4. Ta bort burken från vattenbadet och låt den svalna till RT. Skölj avsnitten 3x med avjoniserat vatten och en gång med TBS (pH 7,4).
  5. Ta försiktigt bort vätskan från glidskenorna mellan sektionerna med rullat filterpapper eller bomullspinne och lämna sektioner hydrerade.
  6. Skapa barriär runt sektioner med en hydrofoba barriär penna.
  7. Inkubera sektioner i blockeringsbuffert (1% bovint serumalbumin [BSA], 2% normal åsna serum, 5% kallt vatten fisk gelatin och rengöringsmedel [tabell över material] i TBS) vid RT i 30 min för att förhindra ospecifik bindning.
  8. Späd primära antikroppar med en koncentration på 1 μg/mL i blockerande buffert.
    Anmärkning: för mänskliga och mus nät, en kombination av kanin antikropp mot neutrofila elastase och kyckling antikropp mot Histone 2B kan användas (tabell över material).
  9. Placera bilder i en fuktig kammare. Ta bort blockeringsbuffert och tillsätt de utspädda primära antikropparna utan tvättning till sektionerna med tillräcklig volym för att förhindra torkning. Försegla fuktig kammare med paraffin film och inkubera över natten vid RT.
  10. Tvätta avsnitten 3x med TBS i 5 min vardera.
  11. Förbered arbetslösning av sekundära antikroppar i blockeringsbuffert. För detektion av primära antikroppar, Använd sekundära antikroppar som tas upp i åsnan och pre-absorberas mot serumproteiner från flera arter (tabell över material). Täck vävnads sektioner med fungerande lösning av sekundära antikroppar. Överför bilder till fuktig kammare, tätning med paraffin film. Inkubera i 1 h vid RT.
    Obs: åsna anti kanin konjugerat till Cy2 och åsna anti kyckling konjugerat till Cy3 kan kombineras med en DNA-motfärgning.
  12. Tvätta sektioner 3x för 5 min vardera med TBS, sedan en gång för 5 min med avjoniserat vatten.
  13. Täck sektioner med monteringsmedel (tabell över material) och tillämpa täckglas undvika bubbla formation.
  14. Låt monterings mediet stelna, analysera sedan immunofluorescensen med ett brett fält Mikroskop med lämpliga bandpassfilter eller ett konfokala Mikroskop.

Representative Results

Med hjälp av detta protokoll kan NET-komponenter med framgång detekteras i paraffin-inbäddade vävnad både av mänskligt och murina ursprung. I ostimulerade neutrofiler, H2B ligger uteslutande i kärnan och neutrofila elastase i granulat; Följaktligen överlappar inte deras fluorescens-signaler. Däremot, under Netos och efter netto bildning, NE, H2B, och DNA delvis colocalize. Om de avbildas som gröna, röda och blåa signaler avbildas områden med samlokalisering som vitaktig överlagring (figur 1G, figur 2Doch figur 3D). Denna overlay kan också kvantifieras med hjälp av bildanalysprogram. Pixlar från överlappande signaler som är positiva för grönt, rött och blått har använts för att skapa en lila överlagring som skildrar netto områden i figur 1G", figur 2D"och figur 3D". Några av cellerna i figur 1 och figur 2 har lobulated kärnor men är negativa för Ne. Man tror att dessa celler är eosinofila granulocyter.

Om vävnads sektionerna har en tjocklek av 2 – 3 μm, kan de analyseras med hjälp av bred fälts mikroskopi med 10X eller 20x mål. Ett exempel presenteras i figur 1, som skildrar en del av mänskliga blindtarmsinflammation vävnad färgade för Ne (grön), H2B (röd) och Hoechst 33342 (blå). Panelerna A, C, E och G är från ett område i avsnittet som innehåller nät, medan panelerna B, D, F och H är från ett annat område i samma sektion, som innehåller många neutrofiler (figur 1b, Ne) men inga nät. Områden med massiv netto bildning kan lätt hittas även vid låga förstoringar, eftersom alla tre netto komponenter colocalize, ofta i trådiga extracellulära strukturer, som i överlagringen av de tre kanalerna visas som vitaktig extracellulära fibrer (figur 1G ), lila överlägg i figur 1G.

Infärgnings mönstren för båda vävnads områdena är helt klart olika, med NE som finns i granulat (figur 1b) och DNA i kärnor (figur 1f). Intressant, färgning för H2B är ganska svag i neutrofila rika områden (figur 1d) jämfört med netto-innehållande vävnad (figur 1c). Detta kan bero på storleken av antikroppen (IgY har 180 kD jämfört med 150 kD för IgG), vilket kan förhindra bindning till kompakta kromatin i intakt kärnor, medan tillgång till H2B underlättas om kromatin är dekondenserad som är fallet i nät (figur 1c).

För högre upplösning, konfokala Mikroskop eller widefield Mikroskop med deconvolution måste användas för att minimera out-of-fokus oskärpa. Figur 2 visar ett nät-rika område från samma mänskliga blindtarmsinflammation provexemplaret. Det är en maximal projektion av en konfokal stack. NE (grön, figur 2A) finns i granulat men är också rikligt extracellularly, där det colocalizes med H2B (röd, figur 2b) och DNA (blå, figur 2C). Den extracellulära colocalization resulterar i en vitaktig färgkombination (figur 2D). Dessa pixlar positiva för grönt, rött och blått har använts för att skapa en lila overlay presentera nät i figur 2D.

Figur 3 är en detalj av en central sektion från en mus lunginfektion med Mycobacterium tuberculosis (M. TB). Antigen hämtning och infärgnings förhållanden är desamma som för figur 1 och figur 2. Återigen är colocalization av alla tre netto komponenter tydligt synlig som vitaktiga områden mellan neutrofiler, som har använts för att skapa en lila skikt som indikerar nät i figur 3D.

Infärgnings noggrannheten påvisas i tilläggs figur 1, som skildrar försumbar färgning med kontroll antikroppar, och tilläggs figur 1a, B visar kanin icke-immun serum (grön) och kyckling anti-GFP IGY (röd). Figur 1 C, D visar färgning med sekundära antikroppar ensamt, kombinationen var densamma som användes i figur 1, figur 2, och figur 3. Kompletterande figur 1a, C visar en sektion av humant blindtarmsinflammation liknande figur 1 och figur 2. Kompletterande figur 1b, D är mus lungvävnad som liknar figur 3. DNA färgas med Hoechst 33342. Skalstapeln representerar 25 μm.

Figure 1
Figur 1: Bredfältfluorescensmikroskopi av en paraffin sektion av ett humant blindtarms prov.
Panelerna A, C, E och G skildrar ett vävnads område med nät, medan panelerna B, D, F och H visar ett annat område av samma avsnitt som är rikt på neutrofiler men utan netto bildning. Färgning är mot NE (a, B; grön), H2B (C, D; röd), och DNA (E, F; blå). Figur 1G, H representerar överlagringen av alla tre kanalerna. Pixlar med en intensitet mellan 80 och 256 i alla färger representerar områden med överlappande färgning för NE, H2B och DNA och anses vara härledda från nät eller neutrofiler som genomgår Netos. Dessa pixlar har pseudo-färgade som lila i panel G, där de utgör ett stort område; och i panel H, där endast små fläckar hittas. Bilder togs med ett brett fält Mikroskop med en 20x mål, och Scale bar representerar 25 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Konfokalfluorescens-mikroskopi av NET-komponenter i ett humant blindtarms prov.
Samma vävnads sektion som användes i figur 1 användes. A) FÄRGNING mot Ne, (B) avbildning av H2B, och (C) HOECHST 33342 färgning av DNA. (D) överlagringen av alla tre kanalerna. Colocalization av alla tre signalerna är pseudo-färgade lila i panel D '. För detta upptäcktes pixlar med en intensitet > 80 i alla tre färgerna med hjälp av Volostad 6,3. Det lila området avbildar nät eller neutrofiler som genomgår Netos. Bilderna togs med en konfokal mikroskopi som Z-stackar och presenteras som maximal projektion. Skalstapeln representerar 25 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Konfokalfluorescens-mikroskopi av NET-komponenter i en muslung infekterad med M. TB.
Det är en detalj från den centrala delen av en del av en komplett lunga med massiv neutrofila infiltration. A) Ne färgning, (B) H2B färgning och (C) DNA-färgning. (D) överlagringen av alla tre kanalerna. Den lila överlägget i panel D ' indikerar pixlar med intensitetsvärden på > 80 i alla tre färgerna som indikerar neutrofiler som genomgår Netos samt nät. Bilderna togs som en Z-stackar med ett konfokala Mikroskop och presenteras som maximal projektion. Skalstapeln representerar 25 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande figur 1: färgning kontroll med icke-närstående primära antikroppar. Human (a, C) och murinvävnad (B, d) som användes för figur 1 och figur 2, respektive figur 3, färgas med icke-närstående primära antikroppar (a, B) eller utan primär antikroppar (C, d). Som kontroll primära antikroppar i paneler A och B, serum från en icke-immuniserad kanin och en kyckling IgY mot GFP tillämpades. Sekundära antikroppar var desamma som visas i all annan färgning och används även i panelerna C och D. Som förväntat upptäcktes under alla förhållanden försumbar bakgrunds färgning, vilket illustrerar specificiteten hos de antikroppar som används för figur 1, figur 2och figur 3. Bilderna togs med ett konfokala Mikroskop, DNA färgade med Hoechst 33342, och Scale bar representerar 25 μm. vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.

Discussion

Med ökad medvetenhet om NETs roll under patogenesen9ökar deras upptäckt i vävnad från patienter eller försöksdjur allt större betydelse. Paraffin-inbäddade vävnadsprover har ett antal fördelar jämfört med andra vävnadspreparat (t. ex. delar av kryopreserverade prover). Vävnaden bevaras i paraffin-inbäddade prover är klart överlägsen, och när inbäddade, proverna bevaras i årtionden, möjliggör retrograd studier. För detektering av nät, som är filigran strukturer, är bra prov bevarande en förutsättning att utesluta användningen av kryopreserverat material, som är benägna att vävnadsskada på grund av is Crystal formation som kan ge upphov till artefakter morfologiskt liknar Nät.

För optimal bevarande bör vävnad från försöksdjur fastställas kort efter döden, helst genom perfusion, för att undvika autolys. Som fixativ, nyberedda eller nyligen upptinade lösningar av PARAFORMALDEHYD i en lämplig buffert som TBS eller PBS malm optimal. Detta är kemiskt definierade i motsats till formalin preparat som används för standard histologi, och inducerar mindre vävnad autofluorescence. Däremot är mänsklig vävnad ofta inte fast direkt efter excision, och som fixativ, normalt en 10% utspädning av formalin utnyttjas som innehåller 10% till 15% av metanol som en stabilisator för att förhindra polymerisation, liksom myrsyra, andra aldehyder, och ketoner . Ofta lagras vävnaden i denna fixativ för längre tid före inbäddning. Resultatet kan vara autolys (beroende på tiden mellan excision och fixering), och överdriven bildandet av metylenblått broar på grund av överfixering. Formaldehydfixering inducerar förändringar i den tertiära strukturen av proteiner genom bildandet av intra-och Inter-molekylär metylenblått broar10. Icke-proteinhaltiga cellkomponenter som nukleinsyror, kolhydrater och lipider fixeras inte direkt, utan immobiliseras i det tredimensionella protein nätverket. För en lyckad märkning måste metylenobligationer brytas för att avslöja epitoper i processen för antigen hämtning. Detta åstadkoms genom upphettning av vävnads sektioner monterade på Mikroskop glas i en lämplig värmeinducerad antigen hämtningsbuffert (HIER buffert)11. Vår tidigare studie analyserade påverkan av pH och temperatur av HIER buffertar på detektion av netto komponenter i paraffinized vävnad, och det konstaterades att framgångsrik vävnad förbehandling för en komponent ofta är suboptimala för en andra komponent8.

Under tiden har det visat sig att upphettning av vävnaden till 70 ° c i HIER buffert vid ett pH på 9 är en bra kompromiss för många netto komponenter och kommer att behålla god vävnad bevarande, som ofta äventyras vid högre temperaturer. Det föreslås att den hämtningstid som anges som utgångspunkt ska användas, men särskilt med arkivexemplar av okända fixeringsparametrar kan färgintensiteten vara otillfredsställande. I detta fall kan förlängning av eller högre temperatur under hämtnings proceduren förbättra Färgnings effektiviteten. Detta kan också påverka Histon 2b-färgning av den IGY-antikropp som används i vårt protokoll. Som visas i figur 1, dekondenserad kromatin finns i neutrofiler som genomgår Netos samt i nät fläckar mycket starkare med denna antikropp jämfört med kromatin i vilande neutrofiler. Detta beror förmodligen på begränsad tillgång till 180 kDa IgY molekylen till kompakta kärnor och kan variera efter ökad epitop återhämtning. Detta kan intensifiera bindande effektivitet även i områden med kondenserad kromatin, vilket kommer att resultera i starkare fluorescens i normala kärnor av neutrofiler och andra celler. Skillnaden i infärgnings effektivitet mellan neutrofiler som genomgår Netos och icke-stimulerade neutrofiler kan vara mindre uttalad än den som avbildas i figur 1. Områden med netto bildning skulle fortfarande identifieras genom en samtidig lokalisering av NE, H2B och DNA.

Fixeringsproceduren kan också inducera betydande autofluorescence av vävnaden, främst i den blåaktiga/grönaktiga delen av spektrumet. Det är viktigt att undvika det mesta av denna autofluorescence genom att använda adekvata smala bandpass fluorescensfilter set (Wide-fält) eller detektor inställningar (konfokal) som matchar utsläpp maximalt av fluorkrom används med blå excitation, e.g., Cy2, AlexaFluor 488 i extrema fall av autofluorescence bör den blåaktiga/grönaktiga delen av spektrumet undvikas. I stället kan fluorescens-signaler upptäckas lättare i den avlägsna röda delen av spektrumet (t. ex. sekundära antikroppar kopplade till CY 5 eller AlexaFluor 635), men detta kräver filterless svartvita kameror eller konfokala Mikroskop. Eftersom det mänskliga ögat är ganska okänsligt bortom 600 Nm, mycket röda fluorescens signaler kan knappast upptäckas med hjälp av oculars. I vilket fall som helst är det viktigt att använda negativa kontroller (t. ex. icke-Immunsera/isotype-kontroller i stället för primära antikroppar eller utelämna primära antikroppar) för att fastställa lämpliga exponeringstider eller detekterings inställningar.

Vävnadsdelar på 1 − 2 μm kan analyseras med brett fält Mikroskop med hjälp av 10X eller 20x mål. Dessa linser ger ett stort fokaldjup, så (nästan) hela vävnaden avsnitt kommer att vara i fokus. Detta kan användas för att snabbt Skanna vävnad sektioner för områden av netto bildning om de är tillräckligt stora (som i figur 1). De gröna (NE), röda (H2B) och blåa (DNA) kanalernas samlokalisering ger en vit färgning som anger områden med netto bildning (figur 1G). För högre förstoringar, konfokala eller wide-fält Mikroskop med deconvolution är nödvändiga. Figur 2 visar detaljer om humant blindtarmsinflammation preparat som också används för figur 1. I figur 2Alokaliserar Ne till små prickar (granulat), men en stor del är extracellulära, ofta bildar ränder som ÖVERLAPPAR med H2B (figur 2b) och DNA (figur 2C). Denna colocalization resulterar i en vitaktig overlay som indikerar nät (figur 2D). Ett mycket liknande mönster finns i lung delen av en mus infekterad med M. tuberkulos (figur 3).

Exemplaren presenteras här kännetecknas av områden med en hög grad av netto bildning som kan identifieras även vid låg förstoring. Beroende på vävnad densitet och respektive stimulans, kan netto bildningen vara mycket mindre uttalad, ner till netto bildningen av små grupper av neutrofiler (för ett exempel i Myocarditis, se en tidigare publikation12). Man tror att detta protokoll kommer att bidra till att främja mer forskning om nät i vävnad och förhoppningsvis stöd för att reda ut okända roller av nät i bildandet eller förebyggande av sjukdomar.

Disclosures

Finansieringskällan för detta arbete är Max Planck-sällskapet. Vi tackar Arturo Zychlinsky för kritiskt läsande manuskriptet och Philippe Saikali för mus vävnaden.

Acknowledgments

Författarna har inget att avslöja.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
bovine serum albumine Sigma A7906
chicken anti Histone 2B antibody Abcam ab 134211
cold water fish gelatine Sigma-Aldrich G7765
donkey anti chicken antibody, Cy3 conjugated, for multiple labelling Jackson Immuno Research 703-165-155
donkey anti rabbit antibody, Cy2 conjugated, for multiple labelling Jackson Immuno Research 711-225-152 alternatively Cy5 conjugate, 711-175-152
embedding cassettes Roth K116.1
embedding molds Sakura 4162
embedding station Microm AP280
ethanol Roth 9065.4
filter paper, rolled OCB
forceps Dumont 7a
glass cylinder with 20 cm diameter VWR 216-0075
glycerol Roth 3783.1
HIER buffer pH 9 Scytek TES999
Hoechst 33342 Sigma 14533
incubator (dry, up to 40 °C) Memmert MMIPP30
moist chamber (plastic box with tight lid) Emsa 508542
Mowiol 40-88 Aldrich 32.459-0
normal donkey serum Merck S30
PAP-pen ImmEdge Vector Lab H-4000
paraffin microtome Microm 355S water bath included
paraformaldehyde Aldrich 16005
petri dishes Schubert /Weiss 7020051
rabbit anti ELANE antibody Atlas HPA068836
racks, jars for microscope slides Roth H554.1 H552.1
scalpel Braun Fig.22
Superfrost Plus glass slides Thermo Scientific J1800AMNZ
temperature-controlled hot plate NeoLab D6010
tissue processor for paraffin embedding Leica TP1020
Tris buffered saline TBS VWR 788
Triton X100 Roth 3051.4
Tween 20 Fluka 93773
water bath 37 °C GFL 1052
widefield or confocal microscope Leica DMR, SP8
xylene (dimethylbenzene) Roth 9713.3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, (5663), 1532-1535 (2004).
  2. Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLOS Pathogens. 5, (10), e1000639 (2009).
  3. Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 176, (2), 231-241 (2007).
  4. Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 191, (3), 677-691 (2010).
  5. de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H&E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69, (2), 181-182 (2016).
  6. Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BioMed Central Cell Biology. 9, 13 (2008).
  7. Rait, V. K., Xu, L., O'Leary, T. J., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment. Laboratory Investigation. 84, (3), 300-306 (2004).
  8. Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).
  9. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18, (2), 134-147 (2018).
  10. Cattoretti, G., et al. Antigen unmasking on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. Journal of Pathology. 171, (2), 83-98 (1993).
  11. Yamashita, S., Okada, Y. Mechanisms of heat-induced antigen retrieval: analyses in vitro employing SDS-PAGE and immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53, (1), 13-21 (2005).
  12. Weckbach, L. T., et al. Midkine drives cardiac inflammation by promoting neutrophil trafficking and NETosis in myocarditis. Journal of Experimental Medicine. 216, (2), 350-368 (2019).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics