초파리 멜라노가스터에서 학습 유발 시냅스 가소성의 생체 내 광학 칼슘 이미징

Neuroscience

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Summary

여기에서 우리는 Drosophila 학습 및 기억의 맥락에서 pre-및/또는 후성 칼슘이 구상될 수 있는 프로토콜을 제시합니다. 합성 국소화 된 칼슘 센서를 사용하여 생체 내 칼슘 이미징은 이러한 유형의 연관 학습의 기초가되는 시냅스 가소성이 결정될 수 있도록 고전적인 후각 조절 패러다임과 결합됩니다.

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Hancock, C. E., Bilz, F., Fiala, A. In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (152), e60288, doi:10.3791/60288 (2019).

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Abstract

많은 모형 유기체에 있는 연구의 십년간은 시냅스가 소성의 현재 개념 기초적인 학습 및 기억 형성으로 이끌어 냈습니다. 시 냅 스 전송에 학습 유발 된 변화는 종종 많은 뉴런및 뇌의 처리 수준에 걸쳐 배포. 따라서, 뉴런에 걸쳐 학습 의존 시 냅 스가 소성을 시각화 하는 방법이 필요 하다. 열매 파리 드로소필라 멜라노가스터는 학습의 기초가 되는 뉴런 회로를 연구하는 데 특히 유리한 모델 유기체를 나타낸다. 여기에 제시된 프로토콜은 연관 후각 기억, 즉 시냅스 활성 및 그 변화의 형성의 기초가되는 프로세스가 생체 내에서 모니터링 될 수있는 방법을 보여줍니다. Drosophila에서유효한 유전 공구의 광범위한 배열을 사용하여, 결정된 세포 인구 및 단 하나 세포에 있는 유전으로 부호 매겨진 칼슘 표시기를 구체적으로 표현하는 것이 가능합니다. 제자리에 비행을 고정하고 헤드 캡슐을 열어, 후각 자극을 전달하는 동안 이러한 세포에서 칼슘 역학을 시각화 할 수있다. 또한, 우리는 비행이 신체에 감전을 동시에 실시 할 수있는 설정을 보여줍니다. 이것은 파리가 고전적인 후각 컨디셔닝을 겪을 수있는 시스템을 제공합니다 - 이전에 순진한 냄새가 감전 처벌과 관련이 있는 것으로 배운다 - 동시에이 냄새 (및 기타 훈련되지 않은 냄새)의 표현과 함께 두 광자 현미경 검사를 통해 뇌에서 관찰. 우리 실험실은 이전에 형광 칼슘 신호를 사전 또는 후시 내피 구획에 제한 할 수있는 합성 국소 칼슘 센서의 생성을보고했습니다. 2 광자 현미경 검사법은 공간적으로 미세 한 구조를 해결하는 방법을 제공합니다. 우리는 버섯 몸에서 정보를 통합 하는 뉴런에 초점을 맞추고이 예시, 곤충 두뇌의 높은 순서 센터. 전반적으로, 이 프로토콜은 후각 학습의 결과로 활동이 조절되는 뉴런 간의 시냅스 연결을 검사하는 방법을 제공한다.

Introduction

학습을 통해 뇌에서 정보를 획득하고 메모리로 저장하는 위치와 방법을 해독하는 것은 신경과학1에서 가장 어려운 작업 중 하나입니다. 신경과학 연구는 학습과 기억 형성의 기초가 되는 신경 기질로서 시냅스 전송의 변화의 개념을 주도하고 있다2,3. 그것은 가설, 학습 하는 동안, 자극의 인식 동안 활성화 되는 신경 앙상블 간의 시 냅 스 연결 메모리 회수 하는 동안 그들의 결합 된 활동 패턴을 검색할 수 있도록 수정 될, 따라서 지시 향후 행동 행동4. 이러한 "engram 세포" 그리고 그들의 시 냅 스는 종종 뇌 영역 및 처리의 수준에 걸쳐 배포, 작업 또는 자극의 학습에 시 냅 스 전송에 관찰 된 변화를 할당 하기 어려운. 특정 학습 작업에 인가적으로 연결된 시냅스 변화를 지역화하고 시각화하려면 시냅스를 정확하게 제한하는 적절한 모델 시스템이 필요합니다.

이러한 노력을 위해, Drosophila 멜라노가스터는 상대적인 두뇌 단순성, 행동 풍요로움 및 실험적 접근성을 결합하기 때문에 특히 적합합니다. 잘 확립 된 모델 유기체 중, Drosophila는 선충 C. 예쁜 꼬마와 신경 복잡성의 관점에서 마우스와 같은 유전적으로 견인 포유 동물 사이에 위치하고 있습니다. 뉴런 (~300)과 제한된 행동 레퍼토리의 입체 수는 C. elegans에서 관찰됩니다. 포유류는, 다른 한편으로는, 뉴런의 수백만있고 엄청난 행동 복잡성이 있습니다. 과일 파리의 뇌는 ~ 100,000, 대부분의 척추 동물의 뇌보다 훨씬 작은 뉴런, 그리고 뉴런의 대부분은 개별적으로 식별 할 수있습니다 5. 그러나, Drosophila는 40 년 전에 처음 기술된 강력한 연관 후각 학습 및 기억 형성을 전시하는 기능을 포함하여 복잡한 행동의 넓은 스펙트럼을 보여줍니다6. 이 고전적인 컨디셔닝 절차의 과정에서, 파리의 그룹은 조건부 자극 (CS+)으로냄새를 받게되고 무조건 자극 (미국)으로 처벌 전기 충격을받습니다. 두 번째 냄새 (CS- )는 어떤 처벌없이 제시된다. 이에 의해, 동물들은 처벌과 관련된 악취를 피하는 법을 배워, 이는 두 냄새,CS+및 CS-사이의후속 선택 상황에서 시험될 수 있다. Drosophila에서 이 행동의 밑에 있는 신경 기질해저에 대한 연구는 버섯 바디 (MB)를 "engram"7,8,9,10의 1차 부위로 확인했습니다 따라서, 이 뇌 영역의 회로는 메모리 엔그램이 획득되고 저장되는 논리를 밝히기 위해 강렬한 연구의 대상이되고 있다 (최근11,12에서검토).

Drosophila MB는 반구당 ~2,000개의 본질적인 뉴런(Kenyon cells)으로 구성되어 있으며, 축삭돌출부 13으로구성된다. 후각 프로젝션 뉴런의 축삭은 MB의 주요 수지상 입력 부위인 MB 칼릭스및 안테나 로브로부터 후각 입력을 수신하는 측면 프로토세레브라 및 MB 칼리세스로 확장된다. 케년 세포의 길고 평행한 축삭 번들은 페던클과 로브를 구성한다. 대부분의 케년 세포는 수평 β/β'-로브를 형성하여 뇌의 중간선쪽으로 하나의 부수적인 것을 확장하고, 등쪽 전방 방향으로 두 번째 부수적 인 투영을 연장시킴으로써 수직 α/α'-로브를 형성합니다. 케년 세포의 다른 그룹은 학습 과정 및 후속 단기 기억 형성이 국소화 될 수있는 MB의 수평 γ-로브(13)를 형성한다 10. MB 로브는 구심성 입력을 수신하고 원심성 출력을 제공하며, 둘 다 일반적으로 케니언 셀 축삭14,15,16을따라 뚜렷한 구획 하위 영역으로 제한된다. 특히, 구심성 도파민성 MB 입력 뉴런은 부가가치 기반, 예를 들어, 연관후각 학습에서 징벌적, 강화 효과를 중재하는 것으로 나타났다15,17. 버섯 체외로부터 의기질적이고 개별적으로 식별 가능한 원추형 MB 출력 뉴런은 많은 수의 케니언 세포에 걸쳐 정보를 통합하고, 다양한 뇌 영역을 표적으로 하며, 행동-유익한 식욕 또는 비열한 정보를 지니고있습니다 15 . 이러한 뉴런 아키텍처는 연관 엔그램의 조직에 대한 개념으로 이어졌다. 냄새는 상대적으로 정확하게 케니언 세포의 드물게 활성화 앙상블에 의해 인코딩된다. 이러한 케니언 세포 앙상블의 일치 활성 및 도파민의 방출 - 자극을 처벌하여 불러일으킨 - 케년 세포 프리시냅스에서 MB 출력 뉴런으로의 전염을 조절하여 동물이 이후에 이 특정 한 냄새를 피할 수 있도록10 ,12. 우리는 시냅스 활동에 있는 이 학습 의존적인 변경이 어떻게 결정되고 감시될 수 있는지 설명하기 위하여 패러다임 사례로 오히려 정확하게 정의되고 현지화된 engram를 이용합니다.

모델 시스템으로 Drosophila의 가치는 복잡한 회로18내의 단일 뉴런을 식별, 모니터링 및 제어하기 위한 트랜스유전자를 표현할 수 있는 타의 추종을 불허하는 유전 적 도구 상자에 강하게 의존합니다. 여기에서 논의된 칼슘 이미징과 같은 신경 활동 모니터링을 위한 기술의 출현은 특정 자극에 반응하여 신경 활동 패턴의 측정을 허용했습니다. 유전자 인코딩된 칼슘 지표(GECIs)의 특정 Gal4 구동 식과 후각 자극을 결합함으로써, 관심 있는 뉴런의 악취유발 칼슘 역학을 시각화할 수 있다19. 이 프로토콜에서는 이 기술을 고전적인 컨디셔닝 패러다임과 추가로 결합함으로써 학습의 맥락에서 이러한 후각 반응을 검사할 수 있음을 보여준다. 학습 유도 가소성은 단일 특정 뉴런뿐만 아니라 뉴런의 특정 하위 구획에 국한되는 GECI를 사용하여 추가로 해부 될 수 있습니다. Pech 등20 정확히 이것을 허용하는 도구의 선택을 설립했다. GCaMP321을 척추동물 시냅토피신 또는 d호머에 대한 연계를 통해 사전 또는 후시냅스를 대상으로 함으로써, 각각20-이들부위의 차등 변조를 구별할 수 있다. 이러한 국소화는 시토솔 전체에 걸쳐 유비쿼터스적으로 존재하는 대부분의 GEC에 비해 이점이 있습니다 -예를 들어, GCaMP22,GCaMP321,또는 GCaMP623 - 사전 및 사후 내시 과도가 될 수 있음을 의미하기 때문에 신경 활성화의 결과로 발생하는 전반적인 통합 칼슘 유입과 구별됩니다. 이 결과 발생 하거나 학습 및 메모리 형성을 일으키는 원인이 되는 가소성의 위치와 종류에 대 한 단서를 제공할 수 있습니다. 일례로, 여기에 제공된 프로토콜은 후각 연관 학습 동안 MB 출력 뉴런의 변조를 해독하는 데 있어서 이 도구의 가치를 나타낸다. 모니터링함으로써, 개별 비행 내에서, 후각 컨디셔닝 전후의 악취 유발 활동은 순진한 냄새 반응과 학습된 냄새 반응 사이에 직접적인 비교를 그릴 수 있습니다. 동일한 이미징 챔버에 고정되어 있는 동안 파리는 다양한 냄새에 노출됩니다. 그런 다음, 이러한 악취 중 하나가 감전과 짝을 이루는 비동기 연관 컨디셔닝프로토콜을 수신하고 (CS +가됨) 또 다른 냄새가 보강없이 제시됩니다(CS가됨 -). 마지막으로, 파리는 첫 번째 단계에서와 같은 냄새에 다시 노출됩니다. 칼슘 역학은 2 광자 현미경 검사법을 사용하여 관찰됩니다.

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Protocol

1. 형질전환 과일 파리, 초파리 멜라노가스터

  1. 교차 여성 처녀와 수컷 파리 (12 시간 빛 / 어두운 주기에 60 % 상대 습도에서 25 °C에서 제기) 원하는 Gal4 및 UAS 구성25를운반, 관심의 특정 뉴런이 유전적으로 코딩 을 표현하는 파리를 생산하기 위해 각각 칼슘 표시기.
  2. 그들은 3-6 일 후 에클로션의 범위에때까지 위의 십자가의 여성 자손을 나이. 암컷 파리는 약간 더 큰 크기 때문에 바람직합니다.

2. 생체 내 칼슘 이미징을위한 과일 플라이의 준비

  1. 단일 암컷 플라이를 선택하고 5분 이상 얼음에 마취합니다.
  2. 미세 집게를 사용하여 이미징 챔버에 플라이를 놓습니다(그림 1c에서입증). 흉부와 다리가 챔버 바닥의 전선과 접촉하고 머리가 평평하게 놓여 있는지 확인하십시오. 투명 접착 테이프를 사용하여 플라이의 위치를 고정합니다.
    참고 :이 프로토콜은 파리가 고정되어있는 맞춤형 챔버가 필요하며, 헤드 캡슐은 개구에 액세스 할 수 있으며, 파리는 흉부와 다리에 안테나와 전기 충격을 모두 받을 수 있습니다(그림 1).
  3. 메스 손잡이에 고정 된 수술 용 메스 블레이드를 사용하여 (재료 표참조), 안테나가 덮여 있고 흉부의 앞쪽 대부분 부분만 노출된 채로 비행헤드 주위에 테이프로 창을 잘라냅니다.
  4. 오목한 볼록한 턱이 있는 곤충 핀을 사용하여 조심스럽게 조작한 청색광 경화 접착제로 머리의 측면과 뒷면을 둘러싸고 있습니다. 파란색 발광 LED 램프를 사용하여 접착제를 설정합니다.
  5. 접착제가 완전히 설정되어 있는지 확인하고 플라이 헤드의 등지 표면에서 잔류 미경 접착제를 지웁히 하십시오.
  6. 링거 용액24(재료 참조)를 한 방울 떨어뜨려 머리의 노출된 표피를 덮습니다.
  7. 매우 미세 한 칼칼을 사용 하 여 표피를 잘라 냅니다. 표피를 가장 효율적으로 제거하기 위해 먼저 오켈리를 출발점으로 사용하여 머리 뒤쪽을 가로 질러 잘라냅니다. 그런 다음 각 면을 잘라 내어 눈에 내포하여 집게를 사용하여 쉽게 찢어 질 수있는 표피의 플랩을 형성합니다.
  8. 관심의 뇌 영역을 차단할 수 있는 여분의 표피를 제거합니다.
  9. 미세 한 집게를 사용 하 여 어떤 기관의 등지 표면을 신중 하 게 지우고, 뇌 조직 자체의 중단을 방지. 링거 용액24(재료 참조)를 제거하고 새로 고침하여 티슈 파편 영역을 제거합니다.
  10. 피하 악취 전달 바늘을 머리에서 약 1cm 떨어진 위치에 놓습니다. 안테나에 냄새 전달을 방해할 수 있는 것이 없는지 확인합니다.
  11. 현미경에서 피하 악취 전달 바늘을 통해 이미징 챔버를 악취 전달 시스템에 연결합니다.
  12. 비행이 마취와 수술에서 완전히 회복되고 공기 흐름에 적응할 수 있도록이 단계에서 10 분 휴식 기간을 구현하십시오.

3. 생체 내 칼슘 이미징

  1. 적외선 레이저가 장착된 다광자 현미경과 진동 절연 테이블에 설치된 수중 침수 목표(재료 표참조)를 사용합니다. GFP 기반 칼슘 지표의 시각화를 위해 레이저를 920 nm의 여기 파장에 조정하고 GFP 밴드 패스 필터를 설치하십시오.
  2. 거친 Z 조정 노브를 사용하여 뇌의 Z 축을 스캔하고 관심있는 뇌 영역을 찾습니다. 자르기 함수를 사용하여 스캔 시간만 이 영역에만 초점을 맞추고 머리 의 앞쪽이 아래쪽을 향하도록 스캔 뷰를 회전시면 됩니다.
  3. 프레임 크기를 512 x 512px로 조정하고, 속도를 > 4Hz로 스캔하고, 관심 있는 뉴런이 커버되도록 영역(Y 차원)을 스캔합니다.

4. 후각 컨디셔닝을 통해 악취를 유발한 칼슘 과도성 시각화

  1. 시간적으로 정확한 방식으로 여러 악취 자극을 전달할 수 있는 악취 전달 시스템19,26을 사용한다.
    1. 추가 컴퓨터를 사용하여 장치를 제어하고 이미징 현미경 소프트웨어와 통신하여 실험 중 냄새 자극을 이미지 캡처와 조정합니다.
    2. 이미지 수집 소프트웨어 및 냄새 전달 프로그램(예: 현미경 제어 소프트웨어에 설치된 VBA 매크로 패키지, 외부 입력에 반응하는 재료 표참조)을 연결할 수 있는 사전 프로그래밍된 매크로 패키지를 시작합니다. 별도의 프로그램에서 악취 전달 프로토콜의 개시에 의해 제공되는 트리거).
  2. 512 x 512 px의 해상도와 4 Hz의 프레임 속도에서 "사전 교육"/순진한 냄새 유발 칼슘 과도 현상을 모니터링하여 측정을 시작합니다. 0 기준 값) 및 냄새 오프셋 후 12.5 s. 두 번째 냄새와 함께 이것을 반복한 다음 세 번째 냄새와 함께 반복하십시오.
  3. 이 측정 후 3분 간 클래식 컨디셔닝("트레이닝")을 계속합니다.
    1. CS+ 냄새가 될 수있는 "사전 훈련"단계에서 제시 된 냄새 중 하나를 선택하고 다른 하나는CS가 될 수 있습니다 - 냄새. 12 개의 90 V 전기 충격과 함께 60 s용 컴퓨터 제어 냄새 전달 시스템을 사용하여 CS+ 냄새를 제시하십시오.
    2. 60 년대 휴식 후,CS를 제시 - 60 s. 냄새 4-메틸 사이클로헥사놀 과 3 옥탄올로 사용. 이 훈련 동안 제3 악취제(예를 들어, 1-옥텐-3-ol)는 훈련 단계 전(단계 4.2)과 후(step 4.4)에만 대조군으로 사용되기 때문에 제시하지 않는다.
  4. "훈련 후" 악취 유발 칼슘 과도를 다시 측정하여 "사전 훈련" 악취 자극 프로토콜(단계 4.2.) 3분 후 훈련 단계를 마친 후(단계 4.3).
    참고 : 이 단계의 타이밍은 기억 형성 후 관심의 시간을 반영해야합니다 (예를 들어, 단기 기억을 조사하기 위해 컨디셔닝 단계 후 3-4 분 이 단계를 수행). 일반적으로 파리는 이 준비에서 몇 시간 동안 생존할 수 있습니다.
  5. 이미징 파일을 나중에 이미지 분석을 위해 적절한 형식(예: Tiff)으로 저장합니다.

5. 이미지 분석

  1. 이미지를 분석하려면 피지27과같은 이미지 분석 소프트웨어에서 Tiff (또는 유사한) 파일을 엽니다.
  2. 이동 보정 알고리즘을 사용하여 스택을 정렬하여 X 및 Y 방향에서 최소한의 움직임을 보장합니다. Z 축에서 강한 움직임을 보이는 레코딩은 폐기합니다.
  3. 검사할 영역 주변의 관심 영역(ROI)을 표시하는 데 사용되는 소프트웨어 도구를 선택합니다. 이것은 배경 형광의 영향을 제한하기 위해 가능한 한 정확해야합니다.
  4. 소프트웨어의 각 도구를 사용하여 선택한 ROI로부터 의 데이터 파일로서 시간형광 강도 데이터를 추출하여 기록의 각 프레임에 대해 값이 생성되도록 한다.
  5. 데이터 분석 프로그램을 사용하여 데이터를 열어 각 악취 추적에 대한 ΔF/F0 값을 계산합니다. F0 = 악취가 발병하기 전 2s의 평균 형광. ΔF = 주어진 프레임에서의 원시 형광과 F0의차이. 이러한 값에서 악취 자극 기간 동안 상대형 형광을 반영하기 위해 시간에 대해 플롯할 수 있는 각 프레임에 대한 ΔF/F0 값을 계산합니다.

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Representative Results

위의 프로토콜로 획득한 이미지의 예는 그림 2에서볼 수 있습니다. d 호머-GCaMP3는 MB γ-로브의 구획 1을 내면화하는 MB 출력 뉴런으로 발현되며(뉴런은MVP2,29라고하며) 분할-Gal4 라인 MB112C16을사용하여 유전적으로 표적화된다. 또한, 세포순환 및 사후 공조 국소 칼슘 지표의 세포외 국소화의 차이도 입증되었다. 도 2a와 도 2f를비교할 때, dHomer-GCaMP3센서(14)의 특이적이고 구획화된 발현을 명확하게 관찰할 수 있다- 뉴런의 축색 구획에서 발현되지 않고, 현시부호가 보이는 구두점 신호 수지상에 보관할 수 있습니다. 클리어-하부 진폭-비강-GCaMP3(도2,하부 패널)를 발현하는파리에서 볼 수 있지만, 시비탈 GCaMP6f23(도 2,상부 패널)을 발현하는 파리와 비교된다. 이것은 이 도구가 후각 반응의 가시화에 효과적이라는 것을 보여주며, 따라서, 이 경우 악취 인코딩 및 기본 신경 회로의 검사에 추가특이성을 제공한다. 후각 학습.

후자의 예는 그림 3에서볼 수 있습니다. 본 실험에서, d호머-GCaMP3는 도 2에서와 같이 도시된다- 버섯 체출력 뉴런 MVP2. 이는 후각 학습을 통해 변조되는 것으로 알려진 뉴런으로, 비약적인 후각 컨디셔닝의 결과로서 시냅스 우울증이 훈련된악취(28,29)에 대한 사망한 후진내 반응에 반영되는 등 여기서 이 결과의 확인은 생체 내 칼슘 이미징 프로토콜을 사용하여 표시됩니다. 그림 3에 표시된 칼슘 추적은 하나의 개별 플라이에서 예시적인 데이터를 나타냅니다. 노이즈 레벨과 진폭은 개별 준비간에 다를 수 있습니다(예: 그림 2e그림 3c-e비교). 따라서 훈련 전과 사후의 동물 내 비교는 개체 간 가변성을 고려하는 방법을 제공합니다. 물론, 프로토콜은 관심 있는 다른 뉴런의 이미징으로 이송되기에 적합하다.

Figure 1
그림 1: 장착 챔버의 건설 및 이미징을 위한 플라이 준비. (a)플라이 마운팅 챔버의 시공을 위한 단계. 베이스는 미세한 플라스틱 메쉬(2)로 덮인 표준 현미경 슬라이드(1)로 형성된다. 반대 전하(3)를 운반하는 두 개의 전선이 양쪽의 슬라이드에 접착됩니다. 와이어가 벗겨지고 구부러져 슬라이드(4)를 서로 평행하게 실행하지만 접촉하지 않습니다. 투명 접착제 테이프(5)의 층은 플라이(약 1mm)의 높이에 도달할 때까지 첨가됩니다. 플라이의 폭에 맞게 폭 약 1mm, 테이프를 수직으로(6)로 잘라. 투명 한 점착 테이프 (7)로 만들어진 높은 플랫폼은 전선 바로 위에 내장되어 흉부가 전선 위에있는 동안 플라이의 머리에 대한 베개를 형성합니다. (b)2 광자 현미경 아래에 위치된 플라이의 개략적 그림. 악취 자극은 플라이헤드 앞에 위치한 피하 주사바늘을 통해 달성된다(테이프(6)의 채널을 통해 삽입되고 플랫폼(7)의 상부에 삽입되어 악취를 안테나로 지시한다). (c)---(h) 플라이 헤드의 고정 및 개구부. (c)이미징 챔버 내부에 고정 된 플라이, 채널 내부 (스케일 바 = 1mm) 전체 비행에 걸쳐 투명 접착 테이프의 신선한 조각에 의해 제자리에 개최. (d)위치에 있는 플라이의 확대 뷰. 배율 막대 = 0.1 mm.(e)창이 플라이 헤드 주위의 테이프로 절단됩니다. (f)머리는 파란색 경화 접착제로 더 고정됩니다. (g)헤드 캡슐은 링거의 용액으로 덮여 있고 열립니다. (h)과잉 조직과 기관 (흰색 조직에서 볼 수 있는(g)제거된 뇌의 준비를 완료하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: d호머-GCaMP3를 사용하여 가시화된 후분학적으로 국부화된 칼슘. (a)MB 출력 뉴런 MVP2에서 세포학적으로 국한된 GCaMP6f(i) 및 후시국화 된 d호머-GCaMP3 (ii)의 발현을 나타내는 공초점 현미경 이미지. 녹색 화살표는 MB γ-로브의 γ1 소영역을 나타낸다. 스케일 바 = 15 μm. (b)-(d) 상기 유전자형의 2광자 여기 현미경을 사용하여 캡처한 이미지, 각각의 칼슘 센서의 생체 내 형광을 나타낸. (b)F0 (기준선 형광) 이미지, 악취가 발병하기 전에 2 s의 평균 강도 투영으로 입증. 스케일 바 = 10 μm.(c)F악취 이미지(악취 자극 시 형광)는 악취 반응 기간(2.5s)에 걸쳐 평균 강도 투영으로 입증되었다. (d)실제 악취 반응 신호를 보여주기 위해 F악취 이미지에서F0 이미지를 빼서 생성된 ΔF 이미지. (e)ΔF/F0은 악취 자극(회색 막대)을 통해 각각의 유전자형의 상기 파리로부터의 트레이스이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: d호머-GCaMP3를 통해 시각화된 학습 유도 된 후소성 가소성. (a)이러한 실험에 사용되는 컨디셔닝 프로토콜의 회로도. 컨디셔닝 전("사전")의 순진한 냄새 반응이 먼저 측정됩니다. 그런 다음 각 비행은 세 가지 가능한 컨디셔닝 프로토콜 중 하나를 경험합니다 : 하나의 냄새 (CS+)가 감전 (미국)과 짝을 이루는 "페어링"과 다른 (CS-) 은 강화되지 않습니다. "냄새 만", 만 냄새가 제시되는 곳, 모두 강화없이, 악취 노출 효과를 제어 할 수 있습니다; 그리고 "충격 만", 만 전기 충격은 충격 노출 효과를 제어하기 위해, 어떤 냄새 자극없이 제시된다. 이 컨디셔닝 단계 후, 파리는 변경 된 냄새 유발 활동 ("Post")을 테스트하기 위해 다시 "사전"냄새에 노출됩니다. (b)쌍냄새/충격 프리젠테이션의 결과로 악취 반응 변조의 예. CS+냄새에 대한 반응의 강한 억제는 γ1 소부전부(점선)에서 볼 수 있다. (c)-(e)(b)와같은 비행으로부터의 악취 반응 추적은, 훈련된 악취의 경우에만 이러한 억제 효과가 관찰됨을 보여준다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

학습 및 메모리의 기본 신경 회로의 해부는 신경 과학 분야에서 눈에 띄는 목표. Drosophila의 유전 적 접근성과 행동 테스트의 폭과 용이성은 이러한 현상을 조사하기에 이상적인 도구입니다. 여기서, 후각 컨디셔닝의 결과로 세포 내 수준에서 발생하는 변조, 개별 파리 내에서 시각화 할 수있는 방법이 제시된다. 우리 그룹17에의해 처음 확립 된 악취 유발 칼슘 역학의 사전 교육 및 사후 교육 시각화를 모두 수행함으로써 순진한 냄새 반응과 학습 된 냄새 반응 사이의 직접적 인 동물 내 비교를 그릴 수 있습니다. 관심 있는 뉴런의 가소성을 검사합니다. 이것은 사전 및 사후 교육 상태가 개인에 대해 정량적으로 평가 될 수 있기 때문에 대량 평가 (고전적인 후각 컨디셔닝에 사용)를 통해이 프로토콜에 이점을 부여합니다. 가변성. 더욱이, 현미경의 밑에 직접 행해지는 훈련 절차는 행동 실험에서 전형적으로 이용되는 고전적인 후각 조절 패러다임과 크게 동일하며 뉴런의 인공 광유전학 자극을 관련시키지 않습니다. 물론, 작은 파리를 처리하고 감각 기관을 그대로 유지하면서 뇌 조직을 손상시키지 않고 조심스럽게 머리 캡슐을 열면 세심하고 반복적인 훈련을 통해 얻을 수있는 전문 지식이 필요합니다. 전기 생리학과 같은 생리학적 평가.

추가적으로, 단일 뉴런 수준에서 가소성을 검사하기 위하여 현지화된 칼슘 표시기를 사용하는 가능성은 입증됩니다 - 신경 회로 해부에 더 중대한 정밀도를 추가하. 이는 잘 조사된 MB 출력 뉴런28,29에서후배설 반응의 학습 유발 우울증을 나타낸 것을 예로 들어 한다. UAS 제어 하에 다양한 합성 국소 형광 센서를 발현하는 초파리 균주,예를 들어, 시냅스의 사전 국소 센서 시냅토피신-GCaMP3 또는 적색 형광 센서를 발현할 수 있습니다. 전송 시냅토피신-pHTomato20. 물론, 다양한 형광 센서 단백질은 전술한 프로토콜을 사용하여 구현될 수 있다.

광학 이미징 기술은 일반적으로 현미경 이미지 수집 시스템(예를 들어, 2광자 현미경)의 시간적 및 공간 적 분해능 및 센서 자체의 시간적 분해능(예를 들어, 칼슘 센서의 역학)에 의해 제한된다. 전기 생리학적 기록, 예를 들어, 초파리 뇌의 뉴런 소마타에서 패치 클램프 전기 생리학을 사용하여, 여전히 타의 추종을 불허하는 시간적 해상도를 제공하지만, 공간 정밀도를 제공하지 않고. 센서의 세포 외 국소화와 결합 된 관심있는 뉴런에서 유전자 발현의 특이성으로 인해 광학 이미징 기술은 잠재적으로 전기 생리학 기술을 보완하여 근본적인 뉴런 가소성을 발견 할 수 있습니다. 학습 및 메모리 형성. 형광 센서 개발의 지속적인 진전은 아마도 센서 단백질을 더 빠른 역학 또는 더 높은 신호 대 잡음 비(예: GCaMP6 변이체23)와합성국화 단백질과 융합시킬 수 있는 가능성을 제공할 것입니다. d호머처럼. 또한, 빠른 획득 속도 또는 더 높은 공간 해상도로 현미경 기술을 확립하는 최근의 발전은 우리의 접근 방식의 추가 미세 조정에 매우 중요합니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

이 작품은 공동 연구 센터 SFB 889 "감각 처리의 메커니즘"과 2705 "뇌 회로의 해부 : 구조, 가소성 및 행동 기능의 연구 단위를 통해 독일 연구위원회에 의해 지원되었다 초파리 버섯 몸".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Octen-3-ol Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA O5284 Chemical used as odorant
3-Octanol Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 218405 Chemical used as odorant
4-Methylcyclohexanol Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 153095 Chemical used as odorant
Bandpass filter for EGFP (525/50 nm) Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany
Clear adhesive tape Tesa SE, Norderstedt, Germany Standard claer adhesive tape
Concave-convex jaws Fine Science Tools, North Vancouver, Canada 10053-09 Blade Holders with concave-convex jaws
Fine forceps Fine Science Tools, North Vancouver, Canada 11412-11 Forceps with tip 0.1 x 0.06mm
Hypodermic needle Sterican - B. Braun, Melsungenk, Germany 4665120 1.20x40mm
Insect Minutien pins Fine Science Tools, North Vancouver, Canada 26002-10 Diameter 0.1mm, tip 0.0125mm
Kentoflow Kent Express Dental Supplies, Gillingham, UK 953683 Blue light-curing glue
Microscope slide Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany 0656.1 Standard objective slide 76 x 26 mm
Mineral oil Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA M8410 Used as diluent for odorants
Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2 Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA Tunable infrared femtosecond laser
Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices.
Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany 421452-9900-000 Objective W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
Ringer's solution n.a. n.a. 5mM KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM sucrose, pH = 7.4
Stab knife Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA 72-1551 5.0mm Straight restricted blade depth
Surgical scalpel blade Swann-Morton, Sheffield, UK 0303 Product No. 11
Surgical scalpel handle Swann-Morton, Sheffield, UK 0907 Product No. 7S/S
Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger
from the odor-delivery device and the electric shock
application device (power supply) to interact with the
ZEN software from Zeiss that controls the microscope.
Custom-written and available upon request n.a. n.a.

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