בידוד ואפיון של החולה-הלבלב הנגזר דוטל אדנוקרצינומה מודלים אורגאיד

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

המטופל-התרבויות הנגזרות של הלבלב אדנוקרצינומה הם מודל תלת מימדי מבוסס במהירות המייצגים תאים סרטניים אפיתל הגידול עם נאמנות גבוהה, המאפשר מחקר טרנסלtional לתוך זה ממאירות קטלני. כאן, אנו מספקים שיטות מפורטות כדי ליצור ולהפיץ אורגנואידים, כמו גם לבצע מאמר ביולוגי רלוונטי באמצעות מודלים אלה.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Tiriac, H., French, R., Lowy, A. M. Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models. J. Vis. Exp. (155), e60364, doi:10.3791/60364 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

לבלב הלבלב אדנוקרצינומה (PDAC) הוא בין ממאירות קטלנית ביותר. לאחרונה, הדור הבא שיטות תרבות אורגאיד המאפשרות מידול תלת מימדי (3D) של מחלה זו תוארה. מודלים מסוג אורגאיד הנגזר מהמטופל (PDO) יכולים להיות מבודדים הן מדגימות הניתוח והן מהביופסיה הקטנה והצורה במהירות בתרבות. חשוב מכך, מודלים אורגנואיד לשמר את השינויים הגנטיים הפתוגניים שזוהו בגידול של המטופל, הם ניבוי של תגובת הטיפול של המטופל, ובכך מאפשר מחקרים טרנסלבותית. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים מקיפים להתאמת זרימת העבודה של תרבות רקמות כדי ללמוד 3D, מטריקס מוטבע, מודלים אורגנואיד. אנו מפרטים שיטות ושיקולים עבור בידוד והפצת הראשי PDAC אורגנואידים. יתר על כן, אנו מתארים כיצד מדיה אורגאיד העידו מוכן איכות בשליטה במעבדה. לבסוף, אנו מתארים בחני האפיון המטה של מודלים אורגנואיד כגון בידוד של חומצות גרעין (DNA ו-RNA), ובדיקות סמים. חשוב לציין שיקולים קריטיים ליישום מתודולוגיה ארגונית במעבדת מחקר.

Introduction

מחלת הלבלב אדנוקרצינומה (PDAC) היא מחלה קטלנית המאופיינת אבחנה מאוחרת ברוב החולים, חוסר טיפולים יעילים, ושיעור כתוצאה נמוכה 5-שנה הישרדות הכוללת שנשאר פחות מ 10%1. רק 20% מהחולים מאובחנים עם מחלה מקומית מתאים התערבות כירורגית מרפא2,3. המטופלים הנותרים מטופלים בדרך כלל עם שילוב של סוכני כימותרפיה כי הם יעילים במיעוט של חולים4,5. כדי לענות על הצרכים הקליניים הדחופים האלה, חוקרים עובדים באופן פעיל על אסטרטגיות גילוי מוקדם ופיתוח של טיפולים יעילים יותר. כדי להאיץ את התרגום הקליני של תגליות חשובות, מדענים מהונדסים גנטית מודלים העכבר, החולה נגזר xenografts תלי, מונאולייר תאים קווים, ו, לאחרונה, מודלים אורגאיד6.

תרבות תלת ממדית האפיתל אורגאיד באמצעות גורם הצמיחה ו-Wnt-ligand התנאים עשיר כדי לעורר התפשטות של תאים מחולל שינוי לראשונה תוארו על מעיים העכבר7 והותאמו במהירות לרקמת הלבלב האנושי נורמלי8. בנוסף רקמת דוטל רגילה, מתודולוגיה ארגונית מאפשרת בידוד, התרחבות, ולימוד של האדם PDAC8. חשוב לעשות זאת, השיטה תומכת בהקמת אורגנואידים מדגימות כירורגי, כמו גם ביופסיות מחט בסדר הליבה, המאפשר לחוקרים ללמוד את כל שלבי המחלה9,10. מעניין, מטופל נגזר החולה לכידה היטב מתוארים הגידול תת-ממדי והוא עשוי לאפשר פיתוח של פלטפורמות רפואה מדויקת9,11.

הפרוטוקולים הנוכחיים של הארגון עבור PDAC מאפשרים הרחבה מוצלחת של יותר מ-70% מדגימות המטופלים ממטופלים תמימים מכימותרפיה9. כאן אנו מציגים את האמצעים הסטנדרטיים המועסקים על ידי המעבדה שלנו כדי לבודד, להרחיב, ולאפיין את החולה הנגזרות PDAC אורגנואידים. מתודולוגיות משנה נוספות של pdac מתוארות12,13 אך לא השוואה של שיטה זו בוצעה ביסודיות. כאשר טכנולוגיה זו היא חדשה יחסית ומתקדמת מהר, אנו מצפים כי פרוטוקולים אלה ימשיכו להתפתח ולשפר; עם זאת, העקרונות של הטיפול ברקמה ותרבות אורגאידית ימשיכו להיות שימושיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל אוסף רקמת האדם לשימוש מחקר נבדק ואושר על ידי לוח הסקירה הפנימי שלנו (IRB). כל הפרוטוקולים הבאים מתבצעים בתנאים אספטי בסביבת המעבדה לתרבות רקמת היונקים.

1. הכנת מדיה

  1. הכנה למדיה ממוזגת.
    הערה: התקשורת האנושית אורגאיד הלבלב דורש גורמים צמיחה שופע חומרים מזינים, כמו גם תוספת מדיה ממוזג כדי לספק גירוי גדילה מספיק עבור התרחבות אורגאיד. שני המדיומים הממוזגים המתוארים להלן מוכנים מקווי תאים זמינים מסחרית (ראו טבלת חומרים). עבור פרוטוקולים וחומרים מלאים, עיין באתרי האינטרנט של היצרנים.
    1. הפקת מדיה ממוזגת R-spondin1 בהתאם לפרוטוקול היצרן.
      1. ראשית, להרחיב את התאים 293T להביע R-spondin1 באמצעות אנטיביוטי המתאים (Zeocin) שיטות בחירה בנוכחות של סרום שופע (10%). כאשר מייצרים מדיה ממוזג, לסגת ולשטוף את בחירת אנטיביוטיקה סרום כך לא אנטיביוטיקה ונסיוב נמצאים במדיה הממוזג הסופי. חשוב מכך, המדיה הממוזגת חייב להיות סינון מחוטא לאחר האוסף (0.2 μm) כדי למנוע זיהום צולב.
      2. אחסון מדיה ממוזגת בגרשיים ב-4 ° צ' לשימוש לטווח קצר (בתוך 6 חודשים) או ב-20 ° c לאכסון לטווח ארוך (למעלה מ -6 חודשים). יש להימנע ממחזורים של הפשרת ההקפאה.
    2. הפקת מדיה ממוזגת של L-Wnt-3A בהתאם לפרוטוקול היצרן.
      1. ראשית, להרחיב את ה-L-M (TK-) תאים המבטא L-Wnt-3A באמצעות אנטיביוטי מתאים (G-418) שיטות בחירה בנוכחות של סרום שופע (10%). בעת הפקת מדיה ממוזגת, לסגת ולשטוף את בחירת אנטיביוטי כך שאין אנטיביוטיקה קיים במדיה הממוזג הסופי; עם זאת, לשמור על סרום לאורך כל culturing ומיזוג. חשוב מדיה ממוזג שנאסף חייב להיות מסנן עיקור (0.2 μm) כדי למנוע זיהום צולב.
      2. אחסן את המדיה הממוזגת המצוטטת ב-4 ° צ' לשימוש לטווח קצר, או 20 ° צ' לאחסון לטווח ארוך. יש להימנע ממחזורים של הפשרת ההקפאה.
    3. עבור בקרת איכות, בצע בדיקת TOPFLASH כדי לבדוק את הפעילות של Wnt של R-spondin1 והמדיה הממוזגת של L-Wnt-3A בלבד ובשילוב בהתאם לפרוטוקול שפורסם לפני כן14.
  2. הכנת המדיה הבזליים: השתמש במדיה הבזליים להכנת מדיה ארגונית מלאה, כמו גם שטיפת שלבים לעבודה ארגונית. מוסף מתקדם DMEM/F-12 עם גלוטמין בריכוז סופי של 1x, HEPES (10 מ"מ), ו פניצילין/סטרפטומיצין (100 U/mL). אחסן את המדיה הבזליים ב-4 ° c.
  3. הכנת מדיה להשלים אורגנואיד: תוספת המדיה הבזליים עם מדיה ממוזגת R-spondin1 בריכוז הסופי של 10% v/v, L-Wnt-3A התקשורת הממוזגת בריכוז הסופי של 50% v/v, האדם EGF (50 ng/mL), האדם FGF (100 ng/mL), אדם גסטרין I (10 ננומטר), עכבר הראש (100 ng/mL), A83-01 (500 nM), תוספת B27 (1x), ניטינאמיד (10 מ"מ), N-acetylcysteine (1.25 mM), ו Primocin (100 μg/mL).
    1. עבור מבודדים ארגונית מרכזית, תרבויות מופמות ותרבויות שמתחילות בתאים בודדים, כוללות את מעכב Rho קינאז Y-27632 בריכוז סופי של 10.5 μM.
    2. הכינו את המדיה המלאה של האדם בקרח והחנות ב -4 ° c לשימוש בתוך חודש אחד. מסיבה זו, אנו ממליצים על הכנת מדיה שבועית טרייה.

2. בידוד אורגנואידים של PDAC

הערה: הפשרת התמיסה (BME) (גורם הגדילה מופחת; ראו טבלת חומרים) על קרח בסביבה של 4 ° c (מקרר או חדר קר) לפחות 12 שעות לפני השימוש. מודטת לוחיות התרבות של הרקמה לתרבות האורגאידית בחממה 37 ° c לפחות 12 שעות לפני השימוש.

  1. לאסוף ולהעביר דגימה בניתוח הסרת הגידול למחקר בפתרון אחסון באגירה כדי לשמור על הכדאיות של הרקמה. השתמש במדיה בבזליים או בפתרון אחסון מסחרי של רקמות.
  2. המשך לבודד אורגנואידים בהקדם האפשרי לאחר קבלת הדגימה. ניתן לאחסן את הרקמה בתמיסה של עד 24 שעות לאחר הניתוח ועדיין להניב את ארגון האחסון.
  3. פעם אחת במעבדה, להעביר גידול לצלחת 10 ס מ רקמות רקמה להסיר פתרון אחסון.
  4. בזמן הטיפול ברקמה עם מלקחיים מתכתיים, המחגון את הגידול עם אזמל מ#10 לרסיסים קטנים של 1 מ"מ3 או קטן יותר. שברי גדול יותר ייקח זמן רב יותר לעכל; לכן, המטרה ליצור מידות של רקמה הומוגנית. אם הרקמה כבר מצטברת או קטנה יותר מ-1 מ"מ3 קטעים, דלג על שלב זה.
  5. העבר את שברי הרקמה לצינור בצורת 15 מ ל המכיל 10 מ ל של אמצעי התקשורת הבזליים. מערבבים על ידי היפוך הצינור מספר פעמים. צנטריפוגה את הצינור ב 200 x g עבור 5 דקות. לאחר ספין, להסיר את התקשורת בסיס בקפידה כדי למנוע אובדן שברי הרקמה.
  6. לצינור המכיל את שברי רקמות להוסיף 9 מ ל של מדיה בסיס 1 מ ל של 10x עדין הקולגן התמיסה/Hyaluronidase פתרון. כדי להימנע מהשיא של תאים במהלך העיכול, מוסף פתרון זה עם 20 μL של 10 מ"ג/mL DNAse I פתרון. מערבבים על ידי היפוך הצינור מספר פעמים.
  7. מודיית את העיכול האנזימטי ב-37 ° c על מסובבי או מסובב. לערבוב הולם במהלך העיכול, שברי הרקמה חייבים כל הזמן לנוע דרך הפתרון.
    הערה: התזמון לדיסוציאציה האנזימטית של הגידול חייב להיקבע בהתאם לכל דגימה. מידת העיכול המוצלחת של הגידול מתאפיינת בירידה בגודל שברי הרקמה עד שאינם מסומנים בבירור לעין העירומה. במקביל, האטימות של התמיסה תגדיל כמו שברי רקמה מיקרוסקופיים משתחררים.
  8. לאחר 30 דקות, הסירו את צינורית החרוט מהאינקובטור 37 ° c והתבוננו. אם שברי הרקמה עדיין גלויים בבירור, המשיכו את הדיסוציאציה ב-37 ° צ' עם ערבוב קבוע. חזור על התבוננות זו כל 30 דקות עד שרוב או כל שברי הרקמה השתכבו. בהתאם לחריפות של ערבוב, כמו גם את גודל וכמות של שברי הגידול, שלב זה יכול לקחת מעט כמו 30 דקות עבור דגימות קטנות או כל עוד 12 h עבור דגימות גידול גדול יותר.
  9. לאחר שדיסוציאציה האנזימטית תושלם, צנטריפוגה את הצינור ב-200 x g עבור 5 דקות. לאחר ספין, כדורית התא צריך להיות גלוי, supernatant צריך להיות ברור, המציין כי כל התאים כבר יצא מהפתרון. , אם זה לא המקרה. חזור על הספין
  10. הסר בזהירות את הסופרנטאנט כדי להימנע מאיבוד הגלולה הסלולרית. מיד לשטוף את התאים עם 10 מ"ל מדיה בסיס על ידי ערבוב בעדינות את הצינורות עם היפוך. צנטריפוגה את הצינור ב 200 x g עבור 5 דקות. בזהירות להסיר את המדיה הבזליים כדי למנוע אובדן תאים ולחזור על שלב זה כביסה פעם נוספת עבור סך של שני שטיפת.
  11. לאחר השטיפה השנייה, להסיר את כל המדיה בסיס בזהירות למקם את הצינור על הקרח עבור 5 דקות.
  12. בשלב זה, מניחים מדיה מלאה אורגנואיד באמבט מים 37 ° c כדי לחמם מראש.
  13. מערבבים את הגלולה התא עם קרח קר BME בזמן שמירה על הצינור על הקרח. . צפיפות הזריעה צריכה להיות גבוהה לבידוד אורגאיד עבור גלולה קטנה (~ 50 μL) השתמש 200 μL של BME, בעוד עבור גלולה גדולה (~ מ200 μL) השתמש 800 μL של BME. מערבבים את התאים ואת BME על הקרח באמצעות מp200 הצינורות עד הפתרון מופיע הומוגנית תוך הימנעות יצירת בועות בפתרון.
  14. ספוט כיפת 100 μL במרכזו של באר של צלחת טרום מחומם 12 היטב באמצעות מp200. חזור על כך עד שכל פתרון BME הושם. העבר בזהירות את הצלחת לחממה 37 ° c כדי לאפשר ג'ל BME כדי לגבש.
  15. לאחר 10 דקות, לאחזר את הצלחת ולהוסיף 1 מ ל של מדיה להשלים טרום מחומם ארגונית מלאה לכל טוב. מחלק את התקשורת בצד הבאר כדי למנוע הפרעה של כיפת BME.
  16. שימו לב לקטעי התאים בעזרת מיקרוסקופ הפוך לתרבות הרקמה באמצעות עדשת 4x בברייטפילד.
    הערה: תאים בודדים ושברי רקמה מיקרוסקופיים צריכים להיות גלויים בבירור. בידוד מוצלח מאופיין במראה של יותר מ 10 אורגנואידים לאחר 24 – 48 h; התרבות צריכה להיות מדוברת בתוך שבוע אחד. כמו דגימות הגידול הם הטרוסוגני, כמה בדלאידים מסוימים הם מאתגרת יותר כמו רק אורגנואידים כמה לגדול לכל טוב, כפי שמוצג באיור 1. במקרה זה, אפשר לתרבות להימשך עד שבועיים כדי למקסם את מספר התאים הזמינים לצורך הזדקנות. כדי להסביר את צריכת המדיה והאידוי במהלך התרבות, למעלה את התרבויות עם 200 μL של התקשורת המלאה מחומם מראש המלא כל 5 ימים.

3. הפסג ' אורגנואידים של PDAC

  1. להחזיר את הצלחת. מחממה לתרבות הרקמה עם מרים תא סטרילי, להרים בעדינות את הכיפה BME כך הוא צף במדיה המלאה. הימנע מגרד את החלק התחתון של הבאר כדי לא להסיר את כל התאים המונאולייר המצורפת פלסטיק, כמו אלה הם בדרך כלל פיברופיצוצים.
  2. עם פיפטה p1000, העבר בזהירות את כיפת BME ואת אמצעי התקשורת ל-15 מ"ל שפופרת חרוט. חזור על שלב זה עבור כל מתאים המכילים היטב אורגנואיד.
  3. לשטוף בעדינות כל טוב שנקצרו עם 1 מ ל של המדיה הבזליים קר, ולהעביר את הצינור 15 מ"ל המכיל את האורגנואידים.
  4. ביסודיות לערבב את הפתרון ואת אורגנואידים עם p1000 tte ו ספין למטה ב 200 x g עבור 5 דקות. לאחר ספינינג, שכבת BME המכילה אורגנואידים בהשעיה וגלולה אורגאידית יופיע בתחתית הצינור. הסר בזהירות את הסופרנטאנט, הימנעות מאובדן השכבה BME/אורגנואיד. . שים את השפופרת על הקרח
  5. הוסף 10 מ ל של הקרח קר פתרון שחזור התא (CRS) לצינור ולערבב ביסודיות על ידי היפוך. הדבר יכווץ את מטריצות החלבון של ה-BME ב-4 ° c. דגירה על קרח 30 דקות תוך ערבוב כל 3 דקות על ידי היפוך. אם הוא זמין, הניחו את הצינורית על מערבל מסתובב בחדר קר או במקרר בגודל 4 ° c במשך 30 דקות.
  6. לאחר הדגירה 30 דקות, ספין למטה ב 200 x g עבור 5 דקות. הגלולה הארגונית צריכה להיות ברורה בעוד שכבת BME צריך להיעלם. אם שכבת BME מוקטן בגודל אך עדיין גלוי, מודמת עבור 30 דקות נוספות ב 4 ° c עם ערבוב וחוזר ספין.
  7. הסירו את הCRS מאחורי. הגלולה האורגאידית שטוף את האורגנואידים עם מדיה בבסיס של 10 מ ל על ידי ערבוב עם היפוך. ספין למטה ב 200 x g עבור 5 דקות ולהסיר את supernatant. מניחים את הצינור עם הגלולה האורגאידית על הקרח לפחות 5 דקות.
  8. באופן אופציונלי, אם הכנה תא בודד רצוי, מארג את האורגנואידים עם 3 מ ל טריפסין שיושלם עם 30 μL של 10 מ"ג/mL DNAse הפתרון כדי למנוע הכנת תאים במהלך העיכול.
    1. מודיית את התגובה אנזימטית ב 37 ° c עם היפוך עדין ערבוב כל 2 דקות עד 10 דקות. מוניטור ולאשר מוצלחת הדיסוציאציה תא בודד תחת מיקרוסקופ שדה ברייטאני.
    2. כדי לעצור את התגובה האנזימטית, להוסיף 10 מ ל של התקשורת הבזטית קר קרח ספין למטה ב 200 x g עבור 5 דקות.
    3. שטוף תאים עם 10 מ"ל מדיה בסיס על ידי ערבוב עם היפוך עדין. מסתובבים ב200 x g עבור 5 דקות ומסירים את הסופרנטאנט וחוזרים על הכביסה עוד פעם אחת. מניחים את הצינור עם הגלולה תא על הקרח לפחות 5 דקות.
      הערה: אנו ממליצים לבצע שלב זה כל 3-5 מעברים במהלך תחזוקה סדירה של האורגנואידים כדי ליצור תרבות הומוגנית עם מספר רב של אורגנואידים.
  9. הוסף קרח קר BME אל הגלולה תא ולערבב בעדינות על הקרח עד הפתרון הוא הומוגנית באמצעות מp200. בעוד הימנעות לייצר בועות בתערובת, פיפטה למעלה ולמטה לפחות 5-10x, הצבת קצה של הפיפטה קרוב לתחתית הצינור כדי לעזור מכנית לשבור את האורגנואידים. כמדריך, להשתמש 4 – 6x את הנפח של BME/כדורית תא כגון יחס פיצול הוא לא יותר מ 1:2 מעבר אחד לשני.
  10. ספוט כיפת 100 μL במרכזו של באר של צלחת טרום מחומם 12 היטב באמצעות פיפטה p200; חזור על הפעולה עד שכל פתרון BME הגיע לפעולה. העבר בזהירות את הצלחת לחממה 37 ° c כדי לאפשר ג'ל BME כדי לגבש. לאחר 10 דקות, לאחזר את הצלחת ולהוסיף 1 מ ל של מדיה להשלים טרום מחומם ארגונית מלאה לכל טוב. מחלק את התקשורת בצד הבאר כדי למנוע הפרעה של כיפת BME.
  11. אורגנואידים צריך לבצע רפורמה ולהתחיל לצמוח בתוך 24 h. תרבויות אורגנואיד הם בדרך כלל מעבר לגיל 7-10 ימים בהתאם לצפיפות התרבות והפצת התאים. במקרה הצורך, למעלה את התרבויות עם 200 μL של מדיה מראש מחומם מלאה אורגנואיד כל 5 ימים כדי לפצות על גורם הגדילה והתאיידות.

4. הקפאה והפשרה של אורגנואידים PDAC

  1. כדי להקפיא את האורגנואידים, המשך לקצור את האורגנואידים ולהארת את ה-BME כפי שמתואר בשלבים 3.1 – 3.7.
  2. לתוך הגלולה תא, להוסיף 1 מ ל של הקפאת מדיה, לערבב בעדינות, ולהעביר את התערובת לקריובקבוקון מראש המסומן.
  3. מניחים את הקריובקבוקון במיכל קפוא כדי לשמור על ירידה בטמפרטורה מתמדת ובמקום במקפיא של 80 ° c. לאחר 24 עד 48 h, להעביר את הבקבוקונים קפוא לאחסון חנקן נוזלי. אורגנואידים יכול להיות הקפאה במשך חודשים באמצעות שיטה זו.
  4. כדי להפשיר את האורגנואידים, להחזיר. את הקריובקבוקון הקפוא מאחסון חנקן נוזלי להעביר את הבקבוקון הקפוא על. קרח יבש לחדר התרבות של הרקמה
  5. מניחים את ההקפאה הקפואה באמבט המים 37 ° c כדי להפשיר במהירות את האורגנואידים ולהעביר את התכולה של הבקבוקון ל-15 מ ל שפופרת חרוטי המכילה 9 מ ל של אמצעי התקשורת הבזליים התחממו לטמפרטורת החדר.
  6. ספין למטה ב 200 x g עבור 5 דקות ולהסיר את supernatant. מניחים את הצינור עם הגלולה האורגאידית על הקרח לפחות 5 דקות.
  7. המשך להשעות מחדש ב-BME ובצלחת האורגנואידים כמתואר בשלבים 3.9 – 3.11.
    הערה: תרבויות אורגנואיד להתאושש לאט לאחר מחזור הקפאה/הפשרה, ולכן תרבויות יכול להיות גדל עד שבועיים לפני שאתה מקבל הזדקנות.

5. איפיון אורגנואידים של PDAC

הערה: האפיון של האורגנואידים צריך להתבצע על תרבות מבוססת לאחר מספר מעברים כדי לצמצם את הסיכון לזיהום מסוגי תאים שאינם אפיתל כגון פיברותקיעות ותאים חיסוניים.

  1. מיצוי חומצת גרעין מאורגנואידים של PDAC
    1. מארגני צלחות על לוח 12 היטב המוקדש החילוץ חומצה גרעין. צלחת לא יותר מ-100 μL של BME לכל טוב. לתשואה מספקת של דנ א/RNA, צלחת לפחות 2 – 4 בארות לכל תרבות. לגדל אורגנואידים עבור עד 5 ימים עד התרבויות קרובות confluent אך נטול פסולת התא מוגזמת המצטבר בתרבויות לטווח ארוך.
    2. להחזיר את הצלחת מהאינקובטור 37 ° c ולהסיר לחלוטין את כל העקבות של המדיה המלאה אורגאיד, משאיר רק את כיפת BME המכילה את האורגנואידים על הצלחת.
    3. הוסף 900 μL של חומצה פנול מגיב ( לראות את הטבלה של חומרים) לכל טוב ולערבב ביסודיות באמצעות p1000 tte עד הפתרון הופך הומוגנית. BME יהיה לחלוטין מומס חומצה פנול מגיב ואורגנואידים יהיה lyse לאחר 5 דקות הדגירה הקטנה.
      התראה: חומצה פנול היא כימיה מסוכנת שיכולה לגרום לכוויות כימיות. טפל בזהירות בעזרת הגנות וטכניקה מתאימים.
    4. העבר את הפתרון האחיד לשפופרת של 2 מ"ל והוסף 200 μL של כלורופורם. דגירה 5 דקות ו צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 15 דקות ב 4 ° c.
    5. המשך לחילוץ RNA ו-DNA בהתאם לפרוטוקול של היצרן. RNA יכול להיות מופק מן השלב מימית בעוד DNA ניתן להפיק מן השלב הבין ואורגני. פעם מטוהר וכימות, RNA ו-DNA מבודדים מבארות שונות של אותה תרבות ניתן למאגר כדי להגדיל את התשואה.
      הערה: (1) בעוד אנו ממליצים בחום על שימוש זה חומצות גרעין שיטת החילוץ עבור RNA, יש הרבה שיטות טובות לבידוד DNA מתאים מתורבתים. (2) כדי לוודא את הנוכחות של תאים סרטניים בתוך התרבות ארגונית, אנו ממליצים על רצפי ה-DNA באמצעות שיטת הדור הבא המועדף שלך רצף כדי לזהות מוטציות בתוך הגנים המכילים PDAC (קראס, TP53, SMAD4, CDKN2A).
  2. פרמקוקינהקלדה של מארגני PDAC
    1. בידוד תאים בודדים מאורגנואידים כמתואר לעיל בשלבים 3.1 – 3.8. כדי למקסם את מספר התא, לקצור לפחות 10 בארות שוטפת של צלחת 12 היטב
    2. השעיה מחדש של תאים בודדים ב 1 mL מדיה להשלים אורגאיד. הנוכחות של גושי תאים קטנים (~ 2-10 תאים) הוא מקובל, עם זאת הגושים הגדולים התאים יהיה שלילי להשפיע על ניתוח במורד הזרם.
    3. ספירת תאים באמצעות מונה תאים אוטומטי ויכולת הקלט של תא. לחשב את המספר הכולל של תאים ותאים קיימא נוכח ההשעיה 1 mL.
    4. עבור בדיקות טיפוליות, צלחת 1,000 תאים קיימא לכל טוב של 384 צלחת הבאר. עבור צלחת הבאר 384 אנו מעריכים שנשתמש 400,000 תאים קיימא (מחושב עבור 400 בארות).
    5. הכנת תאים עבור ציפוי על ידי ערבוב על קרח 800 μL של BME עם 7.2 mL של מדיה מלאה אורגאיד המכיל את התאים. שמור על התערובת על קרח ועל צלחת 20 μL לכל טוב של 384 צלחת היטב. השתמש בפיפטה בן 12 ערוצים ובמאגר שנשמר על הקרח כדי להתאים את התאים ביעילות. כדי למנוע אידוי מוגזם מן הצלחת, הבארות החיצוניות יכול לשמש כמאגר (60 μL PBS או מים לכל טוב), אבל זה יוביל לאובדן של 76 בארות ניסיוני.
    6. לסובב את הצלחת למטה ב 100 x g עבור 1 דקות בדלי הנדנדה. זה מאפשר את הנפח 20 μL קטן ו אורגנואידים להתיישב בתחתית הצלחת.
    7. מניחים צלחת בחממה 37 מעלות צלזיוס של הרקמה כדי לאפשר לאורגנואידים להיווצר. לאחר 24 שעות, לבדוק נוכחות של אורגנואידים באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד.
    8. המשך מינון תרכובות טיפוליות מומס DMSO אל הצלחת באמצעות מדפסת סמים או מכשיר שווה ערך. בדוק כל מינון של סמים. בבארות של שלישיה כדי לבצע ניתוח מינון אפקטיבי התגובה, לקבוע את טווח המינון עבור כל תרופה באופן אמפירי, החל עם נמוך, לא יעיל, מינון וסיום עם מינון גבוה שבו ההשפעה המקסימלית היא נצפתה. דוגמאות של טווחי מינון עבור תרכובות כימותרפיות פורסמו לאחרונה9.
    9. לחשוף את התאים לתרכובות הטיפוליות במשך 3 – 5 ימים.
    10. באופן אופציונלי, בסוף הטיפול, התמונה הצלחת להעריך את ההשפעה הטיפולית על גודל, מספר, מורפולוגיה.
    11. העריכו את הכדאיות באמצעות 20 μL לכל היותר של היכולת לאור היכולת הממוצעת של תא (ראה טבלת חומרים) לפי פרוטוקול היצרן. ליומטר יהיה צורך ברכישת נתונים ובתוכנה גראפית לניתוח נתונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי להמחיש את האתגרים הקשורים עם בידוד אורגנואידים מ PDAC, אנו מראים את הקמתה של החולה מטופל התרבות האורגאידית מדגימה קטנה hypocellular הגידול. לאחר ציפוי ראשוני, רק כמה אורגנואידים היו גלויים לעין, כפי שמוצג באיור 1. לאורגנואידים הורשו לגדול במשך השבוע השני והיו מעבר בהתאם לפרוטוקול שלנו להקמת תרבות איתנה יותר, כפי שניתן לראות במעבר המוקדם והמאוחר 1 תמונות מייצגות (איור 1). חשוב לציין כי האורגנואידים הגדולים יותר הנצפים בבידוד העיקרי המנוח היו בקלות התפרקה לתוך שברים קטנים יותר במהלך ערבוב של אורגנואידים עם BME קר קרח, כפי שמתואר בשלב 2.13.

כדי להדגים את התוצאה של פרוטוקול פרמקואוטיקים, הכנו תאים בודדים מן הנציג הוקם והולך וגדל במהירות PDAC אורגאיד כפי שמתואר בפרוטוקול זה. 1,000 תאים קיימא היו מצופה בכל טוב ומותר להתאושש מעל 24 שעות לפני סוכני כימותרפיות ציטוטוקסיים, Gemcitabine ו Paclitaxel, היו מסומנת. ביצעו מינון של 9 נקודות במינון תגובה בטרילקאט החל במינון נמוך של 100 pM ומסתיימת עם מנה גבוהה של 2 μM. לאחר 5 יום טיפול, התמונות הנציגים נלקחו לרכב (DMSO), 2 μM Gemcitabine, ו 2 μM Paclitaxel מטופלים בארות (איור 2). מיד לאחר שצילם את התמונות, הכדאיות התאית הוערך באמצעות שימוש בכדאיות של תאי האור מגיב ומותווים באמצעות תוכנת גרפים (איור 2).

Figure 1
איור 1: תמונות מייצגות מוצגות עבור בידוד אורגנואיד של PDAC, כמו גם לאחר המעבר הראשון. שניהם מוקדם (1 – 3 ימים) ומאוחר (7-10 ימים) נקודות זמן מוצגות כדי להמחיש צמיחה אורגאיד לאורך זמן. סרגל בקנה מידה = 200 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ניתוח תגובה למינון. שמאל ניתוח תגובה למינון מייצג שהושג באמצעות תרבות ארגונית מבוססת PDAC, עם סטיית תקן של טרילקטים המוצגים כקווי שגיאה. נכון תמונות הממחישות את האפקט בסוף הטיפול בכלי רכב (DMSO), כמו גם 2 μM Gemcitabine ו 2 μM Paclitaxel. סרגל בקנה מידה = 100 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים הנוכחיים לבידוד, הרחבה ואפיון של מטופלים שמקורם בארגון PDAC. שיעור ההצלחה הנוכחי שלנו של הקמת תרבות ארגונית הוא מעל 70%; לכן, שיטות אלה עדיין לא שלמות וצפויים לשפר ולהתפתח עם הזמן. יש להתחשב בגודל המדגם, בדומה ל-PDAC בעל cellularity-הנאופלסטית נמוכה. כתוצאה מכך, דגימות קטנות יכילו תאי גידול מעטים, ויפיקו רק קומץ של אורגנואידים. בנוסף, חולים רבים מקבלים טיפול כימותרפי ו/או מבוסס chemoradiation מבוססי לפני התערבות כירורגית15. אם הטיפול יעיל עבור מטופל מסוים, רקמת הגידול עשוי להיות נטול תאים קיימא. רכישת דגימות של מטופלים תמימים כימותרפיה מועדפת למיטוב ראשוני של שיטות אלה, אך לא תמיד ניתן לעשות זאת. מעניין גילינו כי הזמן איסכמיה בעקבות הסרת כירורגי של רקמת הגידול אינו קריטריון גדול עבור בידוד אורגאיד מוצלחת, כל עוד המדגם מעובד בתוך 24 h.

מחלת הלבלב אדנוקרצינומה היא מחלה המאופיינת על ידי תגובה desmoplastic חזקה התצהיר של מטריצה מסטרומה צפופה. בעוד אורגנואידים הם כלי מצוין לבידוד מהיר והתרחבות של תא האפיתל, המודל אינו מסכם את משתית מורכבים של PDAC. מתודולוגיות אחרות כגון החולה נגזר xenografts16 או אוויר ממשק נוזלי התרבות17 לאפשר תא סטרומה, אולם הם עשויים להיות מאתגרת כדי להרחיב במהירות. בעת בחירת מערכת מודל, החוקר צריך לשקול בזהירות את העוצמות והחולשות של כל6.

הביולוגיה הטרוגנית של מחלה זו משפיעה על הממסד האורגאידית כחלק מהמטופלים שנגזר ממנו לצמוח היטב בתנאים שלנו, ואילו אחרים איטיים יותר בהשוואה. הפרוטוקולים לעיל לתאר wnt ליגנד מצבו העשיר כדי לבודד ולהרחיב את כל המטופלים נגזר החולה, אך אחרים הראו כי גידולים מסוימים של החולה מסוגלים לצמוח בהיעדר מדיה ממוזג של wnt11,12. בדיקות נוספות יידרש כדי לקבוע אם באמצעות מגוון של תנאי מדיה משפר את הקמתה המוצלחת של אורגנואידים, כפי שהוכח לאחרונה על סרטן השחלות אורגנואידים18. הגישה הזאת מולטיפלקס מוגבלת על ידי מספר נמוך של תאים סרטניים שניתן לבודד דגימות מטופלים קטנים. בנוסף, אורגנואיד רגיל שאינו משתנה יכול לנבוע בידוד אורגאיד, במיוחד אם רקמת הגידול הוא סמוך לרקמות נורמלי9. כדי להפחית את הסיכון של זיהום אורגאיד נורמלי, דגימות רקמות גדולות יותר ניתן לחלק קטעים עצמאיים קטנים יותר באמצעות הבדלים מורפולוגיים כגון ובכן (דם גלוי) לעומת אזורים hypovascular, וגושים קשים לעומת רקמה רכה.

השיטות והפרוטוקולים המתוארים כאן הם הגישות הסטנדרטיות הנוכחיות המשמשות במעבדה שלנו לבידוד אורגנואיד, והם צריכים להיבדק ולהתאים לכל סביבת מעבדה. למשל, הדיסוציאציה האנזימטית (צעדים 2.6 עד 2.9) של רקמת הגידול חשוב במיוחד כדי למטב. הבדלים בציוד קטן (לעומת מיקסר מסובבי הסובב) יכולים להוביל לתזמון שונה באופן משמעותי עבור שלב זה. יתר על כן, הדיסוציאציה רקמות יכול להיות מכוונן על ידי הגדלת או להקטין את הריכוז של הקולגן בתערובת/Hyaluronidase. יש לנקוט בטיפול כדי לא לטפל בכל הדגימות באותו אופן. לדוגמה, במקרים מסוימים ניתן לבודד אורגנואידים מנוזל מיימת מחולים מתקדמים PDAC ללא דיסוציאציה מכנית או אנזימטית.

רצפי DNA הוא תקן זהב הנוכחי כדי לקבוע את הנוכחות או העדר של אורגנואידים הגידול כמו PDAC מונע על ידי מוטציות תכופות ב קראס, TP53, SMAD4 ו CDKN2A. ניתוח הטרנססקריפט יכול לחשוף תת הגידול שונים בעוד פרמקואוקליד יכול לחשוף המטופל ספציפי פגיעויות טיפוליות9. פרוטוקולים אלה מאפשרים לחוקרים PDAC לפתח ספרייה משלהם של מטופלים שנגזר מטופל ולפרופיל את הביולוגיה של מודלים אלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

אנו אסירי תודה על תמיכתם של מרכז הסרטן בסן דייגו מורס ביווריפוזיטורי וטכנולוגיית רקמה משותפת, חברי המעבדה Lowy, ואת המחלקה לכירורגיה בסן דייגו של ה-UC, חטיבה של אונקולוגיה כירורגית. AML נתמך בנדיבות על ידי NIH CA155620, SU2C CRUK קרן Lustgarten בסיס לסרטן הלבלב החלום פרס הקבוצה (SU2C-AACR-DT-20-16), ותורמים לקרן לרפא סרטן הלבלב.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips
12 well plates Olympus 25-106
15 ml LoBind conical tubes Eppendorf EP0030122208
15 ml tube Rotator and/or nutator
37 °C CO2 incubator
37 °C water bath
384 well plates Corning 4588 Ultra low attachment, black and optically clear
A 83-01 TOCRIS 2939
ADV DMEM ThermoFisher 12634010
Animal-Free Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15
Automated cell counter
B27 supplement ThermoFisher 17504044
Cell Recovery Solution Corning 354253 Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 °C
CellTiterGlow Promega G7570 Luminescence cell viability reagent
Chloroform Sigma C2432
Computer
CryoStor CS10 StemCELL Tech 07930 Cell Freezing Solution
Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells Trevigen 3710-001-K
DMEM ATCC 30-2002
DNase I Sigma D5025
Drug printer Tecan D300e This is the drug printer we use in our laboratory
Excel For data analysis
Extra Fine Graefe Forceps Fine Science Tools 11150-10
FBS ThermoFisher 16000044
G-418 ThermoFisher 10131035
Gastrin I (human) TOCRIS 3006
Gentle Collagenase/hyaluronidase STEMCELL Tech 7919
GlutaMAX ThermoFisher 35050061 Glutamine solution
GraphPad Prism For data analysis
HEPES ThermoFisher 15140122
Laminar flow tissue culture hood
Luminometer
L-Wnt-3A expressing cells ATCC CRL-2647
MACS Tissue Storage Solution Miltenyi biotec 130-100-008
Matrigel Matrix Corning 356230 Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced
Mr. Frosty Freezing Container ThermoFisher 5100-0001
N-Acetylcysteine Sigma A9165
Nicotinamide Sigma N0636
p1000 pipette with tips
p200 pipette with tips
PBS ThermoFisher 10010049
Penicillin/Streptomycin ThermoFisher 15630080
primocin InvivoGen ant-pm-2
Rapid-Flow Filter Units (0.2 µm) ThermoFisher 121-0020
Recombinant Human FGF-10 Peprotech 100-26
Recombinant Murine Noggin Peprotech 250-38
Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade VWR 89176-380
Tissue culture centrifuge
Tissue Culture Dishes 10 cm Olympus 25-202
TRIZol ThermoFisher 15596018 Acid Phenol solution
TrypLE Express ThermoFisher 12605010
Y-27632 Sigma Y0503
Zeocin ThermoFisher R25001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68, (1), 7-30 (2018).
  2. Khorana, A. A., Mangu, P. B., Katz, M. H. G. Potentially Curable Pancreatic Cancer: American Society of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline Update Summary. Journal of Oncology Practice. 13, (6), 388-391 (2017).
  3. Winter, J. M., et al. 1423 pancreaticoduodenectomies for pancreatic cancer: A single-institution experience. Journal of Gastrointestinal Surgery. 10, (9), 1210-1211 (2006).
  4. Von Hoff, D. D., et al. Increased survival in pancreatic cancer with nab-paclitaxel plus gemcitabine. New England Journal of Medicine. 369, (18), 1691-1703 (2013).
  5. Conroy, T., et al. FOLFIRINOX versus gemcitabine for metastatic pancreatic cancer. New England Journal of Medicine. 364, (19), 1817-1825 (2011).
  6. Baker, L. A., Tiriac, H., Clevers, H., Tuveson, D. A. Modeling pancreatic cancer with organoids. Trends in Cancer. 2, (4), 176-190 (2016).
  7. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, (7244), 262-265 (2009).
  8. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160, (1-2), 324-338 (2015).
  9. Tiriac, H., et al. Organoid Profiling Identifies Common Responders to Chemotherapy in Pancreatic Cancer. Cancer Discovery. 8, (9), 1112-1129 (2018).
  10. Tiriac, H., et al. Successful creation of pancreatic cancer organoids by means of EUS-guided fine-needle biopsy sampling for personalized cancer treatment. Gastrointestinal Endoscopy. (2018).
  11. Seino, T., et al. Human Pancreatic Tumor Organoids Reveal Loss of Stem Cell Niche Factor Dependence during Disease Progression. Cell Stem Cell. 22, (3), 454-467 (2018).
  12. Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21, (11), 1364-1371 (2015).
  13. Walsh, A. J., Castellanos, J. A., Nagathihalli, N. S., Merchant, N. B., Skala, M. C. Optical Imaging of Drug-Induced Metabolism Changes in Murine and Human Pancreatic Cancer Organoids Reveals Heterogeneous Drug Response. Pancreas. 45, (6), 863-869 (2016).
  14. Zhao, C. Wnt Reporter Activity Assay. Bio-Protocol. 4, (14), 1183 (2014).
  15. Conroy, T., et al. FOLFIRINOX or Gemcitabine as Adjuvant Therapy for Pancreatic Cancer. New England Journal of Medicine. 379, (25), 2395-2406 (2018).
  16. Jimeno, A., et al. A direct pancreatic cancer xenograft model as a platform for cancer stem cell therapeutic development. Molecular Cancer Therapeutics. 8, (2), 310-314 (2009).
  17. Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175, (7), 1972-1988 (2018).
  18. Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25, (5), 838-849 (2019).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics