Isolement et caractérisation des modèles organoïdes du bassin adénoïque du pancréas dérivé par le patient

Cancer Research

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Summary

Les cultures organoïdes dérivées du patient de l'adénocarcinome canalaire pancréatique sont un modèle tridimensionnel rapidement établi qui représentent les compartiments épithélial de cellules de tumeur avec la fidélité élevée, permettant la recherche translationnelle dans cette malignité mortelle. Ici, nous fournissons des méthodes détaillées pour établir et propager les organoïdes ainsi que pour effectuer des tests biologiques pertinents à l'aide de ces modèles.

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Tiriac, H., French, R., Lowy, A. M. Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models. J. Vis. Exp. (155), e60364, doi:10.3791/60364 (2020).

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Abstract

L'adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) est parmi les malignités les plus mortelles. Récemment, des méthodes de culture organoïde de prochaine génération permettant la modélisation tridimensionnelle (3D) de cette maladie ont été décrites. Les modèles d'organoïdes dérivés du patient (ADP) peuvent être isolés à la fois à partir de spécimens chirurgicaux ainsi que de petites biopsies et se former rapidement en culture. Fait important, les modèles organoïdes préservent les altérations génétiques pathogènes détectées dans la tumeur du patient et sont prédictifs de la réponse du patient de traitement, permettant ainsi des études translationnelles. Ici, nous fournissons des protocoles complets pour adapter le flux de travail de culture tissulaire pour étudier la 3D, la matrice incorporée, les modèles organoïdes. Nous détaillons les méthodes et les considérations pour isoler et propager les organoïdes primaires d'ACD. En outre, nous décrivons comment les médias organoïdes sur mesure sont préparés et la qualité contrôlée dans le laboratoire. Enfin, nous décrivons des essais pour la caractérisation en aval des modèles organoïdes tels que l'isolement des acides nucléiques (ADN et ARN), et le test de drogue. Il est important de fournir des considérations critiques pour la mise en œuvre de la méthodologie organoïde dans un laboratoire de recherche.

Introduction

L'adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) est une maladie mortelle caractérisée par un diagnostic tardif chez la plupart des patients, un manque de thérapies efficaces, et un faible taux de survie global de 5 ans qui reste inférieur à 10%1. Seulement 20% des patients sont diagnostiqués avec une maladie localisée appropriée pour l'intervention chirurgicale curative2,3. Les patients restants sont généralement traités avec une combinaison d'agents chimiothérapeutiques qui sont efficaces dans une minorité de patients4,5. Pour répondre à ces besoins cliniques urgents, les chercheurs travaillent activement sur des stratégies de détection précoce et le développement de thérapies plus efficaces. Pour accélérer la traduction clinique d'importantes découvertes, les scientifiques utilisent des modèles de souris génétiquement modifiés, des xénogreffes dérivées du patient, des lignées de cellules monocouches et, plus récemment, des modèles organoïdes6.

La culture organoïde épithéliale tridimensionnelle utilisant le facteur de croissance et les conditions riches de Wnt-ligand pour stimuler la prolifération des cellules progénitrices non transformées ont été décrites d'abord pour l'intestin de souris7 et ont été rapidement adaptées au tissu pancréatique humain normal8. En plus du tissu canalaire normal, la méthodologie organoïde permet l'isolement, l'expansion, et l'étude de PDAC humain8. Fait important, la méthode soutient l'établissement d'organoïdes à partir de spécimens chirurgicaux, ainsi que des biopsies fines et de l'aiguille de base, permettant aux chercheurs d'étudier toutes les étapes de la maladie9,10. Intéressant, les organoïdes patients-dérivés récapitulent les sous-types transcriptomiques bien décrits de tumeur bien décrits et peuvent permettre le développement des plates-formes de médecine de précision9,11.

Les protocoles organoïdes actuels pour PDAC permettent l'expansion réussie de plus de 70% des échantillons de patients des patients chimio-naïfs9. Ici, nous présentons les méthodes standard employées par notre laboratoire pour isoler, élargir, et caractériser les organoïdes PDAC patients-dérivés. D'autres méthodologies organoïdes de PDAC ont été décrites12,13 mais aucune comparaison de ces méthodes n'a été complètement exécutée. Comme cette technologie est relativement nouvelle et progresse rapidement, nous nous attendons à ce que ces protocoles continuent d'évoluer et de s'améliorer; cependant, les principes de la manipulation des tissus et de la culture organoïde continueront d'être utiles.

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Protocol

Toute la collecte de tissus humains à des fins de recherche a été examinée et approuvée par notre Commission d'examen interne (CRI). Tous les protocoles suivants sont exécutés dans des conditions aseptiques dans un environnement de laboratoire de culture de tissu de mammifères.

1. Préparation des médias

  1. Préparation des médias conditionnée.
    REMARQUE : Le médias organoïde pancréatique humain exige des facteurs et des éléments nutritifs abondants de croissance aussi bien que la supplémentation conditionnée de médias pour fournir la stimulation suffisante de croissance pour l'expansion d'organoïde. Les deux médiums conditionnés décrits ci-dessous sont préparés à partir de lignées cellulaires disponibles dans le commerce (voir tableau des matériaux). Pour des protocoles et des matériaux complets, veuillez consulter les sites Web des fabricants.
    1. Produire des supports conditionnés R-spondin1 selon le protocole du fabricant.
      1. Tout d'abord, étendre les cellules 293T exprimant R-spondin1 en utilisant des méthodes appropriées de sélection antibiotique (Zeocin) en présence de sérum abondant (10%). Lors de la production des médias conditionnés, retirez et lavez la sélection d'antibiotiques et le sérum de sorte qu'aucun antibiotique et sérum ne soient présents dans le support conditionné final. Il est important de noter que le support conditionné doit être stérilisé après la collecte (0,2 m) afin d'éviter la contamination croisée.
      2. Conserver les supports conditionnés aliquoted à 4 oC pour une utilisation à court terme (dans un délai de 6 mois) ou à -20 oC pour un stockage à long terme (plus de 6 mois). Les cycles de gel-dégel doivent être évités.
    2. Produire des supports conditionnés L-Wnt-3A selon le protocole du fabricant.
      1. Tout d'abord, étendre les cellules L-M(TK-) exprimant L-Wnt-3A en utilisant des méthodes appropriées de sélection antibiotique (G-418) en présence de sérum abondant (10%). Lors de la production des médias conditionnés, retirez et lavez la sélection d'antibiotiques de sorte qu'aucun antibiotique n'est présent dans le média conditionné final ; cependant, maintenir le sérum tout au long de la culture et le conditionnement. Il est important de noter que les milieux conditionnés collectés doivent être stérilisés par filtrage (0,2 m) afin d'éviter la contamination croisée.
      2. Entreposer les supports conditionnés indiqués à 4 oC pour une utilisation à court terme, ou -20 oC pour un stockage à long terme. Les cycles de gel-dégel doivent être évités.
    3. Pour le contrôle de la qualité, effectuer un essai TOPFLASH pour tester l'activité Wnt de R-spondin1 et le L-Wnt-3A support conditionné seul et en combinaison selon un protocole précédemment publié14.
  2. Préparation des médias basaux : Utilisez des supports basaux pour la préparation de supports organoïdes complets ainsi que des étapes de lavage pour le travail des organoïdes. Supplément avancé DMEM/ F-12 avec glutamine à une concentration finale de 1x, HEPES (10 mM), et pénicilline/Streptomycine (100 U/mL). Conserver les supports basaux à 4 oC.
  3. Organoïde Préparation complète des médias: Compléter le média basal avec R-spondin1 médias conditionnés à une concentration finale de 10% v/v, L-Wnt-3A médias conditionnés à une concentration finale de 50% v/v, EGF humain (50 ng/mL), FGF humain (100 ng/mL), Gastrin humain I (10 nM), Noggin de souris (100 ng/mL), A83-01 (500 nM), supplément B27 (1x), Nicotinamide (10 mM), N-acetylcysteine (1,25 mM), et Primocin (100 g/mL).
    1. Pour les isolements organoïdes primaires, les cultures organoïdes décongelées, et les cultures commençant par les cellules simples, incluent l'inhibiteur de la kinase de Rho Y-27632 à une concentration finale de 10,5 M.
    2. Préparer le support complet de l'organoïde humain sur la glace et le conserver à 4 oC pour une utilisation dans un délai d'un mois. Pour cette raison, nous recommandons une nouvelle préparation hebdomadaire des médias.

2. Isolement des organoïdes PDAC

REMARQUE : Décongeler la solution d'extrait de membrane du sous-sol (BME) (facteur de croissance réduit; voir Tableau des matériaux) sur la glace dans un environnement de 4 oC (réfrigérateur ou chambre froide) pendant au moins 12 h avant utilisation. Incuber les plaques de culture tissulaire pour la culture organoïde dans un incubateur de 37 oC pendant au moins 12 h avant l'utilisation.

  1. Recueillir et transporter un spécimen de tumeur enlevé chirurgicalement pour la recherche dans une solution de stockage tamponné pour maintenir la viabilité du tissu. Utilisez des supports basiques ou une solution de stockage de tissus disponible dans le commerce.
  2. Procéder à l'isolement des organoïdes dès que possible après avoir reçu le spécimen. Les tissus peuvent être stockés dans la solution de stockage jusqu'à 24 h après la chirurgie et encore donner des organoïdes.
  3. Une fois en laboratoire, transférer la tumeur dans un plat de culture tissulaire de 10 cm et retirer la solution de stockage.
  4. Tout en manipulant le tissu avec des forceps métalliques, hacher la tumeur avec un scalpel #10 en petits fragments de 1 mm3 ou plus petit. Les fragments plus grands prendront plus de temps à digérer; par conséquent, visent à générer des tailles homogènes de fragments de tissu. Si le tissu est déjà désagrégé ou en fragments de moins de 1 mm3, sautez cette étape.
  5. Transférer les fragments de tissu dans un tube conique de 15 ml contenant 10 ml de support basal. Mélanger en inversant le tube plusieurs fois. Centrifuger le tube à 200 x g pendant 5 min. Après la rotation, retirer soigneusement le support basal pour éviter de perdre des fragments de tissu.
  6. Au tube contenant les fragments de tissu ajouter 9 ml de support basal et 1 ml de 10x Gentle Collagenase/Hyaluronidase solution. Pour éviter l'agglutination des cellules pendant la digestion, complétez cette solution avec 20 l de 10 mg/mL DNAse I solution. Mélanger en inversant le tube plusieurs fois.
  7. Incuber la digestion enzymatique à 37 oC sur un écrou ou un rotateur. Pour un mélange adéquat pendant la digestion, les fragments de tissu doivent constamment se déplacer à travers la solution.
    REMARQUE : Le moment de cette dissociation enzymatique de la tumeur doit être déterminé empiriquement pour chaque spécimen. Une digestion réussie de la tumeur est caractérisée par la diminution de la taille des fragments de tissu jusqu'à ce qu'ils ne soient pas clairement discernables à l'œil nu. Parallèlement, l'opacité de la solution augmentera à mesure que des fragments de tissus microscopiques seront libérés.
  8. Après 30 min, retirer le tube conique de l'incubateur de 37 oC et observer. Si les fragments de tissu sont encore clairement visibles, continuez la dissociation à 37 oC avec un mélange constant. Répétez cette observation toutes les 30 min jusqu'à ce que la plupart ou tous les fragments de tissu ont été dissociés. Selon la rigueur du mélange ainsi que la taille et la quantité de fragments tumoraux, cette étape peut prendre aussi peu que 30 min pour les petits spécimens ou aussi longtemps que 12 h pour les échantillons de tumeurs plus grandes.
  9. Une fois la dissociation enzymatique terminée, centrifuger le tube à 200 x g pendant 5 min. Après la rotation, une pastille cellulaire doit être visible et le supernatant doit être clair, ce qui indique que toutes les cellules ont été filées hors de la solution. Si ce n'est pas le cas, répétez le spin.
  10. Retirez soigneusement le supernatant pour éviter de perdre le granule cellulaire. Laver immédiatement les cellules avec un support basal de 10 ml en mélangeant délicatement les tubes avec l'inversion. Centrifuger le tube à 200 x g pendant 5 min. Retirez soigneusement le support basal pour éviter de perdre des cellules et répétez cette étape de lavage une fois de plus pour un total de deux lavages.
  11. Après le deuxième lavage, retirer soigneusement tous les supports basaux et placer le tube sur la glace pendant 5 min.
  12. À ce moment-là, placez un aliquot d'organoïde complètement dans un bain d'eau de 37 oC pour se réchauffer.
  13. Mélanger le granule de cellules avec de la glace bME froid tout en maintenant le tube sur la glace. La densité d'ensemencement devrait être élevée pour l'isolement organoïde. Pour une petite pastille (volume de 50 l) utilisez 200 L de BME, tandis que pour un gros granule (volume de 200 l) utilisez 800 l de BME. Mélanger les cellules et le BME sur la glace à l'aide d'une pipette p200 jusqu'à ce que la solution semble homogène tout en évitant de créer des bulles dans la solution.
  14. Repérez un dôme de 100 l au centre d'un puits d'une plaque de puits préréchauffée de 12 à l'aide d'une pipette p200. Répétez cette opération jusqu'à ce que toutes les solutions BME aient été distribuées. Transférer délicatement la plaque dans l'incubateur de 37 oC pour permettre au gel BME de se solidifier.
  15. Après 10 min, récupérer la plaque et ajouter 1 ml de support complet d'organoïde préréchauffé par puits. Distribuez les supports sur le côté du puits pour éviter les perturbations du dôme BME.
  16. Observez les fragments de cellules à l'aide d'un microscope de culture tissulaire inversé à l'aide d'une lentille 4x dans brightfield.
    REMARQUE : Les cellules simples et les fragments de tissu microscopique doivent être clairement visibles. Un isolement réussi est caractérisé par l'apparition de plus de 10 organoïdes après 24-48 h ; la culture devrait être confluentdanse dans une semaine. Comme les spécimens tumoraux sont hétérogènes, certains isolements organoïdes sont plus difficiles que seulement quelques organoïdes se développent par puits, comme le montre la figure 1. Dans ce cas, permettre à la culture de continuer jusqu'à deux semaines pour maximiser le nombre de cellules disponibles pour le passaging. Pour tenir compte de la consommation des médias et de l'évaporation pendant la culture, complétez les cultures avec 200 l de médias complets organoïdes pré-chauffés tous les 5 jours.

3. Passaging des organoïdes PDAC

  1. Récupérer la plaque de l'incubateur de culture tissulaire. À l'autre de l'élévateur cellulaire stérile, soulevez doucement le dôme BME de telle sorte qu'il flotte dans le support complet. Évitez de gratter le fond du puits afin de ne pas enlever les cellules monocouches attachées au plastique, car ce sont généralement des fibroblastes.
  2. À l'eau, transférer soigneusement le dôme et le support BME sur un tube conique de 15 ml. Répétez cette étape pour chaque puits contenant des organoïdes.
  3. Laver délicatement chaque puits récolté avec 1 ml de support basal froid, et transférer dans le tube de 15 ml contenant les organoïdes.
  4. Mélanger soigneusement la solution et les organoïdes avec une pipette p1000 et faire tourner à 200 x g pendant 5 min. Après la rotation, une couche de BME contenant des organoïdes en suspension et une pastille organoïde apparaîtra au fond du tube. Retirez soigneusement le supernatant, en évitant la perte de la couche BME/organoïde. Placer le tube sur la glace.
  5. Ajouter 10 ml de solution de récupération des cellules glacées (CRS) au tube et bien mélanger par inversion. Cela dépolymérisera les matrices protéiques du BME gélifié à 4 oC. Incuber sur la glace pendant 30 min tout en mélangeant toutes les 3 min par inversion. Si disponible, placez le tube sur un mélangeur rotatif dans une chambre froide ou un réfrigérateur de 4 oC pendant 30 min.
  6. Après l'incubation de 30 min, faire tourner à 200 x g pendant 5 min. La pastille organoïde doit être apparente tandis que la couche BME doit être partie. Si la couche de BME est diminuée en taille mais toujours visible, incubez pendant 30 min supplémentaires à 4 oC avec le mélange et la rotation répétée.
  7. Une fois que le BME a été dépolymérisé, retirez le CRS en laissant derrière lui la pastille organoïde. Laver les organoïdes avec un support basal de 10 ml en mélangeant avec l'inversion. Faire tourner à 200 x g pendant 5 min et retirer le supernatant. Placer le tube avec le granule d'organoïde sur la glace pendant au moins 5 minutes.
  8. Optionnellement, si une seule préparation de cellules est désirée, incubez les organoïdes avec la trypsine de 3 ml complétée par la solution de 30 'L de 10 mg/mL d'ADNI pour éviter l'agglutinage des cellules pendant la digestion.
    1. Incuber la réaction enzymatique à 37 oC avec une inversion douce mélangeant toutes les 2 min pendant jusqu'à 10 min. Surveiller et confirmer la dissociation à cellule unique réussie sous microscope brightfield.
    2. Pour arrêter la réaction enzymatique, ajouter 10 ml de glace froide de la presse basale et tourner vers le bas à 200 x g pendant 5 min.
    3. Laver les cellules avec un support basal de 10 ml en mélangeant avec une légère inversion. Faites tourner à 200 x g pendant 5 min et retirez le supernatant et répétez le lavage une fois de plus. Placer le tube avec le granule de cellules sur la glace pendant au moins 5 minutes.
      REMARQUE : Nous recommandons d'effectuer cette étape tous les 3-5 passages pendant l'entretien régulier des organoïdes pour générer la culture homogène avec un grand nombre d'organoïdes.
  9. Ajouter le BME glacé à la pastille cellulaire et mélanger délicatement sur la glace jusqu'à ce que la solution soit homogène à l'aide d'une pipette p200. Tout en évitant de générer des bulles dans le mélange, pipette de haut en bas au moins 5-10x, en plaçant la pointe de la pipette près du fond du tube pour aider à briser mécaniquement les organoïdes. À titre indicatif, utilisez 4 à 6 fois le volume de la pastille BME/cellule de sorte que le rapport de fractionnement ne soit pas supérieur à 1:2 d'un passage à l'autre.
  10. Repérez un dôme de 100 l au centre d'un puits d'une plaque de puits préréchauffée de 12 à l'aide d'une pipette p200; répéter jusqu'à ce que toute la solution BME ait été distribuée. Transférer délicatement la plaque dans l'incubateur de 37 oC pour permettre au gel BME de se solidifier. Après 10 min, récupérer la plaque et ajouter 1 ml de support complet d'organoïde préréchauffé par puits. Distribuez les supports sur le côté du puits pour éviter les perturbations du dôme BME.
  11. Les organoïdes devraient se réformer et commencer à croître dans les 24 h. Les cultures organoïdes sont généralement passages de 7 à 10 jours selon la densité de culture et la prolifération cellulaire. Si nécessaire, complétez les cultures avec 200 l de médias complets organoïdes préréchauffés tous les 5 jours pour compenser l'épuisement et l'évaporation du facteur de croissance.

4. Congélation et dégel des organoïdes PDAC

  1. Pour congeler les organoïdes, procéder à la récolte des organoïdes et dépolymériser le BME tel que décrit dans les étapes 3.1-3.7.
  2. À la pastille cellulaire, ajouter 1 ml de support de congélation, mélanger délicatement et transférer le mélange dans un cryovial préétiqueté.
  3. Placer le cryovial dans un contenant de congélation pour maintenir une baisse de température constante sécuritaire et placer dans un congélateur de -80 oC. Après 24 à 48 h, transférer les flacons congelés dans le stockage de l'azote liquide. Les organoïdes peuvent être cryoconservés pendant des mois à des années en utilisant cette méthode.
  4. Pour décongeler les organoïdes, récupérer le cryovial congelé du stockage de l'azote liquide. Transportez le flacon congelé sur de la glace sèche jusqu'à la salle de culture tissulaire.
  5. Placer le cryovial congelé dans le bain d'eau de 37 oC pour décongeler rapidement les organoïdes et transférer le contenu du flacon dans un tube conique de 15 ml contenant 9 ml de support basal réchauffé à température ambiante.
  6. Faire tourner à 200 x g pendant 5 min et retirer le supernatant. Placer le tube avec le granule d'organoïde sur la glace pendant au moins 5 minutes.
  7. Procédez à la suspension dans BME et plaquez les organoïdes comme décrit dans les étapes 3.9-3.11.
    REMARQUE : Les cultures organoïdes se rétablissent lentement après un cycle de gel/dégel, donc les cultures peuvent être cultivées jusqu'à deux semaines avant de passer.

5. Caractérisation des organoïdes PDAC

REMARQUE : La caractérisation des organoïdes devrait être exécutée sur une culture établie après plusieurs passages pour diminuer le risque de contamination des types non épithélial de cellules tels que des fibroblastes et des cellules immunitaires.

  1. Extraction d'acide nucléique à partir d'organoïdes PDAC
    1. Organoïdes de plaque sur une plaque de 12 puits dédiée à l'extraction d'acide nucléique. Assiette ne pas dépasser 100 L de BME par puits. Pour un rendement adéquat de l'ADN/ARN, plaque au moins 2/4 puits par culture. Cultivez des organoïdes jusqu'à 5 jours jusqu'à ce que les cultures soient proches du confluent mais dépourvues des débris cellulaires excessifs qui s'accumulent dans les cultures à plus long terme.
    2. Récupérez la plaque de l'incubateur de 37 oC et enlevez complètement toute trace de l'organoïde complètement le support, ne laissant que le dôme BME contenant les organoïdes sur la plaque.
    3. Ajouter 900 l de réagent de phénol acide (voir Tableau des matériaux)à chaque puits et bien mélanger à l'aide d'une pipette p1000 jusqu'à ce que la solution devienne homogène. Le BME sera complètement dissous dans le réactif acide de phénol et les organoïdes lyseront après une courte incubation de 5 minutes.
      CAUTION: Le phénol acide est un produit chimique dangereux qui peut causer des brûlures chimiques. Manipuler avec soin en utilisant des protections et des techniques appropriées.
    4. Transférer la solution homogène dans un tube de 2 ml et ajouter 200 l de chloroforme. Incuber 5 min et centrifugeuse à 12 000 x g pendant 15 min à 4 oC.
    5. Procéder à l'extraction de l'ARN et de l'ADN selon le protocole du fabricant. L'ARN peut être extrait de la phase aqueuse tandis que l'ADN peut être extrait de la phase interphase et organique. Une fois purifiés et quantifiés, l'ARN et l'ADN isolés de différents puits d'une même culture peuvent être mis en commun pour augmenter le rendement.
      REMARQUE: (1) Bien que nous recommandons fortement d'utiliser cette méthode d'extraction d'acide nucléique pour l'ARN, il existe de nombreuses bonnes méthodes pour isoler l'ADN des cellules cultivées. (2) Pour vérifier la présence de cellules tumorales dans la culture organoïde, nous recommandons de séquencer l'ADN en utilisant votre méthode de séquençage de prochaine génération préférée pour identifier les mutations dans les gènes de marque PDAC (KRAS, TP53, SMAD4, CDKN2A).
  2. Pharmacotypage des organoïdes PDAC
    1. Isoler les cellules uniques des organoïdes comme décrit ci-dessus dans les étapes 3.1-3.8. Pour maximiser le nombre de cellules, récoltez au moins 10 puits de confluents d'une plaque de 12 puits
    2. Resuspendre les cellules simples dans 1 ml de l'organoïde humain de plein savant s'enlis. La présence de petits amas de cellules (cellules de 2 à 10 cellules) est acceptable, mais les amas cellulaires plus gros auront une incidence négative sur l'analyse en aval.
    3. Compter les cellules à l'aide d'un compteur cellulaire automatisé et enregistrer la viabilité des cellules. Calculez le nombre total de cellules et de cellules viables présentes dans la suspension de 1 ml.
    4. Pour les tests thérapeutiques, plaque 1000 cellules viables par puits d'une plaque de puits 384. Pour une plaque de puits de 384, nous estimons que nous utiliserons 400 000 cellules viables (calculées pour 400 puits).
    5. Préparer les cellules pour le placage en mélangeant sur la glace 800 'L de BME avec 7,2 ml de médias organoïdes complets contenant les cellules. Conserver le mélange sur la glace et la plaque 20 l par puits d'une assiette de puits de 384. Utilisez une pipette à 12 canaux et un réservoir conservésur de la glace pour plaquer efficacement les cellules. Pour éviter l'évaporation excessive de la plaque, les puits extérieurs peuvent être utilisés comme réservoir (60 L de PBS ou d'eau par puits), mais cela entraînera une perte de 76 puits expérimentaux.
    6. Faire tourner la plaque à 100 x g pendant 1 min dans un seau à balançoire. Cela permet au petit volume de 20 L et aux organoïdes de s'installer au fond de la plaque.
    7. Placer la plaque dans l'incubateur de culture tissulaire de 37 oC pour permettre aux organoïdes de se former. Après 24 h, vérifiez la présence des organoïdes utilisant un microscope de brightfield.
    8. Procédez à l'administration de composés thérapeutiques dissous dans d'un DMSO sur la plaque à l'aide d'une imprimante médicamenteuse ou d'un instrument équivalent. Testez chaque dose de médicament dans au moins les puits tripler. Pour effectuer une analyse efficace dose-réponse, déterminer la plage de dose pour chaque médicament empiriquement, en commençant par une dose faible, inefficace, et se terminant par une dose élevée où l'effet maximal est observé. Des exemples de gammes de dose pour les composés chimiothérapeutiques ont été récemment publiés9.
    9. Exposez les cellules aux composés thérapeutiques pendant 3 à 5 jours.
    10. Optionnellement, à la fin de l'essai, imagez la plaque pour évaluer l'effet thérapeutique sur la taille, le nombre et la morphologie d'organoïdes.
    11. Évaluer la viabilité à l'aide de 20 L par puits de réagent de viabilité des cellules de luminescence (voir tableau des matériaux) selon le protocole du fabricant. Un luminomètre sera nécessaire pour l'acquisition de données et un logiciel de graphique pour l'analyse des données.

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Representative Results

Pour illustrer les défis liés aux organoïdes isolants de PDAC, nous montrons l'établissement d'une culture organoïde dérivée patiente d'un petit échantillon hypocellulaire de tumeur. Après le placage initial, seuls quelques organoïdes étaient visibles par puits, comme le montre la figure 1. Les organoïdes ont été autorisés à s'agrandir au cours de la durée de 2 semaines et ont été adoptés selon notre protocole pour établir une culture plus robuste, comme le montre le passage précoce et tardif 1 images représentatives (Figure 1). Il est important de noter que les plus grands organoïdes kystiques observés dans l'isolat primaire tardif ont été facilement décomposés en petits fragments pendant le mélange des organoïdes avec le BME glacé, comme décrit à l'étape 2.13.

Pour démontrer les résultats du protocole de pharmacotypage, nous avons préparé des cellules simples à partir d'un organoïde PDAC représentatif établi et à croissance rapide tel que décrit dans ce protocole. 1 000 cellules viables ont été plaquées par puits et ont permis de récupérer plus de 24 h avant que les agents chimiothérapeutiques cytotoxiques, Gemcitabine et Paclitaxel, ne soient dosés. Nous avons effectué un récarcidement de 9 points dans le triplicate en commençant par une faible dose de 100 pM et se terminant par une dose élevée de 2 M. Après 5 jours de traitement, des photos représentatives ont été prises pour le véhicule (DMSO), 2 M Gemcitabine, et 2 puits traités Paclitaxel(figure 2). Immédiatement après avoir pris les photos, la viabilité cellulaire a été évaluée à l'aide d'un réactif de viabilité des cellules de luminescence et tracée à l'aide d'un logiciel de graphique (figure 2).

Figure 1
Figure 1 : Des images représentatives sont montrées pour un isolement organoïde pDAC ainsi qu'après le premier passage. Les points de temps précoces (1 à 3 jours) et tardifs (7 à 10 jours) illustrent la croissance des organoïdes au fil du temps. Barre d'échelle de 200 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Analyse de la réponse à la dose. (Gauche) Analyse représentative de réponse de dose obtenue utilisant une culture organoïde établie de PDAC, avec l'écart standard des triplicates montrés comme barres d'erreur. (Droite) Photos illustrant l'effet à la fin de l'examen du véhicule (DMSO) ainsi que 2 M Gemcitabine et 2 M Paclitaxel. Barre d'échelle de 100 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Ici, nous présentons des protocoles actuels pour isoler, élargir et caractériser les organoïdes PDAC dérivés du patient. Notre taux de réussite actuel d'établir la culture organoïde est plus de 70% ; par conséquent, ces méthodes n'ont pas encore été perfectionnés et devraient s'améliorer et évoluer au fil du temps. Une considération importante devrait être accordée à la taille de l'échantillon, car pDAC a une faible cellularité néoplastique. Par conséquent, les petits spécimens contiendront peu de cellules tumorales et ne généreront qu'une poignée d'organoïdes. En outre, beaucoup de patients reçoivent la chimiothérapie et/ou le traitement neoadjuvant chimioradiation-basé avant l'intervention chirurgicale15. Si le traitement est efficace pour un patient particulier, le tissu tumoral peut être dépourvu de cellules viables. L'acquisition d'échantillons de patients chimio-naïfs est préférable pour l'optimisation initiale de ces méthodes, mais ce n'est pas toujours possible. Fait intéressant, nous avons constaté que le temps d'ischémie suivant l'ablation chirurgicale du tissu de tumeur n'est pas un critère principal pour l'isolement organoïde réussi, tant que l'échantillon est traité dans un délai de 24 h.

L'adénocarcinome canalaire pancréatique est une maladie caractérisée par une forte réaction desmoplastique et le dépôt d'une matrice stromal dense. Alors que les organoïdes sont un excellent outil pour l'isolement rapide et l'expansion du compartiment épithélial, le modèle ne récapitule pas le stroma complexe de PDAC. D'autres méthodologies telles que les xénogreffes dérivées du patient16 ou la culture d'interface liquided'air 17 permettent un compartiment stromal, cependant ils peuvent être difficiles à développer rapidement. Lors du choix d'un système modèle, le chercheur doit examiner attentivement les forces et les faiblesses de chaque6.

La biologie hétérogène de cette maladie affecte l'établissement organoïde pendant que quelques organoïdes patient-dérivés se développent extrêmement bien dans nos conditions tandis que d'autres sont beaucoup plus lents par comparaison. Les protocoles ci-dessus décrivent une condition riche en ligand Wnt pour isoler et étendre tous les organoïdes dérivés du patient, mais d'autres ont montré que les tumeurs de certains patients sont capables de se développer en l'absence de Wnt conditionné médias11,12. D'autres tests seront nécessaires pour déterminer si l'utilisation d'une gamme de conditions médiatiques améliore l'établissement réussi des organoïdes, comme cela a été récemment démontré pour les organoïdes du cancer de l'ovaire18. Cette approche multiplexe est cependant limitée par le faible nombre de cellules tumorales qui peuvent être isolées à partir de petits échantillons de patients. En outre, les organoïdes canalaires non transformés normaux peuvent résulter d'un isolement organoïde, particulièrement si le tissu tumoral est adjacent au tissu normal9. Pour réduire le risque de contamination normale des organoïdes, de plus grands échantillons de tissu peuvent être subdivisés en plus petits fragments indépendants utilisant des différences morphologiques telles que bien vascularisé (le sang est visible) contre les régions hypovasculaires, et les nodules durs contre les tissus mous.

Les méthodes et protocoles décrits ici sont les approches standard actuelles utilisées dans notre laboratoire pour l'isolement des organoïdes et elles doivent être testées et adaptées à chaque environnement de laboratoire. Par exemple, la dissociation enzymatique (étapes 2.6 à 2.9) du tissu tumoral est particulièrement importante pour optimiser. Les petites différences d'équipement (nutator vs mélangeur de rotateur) peuvent mener à la synchronisation sensiblement différente pour cette étape. En outre, la dissociation des tissus peut être affinée en augmentant ou en réduisant la concentration du mélange Collagène/Hyaluronidase. Il faut prendre soin de ne pas traiter tous les échantillons de la même manière. Par exemple, dans certains cas, les organoïdes peuvent être isolés à partir de liquide ascites de patients avancés PDAC sans dissociation mécanique ou enzymatique.

Le séquençage de l'ADN est l'étalon-or actuel pour déterminer la présence ou l'absence d'organoïdes tumoraux car le PDAC est entraîné par des mutations fréquentes dans KRAS, TP53, SMAD4 et CDKN2A. L'analyse transcriptomique peut révéler différents sous-types de tumeur tandis que le pharmacotypage peut découvrir des vulnérabilités thérapeutiques spécifiques au patient9. Ces protocoles permettent aux chercheurs de l'ACDP de développer leur propre bibliothèque d'organoïdes dérivés du patient et de dresser le profil de la biologie de ces modèles.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Nous sommes reconnaissants pour le soutien de l'UC San Diego Moores Cancer Center Biorepository and Tissue Technology Shared Resource, les membres du laboratoire Lowy, et le DÉPARTEMENT de chirurgie de l'UC San Diego, Division of Surgical Oncology. AML est généreusement soutenu par NIH CA155620, un SU2C CRUK Lustgarten Foundation Pancreatic Cancer Dream Team Award (SU2C-AACR-DT-20-16), et les donateurs au Fonds pour guérir le cancer du pancréas.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips
12 well plates Olympus 25-106
15 ml LoBind conical tubes Eppendorf EP0030122208
15 ml tube Rotator and/or nutator
37 °C CO2 incubator
37 °C water bath
384 well plates Corning 4588 Ultra low attachment, black and optically clear
A 83-01 TOCRIS 2939
ADV DMEM ThermoFisher 12634010
Animal-Free Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15
Automated cell counter
B27 supplement ThermoFisher 17504044
Cell Recovery Solution Corning 354253 Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 °C
CellTiterGlow Promega G7570 Luminescence cell viability reagent
Chloroform Sigma C2432
Computer
CryoStor CS10 StemCELL Tech 07930 Cell Freezing Solution
Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells Trevigen 3710-001-K
DMEM ATCC 30-2002
DNase I Sigma D5025
Drug printer Tecan D300e This is the drug printer we use in our laboratory
Excel For data analysis
Extra Fine Graefe Forceps Fine Science Tools 11150-10
FBS ThermoFisher 16000044
G-418 ThermoFisher 10131035
Gastrin I (human) TOCRIS 3006
Gentle Collagenase/hyaluronidase STEMCELL Tech 7919
GlutaMAX ThermoFisher 35050061 Glutamine solution
GraphPad Prism For data analysis
HEPES ThermoFisher 15140122
Laminar flow tissue culture hood
Luminometer
L-Wnt-3A expressing cells ATCC CRL-2647
MACS Tissue Storage Solution Miltenyi biotec 130-100-008
Matrigel Matrix Corning 356230 Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced
Mr. Frosty Freezing Container ThermoFisher 5100-0001
N-Acetylcysteine Sigma A9165
Nicotinamide Sigma N0636
p1000 pipette with tips
p200 pipette with tips
PBS ThermoFisher 10010049
Penicillin/Streptomycin ThermoFisher 15630080
primocin InvivoGen ant-pm-2
Rapid-Flow Filter Units (0.2 µm) ThermoFisher 121-0020
Recombinant Human FGF-10 Peprotech 100-26
Recombinant Murine Noggin Peprotech 250-38
Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade VWR 89176-380
Tissue culture centrifuge
Tissue Culture Dishes 10 cm Olympus 25-202
TRIZol ThermoFisher 15596018 Acid Phenol solution
TrypLE Express ThermoFisher 12605010
Y-27632 Sigma Y0503
Zeocin ThermoFisher R25001

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References

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