सिंगल-सेल ड्रग तेज, मेटाबोलिज्म और इफेक्ट्स का अध्ययन करने के लिए एक एकीकृत रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्लेटफॉर्म

Biochemistry
 

Summary

यह प्रोटोकॉल एक एकीकृत रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) मंच प्रस्तुत करता है जो एकल-सेल संकल्प प्राप्त करने में सक्षम है। रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग दवाओं के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, जबकि एमएस का उपयोग दवा तेज और चयापचय के लक्षित और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए किया जा सकता है।

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Ali, A., Abouleila, Y., Germond, A. An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects. J. Vis. Exp. (155), e60449, doi:10.3791/60449 (2020).

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Abstract

कोशिकाओं को दवाओं के प्रति उनकी प्रतिक्रियाओं में स्वाभाविक रूप से विषम माना जाता है। इसलिए, यह आवश्यक है कि एकल कोशिका विषमता दवा खोज अध्ययन में हिसाब है। यह एकल-कोशिका स्तर (यानी, दवा तेज, चयापचय और प्रभाव) पर कोशिका और दवा के बीच सेलुलर बातचीत की अधिकता को सही ढंग से मापने से प्राप्त किया जा सकता है। यह पेपर दवाओं के जवाब में कोशिकाओं के मेटाबोलिक बदलावों की निगरानी के लिए एक एकल सेल रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) मंच का वर्णन करता है। इस प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग करके, दवा के जवाब में मेटाबोलिक परिवर्तन ों को रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मापा जा सकता है, जबकि दवा और इसके मेटाबोलाइट को एक ही सेल में बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। परिणाम बताते हैं कि एकल-कोशिका स्तर पर दवा तेज, चयापचय और प्रतिक्रिया के बारे में जानकारी तक पहुंचना संभव है।

Introduction

कोशिकाएं एकल-कोशिका स्तर पर अपने माइक्रोएनवायरमेंट में परिवर्तन के लिए अलग तरह से प्रतिक्रिया करती हैं, एक घटना जिसे सेलुलर विषमता1कहा जाता है। इसके बावजूद, वर्तमान दवा खोज अध्ययन सेल आबादी के औसत माप पर आधारित हैं, जो संभावित उपआबादी के साथ-साथ एकल-सेल विविधताओं2के बारे में जानकारी को अस्पष्ट करते हैं। यह लापता जानकारी समझा जा सकता है क्यों कुछ कोशिकाओं दवाओं के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, जबकि दूसरों को प्रतिरोधी हैं । दिलचस्प बात यह है कि दवा प्रतिक्रिया के बारे में एकल सेल जानकारी की कमी दवाओं के द्वितीय चरण के नैदानिक परीक्षणों की विफलता के लिए एक संभावित कारण है3। इसलिए, इस समस्या को हल करने के लिए, दवा (यानी, तेज, चयापचय और प्रतिक्रिया) के साथ सेलुलर बातचीत को एकल-कोशिका स्तर पर मापा जाना चाहिए।

इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, हमने एक अनूठी प्रणाली तैयार की है जिसमें जीवित एकल कोशिकाओं को लेबल-फ्री रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके जांच की जाती है, फिर बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री4का उपयोग करके आगे की विशेषता है। रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी सेलुलर राज्य का आणविक फिंगरप्रिंट प्रदान करता है, जो कोशिका के अंदर कई अणुओं के योगदान के परिणामस्वरूप एक जटिल स्पेक्ट्रम है । इस जटिलता के बावजूद, यह माना जा सकता है कि रमन उंगलियों के निशान एक पूरी कोशिका की संरचना और चयापचय5,6को प्रतिबिंबित करते हैं । रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी एक गैर-आक्रामक और अपेक्षाकृत उच्च थ्रूपुट तरीके से सेलुलर राज्यों को मापने में उत्कृष्टता प्राप्त करता है, जो इसे एकल-कोशिका स्तर पर दवा प्रतिक्रिया की स्क्रीनिंग और आकलन के लिए उपयोगी बनाता है।

इसके विपरीत, एमएस एकल सेल स्तर पर दवा तेज को मापने के लिए आवश्यक संवेदनशीलता और चयनात्मकता प्रदान करता है। चूंकि एमएस विनाशकारी है (नमूना [सेल] आमतौर पर विश्लेषण के दौरान भस्म हो जाता है), इसे गैर-विनाशकारी के साथ एकीकृत करता है, लेबल-मुक्त रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी एक उच्च थ्रूपुट और संवेदनशील प्रणाली प्रदान कर सकता है। यह संयुक्त मंच एकल-कोशिका स्तर पर दवा तेज, चयापचय और प्रभावों के बारे में अधिक जानकारी प्रदान करने में सक्षम है।

यह पांडुलिपि एक एकीकृत रमन-एमएस मंच का उपयोग करके इन विट्रो संस्कृतियों का उपयोग करके एकल-सेल स्तर पर दवाओं के साथ सेलुलर बातचीत का अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल को स्पष्ट करती है। ऐसा करने के लिए, हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा कोशिकाओं (हेपग्2) और टैमोक्सिफेन का उपयोग मॉडल के रूप में किया जाता है। हेपग्2 कोशिकाओं को चुना गया क्योंकि वे टैमोक्सिफेन लेते हैं और दवा को चयापचय करते हैं, और वे इसके हेपेटोटॉक्सिक प्रभावों के कारण एक साथ प्रभावित होते हैं। इस पांडुलिपि में दो राज्यों का उपयोग किया जाता है: दवा-इलाज कोशिकाएं बनाम गैर-इलाज कोशिकाएं (नियंत्रण)।

Protocol

1. सेल संस्कृति

  1. एक उपयुक्त संस्कृति मीडिया में रुचि की संस्कृति कोशिकाओं । प्रदूषण से बचने के लिए पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन जोड़ा जा सकता है। हेपग्2 कोशिकाओं के मामले में, Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) युक्त संस्कृति मीडिया में संस्कृति कोशिकाओं 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और ०.१% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक । रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी मापको फेसियल करने के लिए, कोशिकाओं को 0.1% जिलेटिन-लेपित ग्लास-बॉटम डिश या क्वार्ट्ज स्लाइड पर उगाया जा सकता है।
  2. 2 दिनों के लिए इनक्यूबेट कोशिकाएं 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 में आर्द्र इनक्यूबेटर में।
  3. 70% कन्फ्ल्युचर तक पहुंचने के लिए सेल संस्कृतियों को सिंक्रोनाइज करें।
  4. एक 35 मिमी ग्लास-बॉटम ग्रिड डिश या क्वार्ट्ज स्लाइड में उपसंस्कृति कोशिकाएं 0.7 x 106के सीडिंग घनत्व पर एक ही माध्यम का उपयोग करती हैं, फिर 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करती हैं।
    नोट: संस्कृति व्यंजन या स्लाइड 5 ug/cm2 के संस्कृति सतह अनुपात के साथ कोलेजन या जिलेटिन कोटिंग समाधान के साथ पूर्व लेपित किया जा सकता है ताकि उन्हें ठीक करने की अनुमति मिल सके, माप के दौरान उनके अस्तित्व को सुनिश्चित किया जा सके ।

2. दवा उपचार

  1. इनक्यूबेटर से सेल संस्कृतियों को हटा दें और प्रीवार्म्ड पीबीएस बफर (37 डिग्री सेल्सियस) के साथ 2x धोएं।
    नोट: 50%-60% की एक प्रवाह पर दवा उपचार के लिए कोशिकाओं को हटाने के लिए इष्टतम है।
  2. 35 मिमी संस्कृति व्यंजनों में दवा-इलाज और अनुपचारित उपसमूहों में कोशिकाओं को विभाजित करें।
  3. संस्कृति मीडिया के साथ पसंद की दवा मिलाएं। उदाहरण के लिए, डायमेथिल सल्फासऑक्साइड (डीएमएसओ) में टैमोक्सिफेन को भंग करें और 10 माइक्रोन की 2 मिलीभगत और टैमोक्सिफेन एकाग्रता प्राप्त करने के लिए संस्कृति मीडिया के साथ मिलाएं। यह दवा का इलाज करने वाला समूह होगा।
  4. डीएमएसओ के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए नियंत्रण के रूप में सॉल्वेंट (डीएमएसओ) की इसी मात्रा को माध्यम में मिलाएं। यह कंट्रोल ग्रुप होगा।
  5. 24 घंटे के लिए कदम 2.3-2.4 में तैयार नुकीला मीडिया के 2 mL में दोनों समूहों Incubate । ऊष्मायन के बाद अपेक्षित संवन 70%-80% होना चाहिए।

3. रमन स्पेक्ट्रल इमेजिंग और स्पेक्ट्रल प्रोसेसिंग

नोट: हालांकि रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी सिस्टम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, यहां इस्तेमाल किया रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी सिस्टम एक घर का निर्माण लाइन स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोप पहले7,8वर्णित है । संक्षेप में, यह प्रणाली 532 एनएम डायोड पंप ठोस-राज्य लेजर से लैस है। लेजर लाइट एक बेलनाकार लेंस का उपयोग कर एक विमान में आकार का है, जो एक ही जोखिम में 400 स्पेक्ट्रा की माप की अनुमति देता है। रमन स्पेक्ट्रा को एक पॉलीक्रोमेटर पर चढ़कर एक ठंडा सीसीडी कैमरा का उपयोग करके रिकॉर्ड किया गया था जो फिंगरप्रिंट क्षेत्र के स्पेक्ट्रल रिज़ॉल्यूशन को अधिकतम करने के लिए 1,200 खांचे/मिमी झंझरी का उपयोग करता है (500-1,800 सेमी-1से)। इस स्पेक्ट्रल क्षेत्र में अणुओं के लिए विशिष्ट आवृत्तियों का एक उच्च घनत्व होता है जो रमन बिखरने को उत्पन्न करता है। जल विसर्जन उद्देश्य लेंस (एनए = 0.95) का भी उपयोग किया जाता है। इस प्रणाली का स्थानिक संकल्प ~ 300 एनएम है और स्पेक्ट्रल संकल्प 1 सेमी- 1है। प्रयोग के दौरान सेल अस्तित्व सुनिश्चित करने के लिए, मोटराइज्ड माइक्रोस्कोप स्टेज पर तय एक माइक्रोचैंबर का उपयोग किया जाता है।

  1. स्पेक्ट्रल माप न से पहले, प्रकाशिकी के संरेखण को सत्यापित करें। 50 माइक्रोन पिनहोल का उपयोग यह सत्यापित करने के लिए किया जा सकता है कि पिनहोल और लेजर स्थिति बिल्कुल मेल खाती है। जितना संभव हो संकुचित होने पर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर भट्ठा दर्ज करें।
  2. प्रत्येक प्रयोग से पहले स्पेक्ट्रोफोटोमीटर को कैलिब्रेट करने के लिए इथेनॉल का उपयोग करें। ऐसा करने के लिए, एक गिलास नीचे पकवान में EtOH जगह, एक दिया लेजर तीव्रता पर स्पेक्ट्रम उपाय (नमूना पर मापा) 1 एस के लिए, और ज्ञात तरंगदैर्ध्य7के लिए चोटी सहयोगी ।
  3. नमूना पर लेजर तीव्रता को कम करने के लिए ~ 2.4 mW/μm2 ताकि कोशिकाओं लेजर जोखिम जीवित रहते हैं।
  4. माइक्रोचैंबर की स्थापना 5 प्रतिशत सीओ2 और 37 डिग्री सेल्सियस पर करें।
  5. एक बार माइक्रोस्कोप सिस्टम तैयार होने के बाद, इनक्यूबेटर से कोशिकाओं को हटा दें और तुरंत गर्म पीबीएस (37 डिग्री सेल्सियस) बफर के साथ कोशिकाओं 2x को कुल्ला करें, फिर कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए गर्म पीबीएस (37 डिग्री सेल्सियस) या डीएमईएम के 2 मिलील जोड़ें।
    नोट्स: पीबीएस और फ्लोरोब्इंट डीएमईएम-आधारित मीडिया दोनों रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी मापन के लिए पर्याप्त विकल्प हैं क्योंकि वे न्यूनतम पृष्ठभूमि संकेत का उत्पादन करते हैं।
  6. पानी विसर्जन उद्देश्य लेंस पर पानी के 10 μL जोड़ें और नाजुक माइक्रोस्कोप मंच पर गिलास नीचे सेल पकवान जगह है ।
  7. लेजर लाइन को फोकस करके प्रत्येक सेल को मापें। एक स्पष्ट रमन संकेत के साथ एक सेल के एक क्रॉस-सेक्शन प्राप्त करने के लिए प्रति सेल 15 एस एक्सपोजर समय यहां पर्याप्त है। एक गैल्वानो दर्पण कई दर्जन मिनट के भीतर एक कोशिका या कोशिकाओं के समूह की स्कैनिंग की अनुमति देता है।
    नोट्स: कोशिकाओं के पूर्ण स्पेक्ट्रल इमेजिंग के उच्च संकल्प के लिए अधिक समय की आवश्यकता होती है और इससे फोटोक्षति हो सकती है। यहां, कोशिकाओं को प्रत्येक कोशिका के एक क्रॉस-सेक्शन प्राप्त करने के लिए एकल-लाइन एक्सपोजर का उपयोग करके मापा गया था। यह दृष्टिकोण थ्रूपुट को बढ़ाने और कोशिकाओं के भेदभाव के लिए पर्याप्त जानकारी प्राप्त करने के लिए एक अच्छा व्यापार-बंद है, जबकि फोटोक्षति को सीमित करके सेल व्यवहार्यता सुनिश्चित करना भी है।

4. स्पेक्ट्रल डेटा और बहुवेरिएट विश्लेषण ों की प्रीप्रोसेसिंग

नोट: स्पेक्ट्रल डेटा के भीतर अवांछित तकनीकी विविधताओं को दूर करने के लिए अतिरिक्त विश्लेषण से पहले प्रीप्रोसेसिंग एक आवश्यक कदम है। तरीकों और सॉफ्टवेयर की विविधता के कारण, एक संपूर्ण सूची प्रदान नहीं की जा सकती है, और साहित्य7,8में कई उपयोगी समीक्षाएं पाई जाती हैं। इस खंड में, हम संक्षेप में एकल कोशिकाओं को रहने से प्राप्त स्पेक्ट्रल रमन डेटा का विश्लेषण और व्याख्या करने के लिए उपयोग किए जाने वाले दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं।

  1. संभावित ब्रह्मांडीय किरण हस्तक्षेप को दूर करने के लिए रमन छवियों को निकालें और पूर्व प्रक्रिया करें।
    नोट: विभिन्न दिनों/सप्ताह/महीनों के दौरान प्राप्त स्पेक्ट्रा की स्पेक्ट्रल धुरी में इथेनॉल का उपयोग करके अंशांकन के दौरान छोटी तकनीकी विविधताओं के कारण कुछ भिन्नताएं शामिल हो सकती हैं । यह बाद के बहुवेरिएट विश्लेषणों और सांख्यिकीय तुलनाओं को दृढ़ता से प्रभावित करेगा । इस मामले में कि प्रयोग विभिन्न सप्ताहों/महीनों के दौरान किए जाते हैं, छोटे ऑप्टिकल विविधताओं की उम्मीद की जाती है । इस मामले में, डेटा को प्रयोगों में डेटा के अंतिम स्पेक्ट्रल बदलावों के लिए सही करने के लिए इंटरपोलेट किया जाना चाहिए। क्यूबिक स्प्लीन का उपयोग करके इंटरपोलेशन का उपयोग यहां किया जाता है। इस कदम के बाद सभी स्पेक्ट्रा एक्सिस का गठबंधन होना चाहिए। बाद के विश्लेषण के लिए 500-1,800 सेमी-1 की एक सीमा पर विचार किया जाता है।
  2. घर का बना एल्गोरिदम का उपयोग करके प्रत्येक छवि से कोशिकाओं और पृष्ठभूमि (कोशिकाओं की अनुपस्थिति) के स्पेक्ट्रल डेटा निकालें। सेल के सिग्नल से बैकग्राउंड सिग्नल घटाएं। फिर, शेष पिक्सेल के स्पेक्ट्रा का औसत करें, जो एक ही सेल के अनुरूप होना चाहिए। निम्नलिखित कदम कोशिकाओं के 2D स्पेक्ट्रा का उपयोग करके किए जाते हैं।
  3. ModPoly9 या किसी अन्य एल्गोरिदम का उपयोग करके एक आधारभूत सुधार करें जिसे उसने पर्याप्त रूप से फिट होने का अनुमान लगाया है। फिंगरप्रिंट क्षेत्र का चयन करने के लिए स्पेक्ट्रल रेंज को 600-1,700 सेमी-1 तक ट्रिम करें और यह सुनिश्चित करें कि खराब पॉलीनोमियल फिटिंग के कारण स्पेक्ट्रा पर कोई अवांछित किनारे प्रभाव न हो।
  4. स्पेक्ट्रल तीव्रता10को सामान्य करने के लिए वेक्टर सामान्यीकरण (प्रत्येक तरंग संख्या पर तीव्रता वैश्विक l2 मानदंड या स्पेक्ट्रम के अधिकतम विलक्षण मूल्य से विभाजित है) जैसे सामान्यीकरण कदम को करें, हालांकि अन्य सामान्यीकरण पर विचार किया जा सकता है।
  5. प्रत्येक वर्ग/शर्त के लिए उपयुक्त लेबल के साथ एक डेटासेट तैयार करें।
    नोट: तुलनात्मक स्पेक्ट्रल विश्लेषण सेल वर्ग/शर्तों के बीच संभावित मतभेदों की प्रकृति का पता लगाने के लिए किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, नियंत्रण समूह के औसत स्पेक्ट्रम को अन्य समूहों को घटाकर ब्याज के क्षेत्रों की पहचान करने के लिए [जैसे संभावित बायोमार्कर])। ANOVA और फिशर स्कोर गणना भी10किया जा सकता है ।
  6. स्पेक्ट्रल सुविधाओं के आधार पर इलाज और अनुपचारित कोशिकाओं की पहचान करने के लिए, बहुविरात विश्लेषण लागू किया जा सकता है। एक सामान्यीकृत स्पेक्ट्रल डेटा का उपयोग प्रशिक्षण डेटासेट के रूप में किया जाना चाहिए, और यदि संभव हो तो दोहराने वाले प्रयोग से एक अज्ञात डेटासेट (लेबल के बिना) का उपयोग परीक्षण डेटा के रूप में किया जाना चाहिए।
    नोट: एक प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए-डीए10)के कुछ वेक्टर पर किया गया असतत विश्लेषण, अव्यक्त स्कोर पर प्रक्षेपण, जिसके बाद डिस्करिमिनेंट विश्लेषण (पीएलएस-डीए), और समर्थन वेक्टर मशीनें (एसवीएम)11 मॉडल अक्सर क्षेत्र में उपयोग किए जाते हैं, और प्रत्येक विभिन्न सांख्यिकीय विचार प्रस्तुत करता है। डेटा की प्रीप्रोसेसिंग परिणामस्वरूप की जानी चाहिए।
  7. प्रायोगिक उद्देश्यों को फिट करने वाली मशीन लर्निंग का उपयोग करें। यहां, अव्यक्त संरचना (पीएलएस) मॉडल पर एक प्रक्षेपण रमन स्पेक्ट्रा (600-1,710 सेमी-1)11,12के स्पेक्ट्रल फिंगरप्रिंट क्षेत्र का उपयोग करके बनाया गया है। मतलब-केंद्र आवश्यक के रूप में डेटा । मॉडल के क्रॉस-सत्यापन के लिए, विभिन्न तकनीकों को लागू किया जा सकता है।
    नोट: यहां, 10 विभाजन के साथ एक वेनिस ब्लाइंड क्रॉस-सत्यापन लागू किया जाता है। मॉडल जटिलता (घटकों या अव्यक्त चर की संख्या) का परीक्षण किया जाना चाहिए ताकि सबसे अच्छा मॉडल रूट मतलब वर्ग त्रुटि (आरएमएसई) मूल्य को कम करता है। यह पाया गया कि तीन अव्यक्त वेक्टर (एलवी) ने हमारे डेटासेट के साथ सबसे अच्छा भेदभाव प्रदान किया।
  8. पहचानें कि रमन स्पेक्ट्रल चोटियों कोशिकाओं के भेदभाव में योगदान देते हैं (उदाहरण के लिए, प्रत्येक रमन तरंग संख्या या प्रतिगमन गुणांक की भयावहता के लिए प्रक्षेपण [वीआईपी] में परिवर्तनीय महत्व के स्कोर की साजिश रचकर)।
    नोट्स: एक चर के वीआईपी स्कोर की गणना पीएलएस-डीए घटकों और मूल चर के बीच चुकता सहसंबंधों की भारित राशि के रूप में की जाती है। पीएलएस और वीआईपी स्कोर एल्गोरिदम के बारे में विवरणसाहित्य 11,12में पाया जा सकता है ।

5. एकल सेल नमूना सेट-अप और प्रक्रियाएं

  1. चित्रा 1में दिखाया गया है के रूप में रमन माइक्रोस्कोप पर सेल नमूना प्रणाली को ठीक करें । 3 डी माइक्रोजोड़क को ग्लास केशिका धारक से कनेक्ट करें जो नकारात्मक दबाव(चित्रा 1)लागू करके नमूना चूसने के लिए एक खाली सिरिंज से जुड़ा हुआ है।
  2. कांच केशिका की नोक का निरीक्षण करने के लिए माइक्रोस्कोप को उच्च आवर्धन क्षेत्र (40x) में सेट करें और सुनिश्चित करें कि यह टूटा नहीं है। माइक्रोजोड़क (एक्स-, वाई-, जेड-कुल्हाड़ियों) का उपयोग करके ग्लास केशिका की स्थिति को नियंत्रित करें। सुनिश्चित करें कि केशिका टिप देखने के क्षेत्र में केंद्रित है, तो केशिका को जेड-एक्सिस पर आगे बढ़ें ताकि बाद में संस्कृति पकवान के लिए मंजूरी दे सके।
    नोट: कोशिकाओं का माइक्रोसैंपलिंग 10-15 माइक्रोन के बीच व्यास वाली कोशिकाओं के लिए ग्लास केशिका द्वारा किया जाता है। ~ 5 माइक्रोन के बोर आकार के साथ एक केशिका की सिफारिश की जाती है। यदि बोर का आकार बहुत छोटा है, तो केशिका टिप को सेल द्वारा प्लग किया जाएगा, और यदि यह बहुत बड़ा है, तो बाद में एमएस मापन की संवेदनशीलता से समझौता किया जा सकता है।
  3. माइक्रोस्कोप के चरण पर नमूना प्लेट/डिश रखें, आवर्धन और ध्यान को समायोजित करें, ग्रिड डिश पर लक्ष्य सेल का चयन करें, और इसे देखने के केंद्र में ले जाएं । फिर, ध्यान से माइक्रोजोड़क (जेड-एक्सिस) का उपयोग करके ग्लास केशिका को कम करें जब तक कि टिप ध्यान में न आए।
    नोट: सुनिश्चित करें कि एक्स में केशिका को स्थानांतरित न करें- और वाई-कुल्हाड़ी जब तक केशिका ध्यान में न हो।
  4. सूक्ष्म अवलोकन के तहत, केशिका टिप के साथ लक्ष्य एकल कोशिका को स्पर्श करें, फिर केशिका टिप के अंदर कोशिका को जाल में फंसाने के लिए सिरिंज का उपयोग करके नकारात्मक दबाव लागू करना शुरू करें। यदि आवश्यक हो तो सेल के समय और चूसा स्थान की जांच करने के लिए एक फोटो या वीडियो लेकर इस प्रक्रिया को रिकॉर्ड करें।
  5. केशिका को जेड-एक्सिस पर ऊपर ले जाएं। फिर, एमएस विश्लेषण की तैयारी में संदंश का उपयोग करके केशिका धारक से केशिका को अलग करना।

6. मास स्पेक्ट्रोमेट्री माप

  1. निर्माता की सिफारिशों के अनुसार एमएस उपकरण की सामूहिक सटीकता को कैलिब्रेट करें। अंशांकन के बाद, सुनिश्चित करें कि बड़े पैमाने पर त्रुटि 3 पीपीएम से अधिक नहीं है।
  2. एमएस इंस्ट्रूमेंट को उन मापदंडों के अनुकूल अनुकूल बनाना जो रुचि के एनालीट के लिए सबसे उपयुक्त हैं।
    नोट: टैमोक्सिफेन और 4-OHT विश्लेषण के मामले में, साधन मापदंडों को निम्नलिखित करने के लिए सेट कर रहे हैं: इनलेट केशिका तापमान: 400 डिग्री सेल्सियस, स्प्रे वोल्टेज: 1500 वी, स्वचालित लाभ नियंत्रण लक्ष्य (एजीसी): 5.00E +06, एस-लेंस आरएफ स्तर: 90%, सिम रेंज: 347-397 मीटर/z, सिम अधिकतम इंजेक्शन समय: २०० एमएस, सिम संकल्प: १४०,००० FWHM, एमएस/एमएस रेंज: 50-400 मीटर/z, एमएस/एमएस एजीसी लक्ष्य: 2.00E + 05, एमएस/एमएस अधिकतम इंजेक्शन समय: १०० एमएस, एमएस/एमएस संकल्प: १७,५०० FWHM, एमएस/एमएस अलगाव खिड़की: 1 m/z, एमएस/एमएस सामान्येड टक्कर ऊर्जा (NCE):
  3. सापेक्ष मात्रा प्राप्त करने के लिए सिम मोड के लिए 5 मिनट की अवधि के साथ एक स्वचालित अधिग्रहण विधि स्थापित करें, और दवा और उसके मेटाबोलाइट की सकारात्मक पहचान के लिए एक और एमएस/एमएस विधि। अधिग्रहण विधि के मापदंडों को चरण 6.2 में उल्लिखित अनुकूलित मूल्यों के लिए सेट किया जाना चाहिए।
  4. धूम हुड के तहत आयनीकरण सॉल्वेंट तैयार करें। सॉल्वेंट कंपीटिशन ब्याज के एनालिएट पर निर्भर करता है। यहां, उपयोग किए जाने वाले कार्बनिक सॉल्वेंट में 80% मीओएच, 10% डीएमएसओ और 0.1% फोरिक एसिड होते हैं।
  5. माप से पहले कार्बनिक विलायक के साथ एक उपयुक्त आंतरिक मानक मिलाएं। इस प्रयोग में, 5.31 एनएम डी 5-टैमोक्सिफेन का उपयोग आंतरिक मानक के रूप में किया जाता है।
  6. झूठी सकारात्मक से बचने के लिए, किसी भी सेलुलर भागों के नमूने से बचने के लिए लगातार सूक्ष्म अवलोकन के साथ 1 μm बोर आकार के केशिका का उपयोग कर दवा के साथ इलाज कोशिकाओं के साथ इलाज कोशिकाओं के आसपास के मीडिया aspirate ।
  7. लोडर युक्तियों से जुड़े पिपेट का उपयोग करके मीडिया युक्त केशिका के व्यापक अंत में आयनीकरण सॉल्वेंट के 2 माइक्रोन जोड़ें। फिर, एमएस द्वारा नमूना मीडिया का विश्लेषण करें, ब्याज के विश्लेषण की उपस्थिति की जांच करें (सामान्यतः, इसका पता लगाने योग्य नहीं होना चाहिए)।
  8. सेल युक्त केशिका में आयनीकरण सॉल्वेंट 2 माइक्रोनेशन सॉल्व करें, केशिका को एक उपयुक्त द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर से जुड़े नैनोइलेक्ट्रोस्प्रे एडाप्टर (नैनो-ईएसआई) में ठीक करें, और स्वचालित अधिग्रहण विधि शुरू करें।

7. मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा प्रोसेसिंग और विश्लेषण

नोट: डेटा विश्लेषण करने के लिए किसी भी उपयुक्त सॉफ़्टवेयर का उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, यदि शोधकर्ता एमएस विक्रेता द्वारा प्रदान नहीं किए जाने वाले सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके डेटा विश्लेषण करना चाहते हैं, तो कच्चे डेटा को मालिकाना विक्रेता प्रारूप से खुले प्रारूप में या पहले एक पाठ फ़ाइल के रूप में परिवर्तित किया जाना चाहिए (जो यहां किया गया था)।

  1. एक ही एमएस स्कैन से आंतरिक मानक के द्वारा ब्याज के विश्लेषण के चरम क्षेत्र (एस) को विभाजित करके डेटा को सामान्य करें। फिर, तिरछापन को कम करने के लिए चोटी अनुपात को बदलदें।
  2. एकल कोशिकाओं में वितरण की कल्पना करने के लिए एक बॉक्सप्लॉट या घनत्व वक्र के रूप में दवा या उसके मेटाबोलाइट की सामान्यीकृत तीव्रता को प्लॉट करें। यहां, जीजीप्लॉट2 पैकेज के साथ-साथ आर सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जाता है।
  3. प्रत्येक कोशिका (यानी, 4-OHT और टैमोक्सिफेन) में अनमेटाबोल्ड मूल अणु द्वारा दवा मेटाबोलाइट की बहुतायत को विभाजित करके मेटाबोलाबोले को अनमेटाबोलीकृत दवा अनुपात में मेटाबोलीकृत दवा की गणना करें।
    नोट: विशिष्ट रमन चोटियों की रुचि की विविधताओं और दवा या उसके चयापचय के एमएस चोटियों में भिन्नता के बीच संबंध का अध्ययन किया जा सकता है। यह एकल कोशिकाओं में दवा और उसके मेटाबोलाइट के बीच संभावित सहसंबंध के लिए एक अतिरिक्त है। यह दो पूंछ वाले परीक्षण का उपयोग करके पियर्सन सहसंबंध गुणांक की गणना करके किया जा सकता है। अधिक उन्नत एकीकृत दृष्टिकोणों पर भी विचार किया जाना चाहिए।

Representative Results

किसी भी छिपे हुए या दवा प्रतिरोधी उपजनसंख्या को उजागर करने के साथ-साथ सेलुलर विषमता के प्रभावों को समझने में दवा इंटरैक्शन (तेज, चयापचय और प्रभाव) का एकल-सेल विश्लेषण आवश्यक है। इस प्रोटोकॉल में, एकल कोशिकाओं में उपर्युक्त बातचीत को मापने के लिए दो पूरक तकनीकों का उपयोग किया गया था: रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी और सुश्री रमन स्पेक्ट्रोमेट्री दवा प्रतिक्रिया के स्पेक्ट्रल बायोमार्कर के आधार पर दवाओं से प्रभावित कोशिकाओं की तेजी से पहचानकरते हैं। एमएस का उपयोग चुनिंदा और अर्ध-मात्रात्मक तरीके से दवा के तेज और चयापचय की निगरानी के लिए किया जाता है। कोशिकाओं को पहले रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा जांच की गई थी, फिर व्यक्तिगत रूप से एमएस द्वारा विश्लेषण के लिए नमूना लिया गया था।

प्रत्येक स्थिति के औसत स्पेक्ट्रम का तुलनात्मक विश्लेषण (दवा उपचार के साथ और बिना) चित्रा 2में दिखाया गया है। दोनों स्थितियों का औसत स्पेक्ट्रम स्पष्ट रूप से विभिन्न चोटियों पर भिन्न होता है, जिन्हें पहले पहचाना गया था और आणविक यौगिकों को सौंपा गयाथा । विशेष रूप से, 1000 सेमी पर चोटियों- (फिनाइलाइन और टायरोसिन जैसे सुगंधित यौगिकों को सौंपा गया) मजबूत अंतर दिखाता है। सांख्यिकीय अंतर के महत्व का आकलन आगे बहुआयामी विश्लेषणों द्वारा किया जाना चाहिए ।

डेटा सेट तो एक पीएलएस मॉडल (कदम 4.5-4.8) दो सेल उपचार भेद करने के उद्देश्य से प्रशिक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था (दवा के साथ: n = २९०, दवा के बिना: n = ११५) । टैमोक्सिफेन की उपस्थिति में सुसंस्कृत कोशिकाओं को वर्गीकृत करने की भविष्य कहनेवाला क्षमता परीक्षण डेटा में 100% संवेदनशीलता और 72% विशिष्टता तक पहुंच गई (क्रॉस-मान्य प्रशिक्षित मॉडल से अज्ञात)। संवेदनशीलता सही सकारात्मक है कि सही ढंग से मॉडल द्वारा पहचाने जाते है का एक उपाय है, जबकि विशिष्टता वास्तविक नकारात्मक है कि मॉडल द्वारा पहचाने जाते है का एक उपाय है । एसवीएम, एलडीए और तंत्रिका नेटवर्क जैसे वैकल्पिक मॉडल समान या बेहतर परिणाम प्रदान कर सकते हैं, हालांकि इस अध्ययन में एक व्यापक तुलना नहीं की गई है।

पीएलएस मॉडल के आधार पर वीआईपी स्कोर की गणना की गई, जो प्रायोगिक परिस्थितियों(चित्रा 3)के भेदभाव में तरंगदैर्ध्य (रमन पाली) के महत्व का प्रतिनिधित्व करते हैं । महत्वपूर्ण बात यह है कि वीआईपी प्रोफाइल की सबसे ऊंची चोटियों ने रमन चोटियों से मेल खाती थी जिसके लिए दोनों उपचारों के बीच मजबूत मतभेद देखे गए थे । यह इलाज और अनुपचारित कोशिकाओं के बीच विशिष्ट आणविक मतभेदों की पुष्टि की । नतीजतन, शोधकर्ता संभावित स्पेक्ट्रल बायोमार्कर की पहचान कर सकते हैं जो दवा उपचार के लिए एकल कोशिकाओं की प्रतिक्रिया को दर्शाते हैं। इन बायोमार्कर का परीक्षण विभिन्न स्थितियों और सेल लाइनों में उनकी जैविक प्रासंगिकता और सामान्यीकरण को सत्यापित करने के लिए आगे किया जा सकता है।

एक लाइव सिंगल-सेल मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलएससी-एमएस) सिस्टम एकल, दवा-इलाज हेपग्2 कोशिकाओं में दवा और उसके मेटाबोलाइट्स दोनों का पता लगाने में सक्षम था जिसे पहले रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मापा गया था । इसके अलावा, दोनों अणुओं की संरचना की पुष्टि करने के लिए मिलकर एमएस का उपयोग किया जा सकता है। सकारात्मक पहचान के बाद, दवा और उसके मेटाबोलाइट्स की सापेक्ष बहुतायत को प्रत्येक कोशिका में मापा गया था और अनुपचारित कोशिकाओं में पृष्ठभूमि चोटियों की तुलना में। टैमोक्सिफेन बहुतायत में मजबूत भिन्नता देखी गई, और यह घटना इसके मेटाबोलाइट, 4-ओएचटी(चित्रा 4)के मामले में और भी अधिक स्पष्ट थी। टैमोक्सिफेन बहुतायत और इसके मेटाबोलाइट्स के बीच संबंध का भी अध्ययन किया गया, जिसमें दोनों (आर = 0.54, पी = 0.0001, एन = 31) के बीच एक महत्वपूर्ण सकारात्मक संबंध पाया गया।

Figure 1
चित्रा 1: सेल पिकिंग सिस्टम माइक्रोस्कोप चरण पर चढ़कर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: दवा-इलाज कोशिकाओं का औसत स्पेक्ट्रम (टैमोक्सिफेन के साथ: एन = 295) और अनुपचारित कोशिकाएं (टैमोक्सिफेन के बिना: एन = 115)। रमन चोटियों को साहित्य से पहचाना जा सकता है। अधिकांश मजबूत स्पेक्ट्रल मतभेद सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण (एनोवा, पी 0.5) हैं जैसा कि पहले4वर्णित था। इस आंकड़े को पिछले प्रकाशन4से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: वीआईपी स्कोर भविष्य कहनेवाला PLS मॉडल से निकाला । वीआईपी स्कोर तरंगदैर्ध्य को प्रतिबिंबित करते हैं जो मॉडल में दो वर्गों के बीच भेद करने में योगदान देते हैं। अधिकांश चोटियां विशिष्ट अणुओं के अनुरूप होती हैं जिन्हें दवा-उपचारित कोशिकाओं पर दवा प्रभावों के स्पेक्ट्रल बायोमार्कर के रूप में मनाया जाता है। इस आंकड़े को पिछले प्रकाशन4से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: टैमोक्सिफेन बहुतायत और इसके मेटाबोलाइट का वितरण। अनुपचारित कोशिकाओं (नियंत्रण) में एंडोजेनस चोटियों की तुलना में टैमोक्सिफेन बहुतायत और इसके मेटाबोलाइट, 4-ओएचटी (एकल-कोशिका स्तर पर मापा गया) का वितरण। इस आंकड़े को पिछले प्रकाशन4से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

इस पांडुलिपि में, एक साधारण मामला चुना गया था जिसमें हेपग्2 कोशिकाओं को टैमोक्सिफेन करने के लिए उजागर किया गया था (या नहीं)। कोशिकाओं पर टैमोक्सिफेन के प्रभावों की निगरानी के लिए रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री सिस्टम की क्षमता का प्रदर्शन किया जाता है। रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी ने संभावित बायोमार्कर की पहचान की अनुमति दी जो दवा जोखिम के लिए एकल कोशिकाओं की एक सामान्य प्रतिक्रिया को प्रतिबिंबित करता है। एकल कोशिकाओं के बीच कुछ विषमता देखी गई, जिससे यह सुझाव दिया गया कि कुछ कोशिकाओं ने दवा जोखिम का जवाब नहीं दिया। दूसरी ओर, एलएससी-एमएस एकल-कोशिका स्तर पर दवा और उसके मेटाबोलाइट का लक्षित विश्लेषण करने में सक्षम था, जिसमें दवा और इसकी मेटाबोलाइट बहुतायत में उच्च स्तर की विषमता देखी गई थी। यह विषमता यह समझाने में मदद करती है कि कुछ कोशिकाएं दवा से प्रभावित क्यों होती हैं जबकि अन्य प्रतीत नहीं होते हैं, बावजूद इसके कोशिकाएं माना जाता है कि समान आबादी12से उत्पन्न होती हैं।

इस तकनीक के विशेष पहलुओं में, जिस पर ध्यान देने की आवश्यकता होती है, डेटा की प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए माइक्रोस्कोप सेट-अप और सिग्नल प्रसंस्करण की गुणवत्ता का मूल्यांकन करना महत्वपूर्ण है। यदि स्पेक्ट्रा की पूर्वप्रसंस्करण सावधानी से की जाती है, तो सिग्नल विविधताओं को प्रत्येक चोटी के स्थानीय अधिकतम पर अधिकतम किया जाना चाहिए। इसके विपरीत, स्पेक्ट्रा के बेसलाइन और किनारे को परीक्षण कोशिका स्थितियों के बीच ओवरलैप करना चाहिए। एक अन्य महत्वपूर्ण पहलू उपचार के बीच मतभेदों की जांच करने के लिए उपयोग किया जाने वाला मल्टीवेरिएट मॉडल है। एक सटीक और सटीक विश्लेषण सुनिश्चित करने के लिए मॉडल और मॉडल मापदंडों का सावधानीपूर्वक मूल्यांकन करना चाहिए। तंत्रिका नेटवर्क के विपरीत पीएलएस मॉडल का एक लाभ यह है कि यह प्रत्येक तरंगदैर्ध्य (रमन पाली) से जुड़े वजन तक पहुंच की अनुमति देता है जो मॉडल द्वारा परीक्षण की गई स्थितियों को सबसे अच्छा अलग करता है।

रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी के बावजूद सफलतापूर्वक दवा प्रतिक्रिया भेदभाव, यह जोर दिया जाना चाहिए कि इस तकनीक के उपयोग में सीमित है जैविक व्याख्या प्रदान करते हैं । यह मुख्य रूप से स्पेक्ट्रल सिग्नल की जटिलता के कारण होता है, जिसमें हजारों अणुओं का मिश्रण शामिल है। इसलिए, रमन स्पेक्ट्रल तीव्रता और दवा सांद्रता में भिन्नता के बीच व्यवस्थित विविधताओं का मूल्यांकन करने के लिए आगे की जांच की आवश्यकता है । इसके अलावा, टैमोक्सिफेन से जुड़े स्पेक्ट्रल बायोमार्कर के सामान्यीकरण का मूल्यांकन करने के लिए अन्य सेल लाइनों के समान अध्ययन की आवश्यकता होती है।

इसके अलावा, फार्माकोडायनामिक्स का आकलन करने और प्रत्येक कोशिका के भीतर दवाओं के प्रवेश और प्रवाह का अध्ययन करने के लिए जीवित ऊतकों मापन करना रुचि का हो सकता है। इसके अलावा, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एलएससी-एमएस में नमूना कदम ऑपरेटर के कौशल पर अत्यधिक निर्भर है। स्थानिक संकल्प, नमूना के बाद केशिका के अंदर सेल की स्थिति जैसे पैरामीटर, और थ्रूपुट ताकत पूरी तरह से ऑपरेटर निर्भर हैं, जो एलएससी-एमएस को बड़े पैमाने पर अपनाने की सीमा तय करते हैं। हालांकि, स्वचालित नमूना प्रणाली इस मुद्दे को कम कर सकते हैं । इसके अलावा, जबकि एलएससी-एमएस अपने मूल राज्यों में अनुयायी या फ्लोटिंग कोशिकाओं के नमूने में उत्कृष्टता प्राप्त करता है, यह ऊतक वर्गों में एम्बेडेड नमूने कोशिकाओं में अधिक खराब प्रदर्शन करता है। यह नमूना केशिका टिप की प्रवृत्ति को तोड़ने के लिए अगर नमूना घनत्व अधिक है के कारण है । इसलिए, एकल जांच जैसे एक और दृष्टिकोण14,15ऐसे मामलों में अधिक उपयुक्त हो सकता है।

चूंकि यहां उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं का नमूना न्यूनतम नमूना तैयारी के साथ परिवेश की स्थितियों में लिया जाता है, इसलिए एलएससी-एमएस को आसानी से अन्य प्रौद्योगिकियों के साथ एकीकृत किया जा सकता है, जैसा कि इस प्रोटोकॉल में रमन के साथ इसके एकीकरण द्वारा दिखाया गया है। 3 डी होलोग्राफी के साथ इसी तरह के एक और एकीकरण ने उपकोशिकीय स्तर16पर सेलुलर मेटाबोलाइट्स की पूर्ण मात्रा प्राप्त करने की अनुमति दी है । इसके अतिरिक्त, प्रवाह साइटोमेट्री के साथ एकीकरण न्यूरोब्लास्टोमा कैंसर रोगियों17,18के एकल परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं में मेटाबोलिक बायोमार्कर को अनकवर करने के लिए अनुमति दी गई है।

भविष्य में, इमेजिंग तौर-तरीकोंसेडेटासेट के संयोजन में हाल ही में बढ़ती रुचि के कारण, एकीकृत कम्प्यूटेशनल दृष्टिकोणों का उपयोग करके रमन संकेतों और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री परिणामों (साथ ही अन्य ओमिक्स विधियों) के बीच व्यवस्थित विविधताओं का अध्ययन करना भी रुचि हो सकती है। दिलचस्प बात यह है कि हम पहले से ही वीआईपी स्कोर द्वारा पहचाने गए रमन चोटियों की तीव्रता और एमएस4द्वारा पहचाने गए एकल सेल स्तर पर टैमोक्सिफेन या इसके मेटाबोलाइट की बहुतायत के बीच कई कमजोर लेकिन महत्वपूर्ण रैखिक सहसंबंध पाए हैं। यह डेटा एमएस प्रोफाइल और रमन स्पेक्ट्रा के बीच मेटाबोलिक संबंध और इन मूल्यों की भविष्यवाणी करने की संभावना का सुझाव दे सकता है।

Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते ।

Acknowledgments

लेखक ों ने डॉ अर्नो गेरमंड को जिम्मेदार ठहराते हुए उनके समर्थन और RIKEN आंतरिक सहयोगी फंडों के लिए तोशिओ यानागिडा को धन्यवाद दिया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1% penicillin-streptomycin Nacalai Tesque 09367-34
35mm glass bottom grid dish Matsunami
4-Hydroxy Tamoxifen standard Sigma-Aldrich 94873
532 nm diode pumped solid-state laser Ventus, Laser Quantum
BIOS-L101T-S motorized microscope stage OptoSigma
CT-2 cellomics coated sampling capillaries HUMANIX
d5-Tamoxifen standard Cambridge Isotope Laboratories
Dimethyl sulfoxide LC-MS grade Nacalai Tesque D8418
Dulbecco's Modified Eagle's medium Sigma-Aldrich D5796
Eppendorf GELoader tips Eppendorf
fetal bovine serum Hyclone laboratories SH3006603
FluoroBrite DMEM Thermo Fisher Scientific
Formic acid LC-MS grade Sigma-Aldrich 33015
HepG2 cell line (RCB1886) RIKEN cell bank center RCB1886
MC0-19A1C Incubator Sanyo Electric Co. MC0-19A1C
Methanol LC-MS grade Sigma-Aldrich 1060352500
MMO-203 3-D Micromanipulator Narshige MMO-203
NA:0.95, UPL40 water-immersion Olympus objective lens Olympus
Nanoflex nano-ESI adaptor Thermo Fisher Scientific ES071
On-stage incubator ibidi
Pierce LTQ Velos ESI calibration solution Thermo Fisher Scientific 88323
PIXIS BR400 cooled CCD camera Princeton Instruments
Q-Exactive Orbitrap Thermo Fisher Scientific
Rat-tail collagen coating solution Cell Applications Inc.
Tamoxifen standard Sigma-Aldrich 85256

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References

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