Optocardiographie et études d'électrophysiologie des coeurs perfusés d'Ex Vivo Langendorff

Medicine
 

Summary

L'objectif de cette étude était d'établir une méthode pour étudier la dynamique cardiaque à l'aide d'un modèle animal translationnel. L'approche expérimentale décrite intègre l'optocardiographie à double émission en conjonction avec une étude électrophysiologique pour évaluer l'activité électrique dans un modèle de coeur porcin isolé et intact.

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Swift, L. M., Jaimes III, R., McCullough, D., Burke, M., Reilly, M., Maeda, T., Zhang, H., Ishibashi, N., Rogers, J. M., Posnack, N. G. Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts. J. Vis. Exp. (153), e60472, doi:10.3791/60472 (2019).

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Abstract

Les modèles de petits animaux sont le plus couramment utilisés dans la recherche cardiovasculaire en raison de la disponibilité d'espèces génétiquement modifiées et à moindre coût par rapport aux animaux plus gros. Pourtant, les grands mammifères sont mieux adaptés aux questions de recherche translationnelle liées à la physiologie cardiaque normale, à la pathophysiologie et aux tests précliniques d'agents thérapeutiques. Pour surmonter les obstacles techniques associés à l'utilisation d'un modèle animal plus grand dans la recherche cardiaque, nous décrivons une approche pour mesurer des paramètres physiologiques dans un coeur isolé et Langendorff-perfused de porcelet. Cette approche combine deux outils expérimentaux puissants pour évaluer l'état du cœur : l'étude de l'électrophysiologie (EP) et la cartographie optique simultanée de la tension transmembranaire et du calcium intracellulaire à l'aide de colorants sensibles aux paramètres (RH237, Rhod2-AM). Les méthodologies décrites sont bien adaptées aux études translationnelles sur le système de conduction cardiaque, les altérations de la morphologie potentielle d'action, la manipulation du calcium, le couplage excitation-contraction et l'incidence des alternans cardiaques ou Arythmies.

Introduction

Les maladies cardiovasculaires sont l'une des principales causes de maladie et de décès dans le monde. En tant que tel, un objectif de recherche primaire est d'optimiser les méthodologies qui peuvent être utilisées pour étudier la physiologie cardiaque normale et les mécanismes sous-jacents qui peuvent contribuer à la morbidité et la mortalité chez l'homme. La recherche cardiovasculaire fondamentale s'est traditionnellement appuyée sur de petits modèles animaux, y compris les rongeurs et les lapins1,2,3, en raison de la disponibilité d'espèces génétiquement modifiées4,5, une empreinte expérimentale plus faible et un débit plus élevé. Cependant, l'utilisation d'un modèle porcin a le potentiel de fournir des données plus pertinentes sur le plan clinique6. En effet, des études antérieures ont documenté des similitudes en électrophysiologie cardiaque (EP) entre les humains et les porcs, y compris les courants ioniques similaires7, forme potentielle d'action8, et les réponses aux tests pharmacologiques9. En outre, le cœur porcin a contractile et la cinétique de relaxation qui sont plus comparables à l'homme que les rongeurs ou les lapins10. Comparé à un modèle canin, l'anatomie coronaire porcine ressemble plus étroitement à un coeur humain11,12 et est le modèle de choix pour des études axées sur le développement cardiaque, la cardiologie pédiatrique et/ou les malformations cardiaques congénitales 13. Bien qu'il existe des différences entre le porc et le cœur humain8, ces similitudes font du cœur porcin un modèle précieux pour la recherche cardiovasculaire14.

Perfusion rétrograde du cœur est devenu un protocole standard pour l'étude de la dynamique cardiaque ex vivo15 depuis la première création par Oskar Langendorff16. En conséquence, Langendorff-perfusion peut être utilisé pour soutenir un cœur isolé et intact en l'absence d'influences autonomes. Ce modèle est un outil utile pour comparer directement l'électrophysiologie cardiaque et la contractilité entre les cœurs sains et les cœurs non sains. Puisque la dynamique cardiaque est à la fois temporellement et spatialement complexe, une légère altération dans une région peut affecter considérablement la capacité du cœur entier à travailler comme un syncytium17. Par conséquent, l'imagerie spatiotemporal élevée des colorants sensibles de paramètre est un outil utile pour surveiller la fonction cardiaque à travers la surface du coeur18,19. En effet, la double imagerie simultanée des sondes fluorescentes sensibles au calcium et à tension permet d'évaluer l'activité électrique, la manipulation du calcium et le couplage excitation-contraction au niveau tissulaire20,21, 22,23,24,25,26,27,28. Les techniques de cartographie langendorff-perfusion et/ou optique ont déjà été utilisées pour documenter le déclin de la performance cardiaque due au vieillissement ou aux mutations génétiques, et pour évaluer la sécurité des agents pharmacologiques ou des expositions environnementales29 ,30,31,32,33.

Dans le cadre clinique, une étude d'électrophysiologie cardiaque invasive est souvent utilisée pour étudier les troubles du rythme cardiaque, identifier les pathologies et identifier les options de traitement possibles. De même, nous décrivons un protocole d'EP qui peut être employé pour évaluer la fonction de noeud de sinus, mesurer la conduction atrioventriculaire, et identifier la réfractaire du tissu myocardique. L'étude EP décrite peut être réalisée en conjonction avec la cartographie optique, ou optocardiographie34, pour caractériser pleinement la physiologie cardiaque dans les cœurs isolés. Dans le protocole décrit, la formation image de fluorescence de résolution spatiotemporal élevée a été exécutée avec une combinaison de tension (RH237) et de calcium (Rhod-2AM) colorants dans une configuration dual emission. En outre, les paramètres d'électrophysiologie cardiaque ont été surveillés sous le rythme de sinus et en réponse à la stimulation électrique programmée.

Protocol

Toutes les expériences ont été menées conformément au National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Huitième édition). Toutes les méthodes et protocoles utilisés dans ces études ont été approuvés par le Comité du protocole de soins et d'utilisation des animaux en établissement à l'Hôpital national pour enfants conformément aux Lignes directrices pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire publiées par les NIH. Tous les animaux utilisés dans cette étude ont reçu des soins humains conformément au Guide pour l'entretien et l'utilisation des animaux de laboratoire.

1. Préparation

  1. Préparer 6 L de la solution Krebs-Henseleit modifiée16 (mM: 118.0 NaCl, 3.3 KCl, 1.2 MgSO4, 24.0 NaHCO3, 1.2 KH2PO4, 10.0 glucose, 2.0 pyruvate de sodium, 2% albumin, 2.0 CaCl2). Ajouter CaCl2 le jour de l'expérience, car au fil du temps, en présence de phosphates, le chlorure de calcium se précipitera en phase terminale hors de la solution comme phosphate de calcium.
  2. Ajuster le pH à 7,4 après filtrage stérile (taille des pores : 0,22 m). Vérifiez l'osmolalité de solution pour assurer une gamme de 275-310 mOsm/kg. Refroidir 1 L sur la glace pour une utilisation immédiatement après l'excisé du cœur. Réchauffer 3 L dans un bain d'eau à environ 37 oC avant de bouillonner de carbogen (95 % O2, 5 % CO2).
    REMARQUE: Le réchauffement minimise les bulles et l'embolie potentielle, puisque le liquide froid a une capacité accrue de gaz à se dissoudre; par conséquent, comme le support Krebs-Henseleit modifié passe à travers le système de perfusion et se réchauffe, le gaz sera libéré sous forme de bulles.
  3. Préparer 2 L de cardioplégie (solution de cardioplégie modifiée del Nido, Tableau 1). Congeler suffisamment de cardioplégie dans un bac à glaçons pour remplir un bécher de 500 ml.
  4. Allumez les bains d'eau en circulation réglés à 42 oC. Allumez les pompes pour faire circuler le perfusat dans une boucle de chauffage hydronique fermée (pour une liste complète des matériaux, voir Tableau des matériaux et Figure 1).
    REMARQUE: Un bain d'eau circulant chauffé est utilisé pour réchauffer les tubes et les échangeurs de chaleur à chausse-tout.
  5. Nettoyer les circuits et les chambres en exécutant 2 L d'une solution de 1% de détergent universel dans l'eau à travers le système. Rincer tous les circuits de tubes et les chambres du système Langendorff avec 4 L d'eau purifiée. Exécutez des pompes jusqu'à ce que toute l'eau ait été retirée du système.
  6. Ajoutez un filtre à membrane synthétique en ligne avec les pompes à perfusion (filtre en polypropylène, taille des pores à 5 m). Gaz un oxygénateur de microfibre (hémofiltre) avec 95% O2 et 5% CO2 à 80 kPa.
    REMARQUE: Lors de l'utilisation de l'albumine, il ya souvent mousse associée à l'oxygénation et / ou l'activité de pompage à travers le circuit de tuyauterie. Un composé anti-mousse (émulsion antimousse Y30) peut être ajouté dans le sens de la goutte périodiquement (toutes les 30 min) pour l'étancher au fur et à mesure qu'il se produit.
  7. Vérifier un étalonnage à deux points (0 et 60 mmHg) pour le capteur de pression situé au-dessus de l'aorte ou dans le piège à bulles; calibrer au besoin.
  8. Immédiatement avant l'excision cardiaque, versez les médias dans le système de perfusion de boucle Langendorff. Assurez-vous que le perfusate passe par les oxygénateurs de microfibres (hémofiltres) gazés avec du perfusat oxygéné, qui coule ensuite à travers les échangeurs de chaleur pour maintenir une température de perfusate des médias de 37 oC à l'aorte.
  9. Définir le bain d'eau en circulation à quelques degrés au-haut de 37 oC, comme 42 oC, pour tenir compte de la perte de chaleur pendant l'échange et dans l'ensemble du système. Surveillez la température de perfusate circulante avec des thermocouples.

2. Excision de coeur et Langendorff-perfusion

  1. Sédatez le porc avec une injection intramusculaire (I.M.) de kétamine (20 mg/kg) et de xylazine (2 mg/kg) et intubée avec un tube endotrailleux. Pour l'induction, administrer une injection intraveineuse de bolus (I.V.) de fentanyl (50 g/kg) et de rocuronium (1 mg/kg). Maintenir l'anesthésie avec de l'isoflurane inhalé (0,5 à 3 %), du fentanyl (10 à 25 g/kg) et du pancuronium (1 mg/kg).
    REMARQUE: Pour cette étude de preuve de principe, des porcs juvéniles du Yorkshire (14 à 42 jours, n ' 18) ont été utilisés qui variaient de 2,5 à 10,5 kg de poids corporel et de 18 à 137 g de poids cardiaque(figure 2). Si une injection supplémentaire pour l'induction est nécessaire, la kétamine (10 mg/kg) peut être injectée I.M.
  2. Une fois que l'animal est complètement anesthésié et insensible, effectuer une sténotomie pour exposer l'aorte ascendante et l'atrium droit.
    1. À l'aide d'un scalpel, faire une incision de la ligne médiane du haut du sternum à l'inlet thoracique, jusqu'au processus xiphoïde. À l'aide d'une cautérisation (ou de ciseaux), disséquer la graisse et le muscle sous-jacents jusqu'à ce que le sternum soit visible.
    2. Du processus de xiphoïde, couper la ligne médiane du sternum à travers le manubrium avec des ciseaux chirurgicaux os ou une scie à os. Insérez des rétracteurs dans l'incision pour exposer le cœur.
  3. Fournir une dose de bolus d'héparine (300 U/kg) dans les atriums droits, à l'aide d'une aiguille et d'une seringue de 18 G, afin de minimiser les caillots de tache lors de l'excision des organes. Placez des coussinets absorbants dans la cavité thoracique et de la glace autour du cœur.
  4. À l'aide de ciseaux, trancher soigneusement le péricarde, isoler l'aorte par dissection émoussée du tissu conjonctif environnant et serrer l'aorte juste en dessous de la première branche artérielle de l'arc aortique. À l'aide d'une seringue de 50 ml avec une aiguille de 18 G, injectez de la cardioplégie glacée (20 ml/kg) par le haut de l'aorte ascendante.
  5. Couper à travers les vaisseaux menant au cœur et enlever le cœur avec l'aorte ascendante intacte et plonger le cœur excisé dans la cardioplégie glacée.
  6. Saisissez les parois de l'aorte avec une paire d'hemostats et glissez-la sur une canule nervurée attachée à un tube menant à 1 L de support de cardioplégie glacée suspendu au-dessus du cœur (95 cm pour fournir 70 mm Hg). Laissez le liquide entrer et remplir l'aorte jusqu'à ce qu'elle déborde pour empêcher toute bulle d'entrer dans la vascularisation.
    REMARQUE: L'utilisation d'un découpleur mécanique (2,3-butanedione monoxime [BDM] ou blebbistatin) diminuera le taux de perfusion coronaire à mesure que la demande en oxygène du tissu diminue.
  7. Fixer l'aorte à la canule à l'aide de ruban ombilical et l'ancrer davantage en attachant les hemostats pour supporter le poids du cœur, qui est maintenant suspendu à la canule (Figure 1C). Laissez le support froid rétrograde perfuser le cœur à une pression constante de 70 mmHg par gravité. Gardez le cœur immergé dans une cardioplégie froide jusqu'à ce qu'il soit prêt à être transféré dans le système de perfusion Langendorff réchauffé (37 oC) (10 min).
    REMARQUE: L'aorte sur les petits cœurs (50 g, jusqu'à 2 porcs de la semaine) portera le poids du cœur, mais les cœurs plus grands sont à risque de glisser de la canule. Pendant le cannulation initial et lors du déplacement vers le système réchauffé, empêcher l'air d'entrer dans l'aorte, qui peut causer des embolies coronaires. Utilisez de grands tubes de forage (diamètre interne de 3/8 po) qui permet aux bulles de s'élever plus rapidement que la solution entrant dans l'aorte.
  8. Transférer le cœur dans le système Langendorff (37 oC) sans introduire d'air dans la canule. Laissez le rythme normal des sinus rincer la vascularisation de tout sang et cardioplégie restants.
    REMARQUE: Dans l'étude décrite, un débit initial moyen de 184 à 17 ml/min a été observé dans des cœurs de porcelets juvéniles isolés. Le débit est tombé à 70 à 7,5 ml/min (moyenne et SEM) après avoir perfrégé avec des supports réchauffés contenant un découpleur mécanique (20 mM BDM). Ne submergez pas le tissu cardiaque, car il peut empiéter sur l'imagerie cardiaque. La température des tissus est maintenue par le flux coronaire dans le cœur de porc en raison de son plus grand volume et une surface plus petite, par rapport aux rongeurs. En plein débit, les températures de l'épicardium et de l'endocardium variaient respectivement de 35 à 37 oC.
    MISE EN GARDE: Portez l'équipement de protection individuelle approprié, y compris l'usure des yeux lorsque vous travaillez avec des découpleurs mécaniques. Le cœur peut éjecter les médias rapidement et de façon inattendue.
  9. Défibriller le cœur en cas d'arythmies shockables (tachycardie ventriculaire, fibrillation ventriculaire) en plaçant des pagaies externes au sommet et à la base du cœur et en délivrant un seul choc à 5 J, augmentant par incréments de 5 J (ou comme sélectionnable par le défibrillateur) jusqu'à 50 J, cardioversion, ou rythme non-choquable. Répétez les chocs à 50 J si nécessaire.
    REMARQUE: Dans l'étude présentée, 89% des préparations ont exigé la défibrillation. Après l'équilibre (10 min), on a observé une fréquence cardiaque moyenne de 70 à 4,5 bpm (moyenne et SEM) chez les jeunes porcelets (figure 2).
  10. Rincer le cœur avec au moins 1 L de support Krebs-Henseleit modifié, sans recirculation, pour enlever tout sang résiduel et la cardioplégie. Une fois que les médias s'écoulent à travers le cœur, fermez la boucle circulante pour recirculer perfusate.

3. Étude d'électrophysiologie

  1. Pour enregistrer un électrocardiogramme standard de plomb II (ECG) tout au long de l'étude, attachez une électrode d'aiguille de 29 G à l'épicardure ventriculaire près de l'apex, avec une autre électrode dans l'oreillette droite. Connectez les entrées positives et négatives d'un bioamplificateur différentiel au sommet et à l'atrium droit, respectivement.
  2. Attachez une électrode de stimulus bipolaire sur l'oreillette droite, et une deuxième électrode bipolaire de stimulus au ventricule gauche latéral pour des buts de stimulation.
  3. Rythme du cœur à l'aide d'un stimulateur électrophysiologique, avec le courant initial réglé à deux fois le seuil diastolique (1 2 mA) et une largeur d'impulsion de 1 ms35,36.
    REMARQUE: Si la stimulation ne parvient pas à obtenir une réponse, la largeur de l'impulsion peut être augmentée jusqu'à 2 ms. Il faut plus de courant (10x) avec de grandes électrodes coaxiales (stimulation bipolaire).
  4. Identifiez le seuil de stimulation en appliquant une série d'impulsions de stimulation (1 à 2 mA, largeur d'impulsion de 1 ms) à des longueurs de cycle de stimulation définies (PCL) afin d'assurer une réponse de stimulation constante.
    REMARQUE: Une fois que le taux intrinsèque est établi, le train d'impulsion initial peut commencer à un PCL légèrement plus court.
  5. Effectuer un rythme extrastimulus à l'aide d'un train de stimulation S1-S1 ou S1-S2, dans ce dernier, un train de 6 à 8 impulsions (S1) a été suivi d'une seule impulsion (S2). Diminuer le S2 PCL étape de 10 ms (c.-à-d. 200 ms, 190 ms, 180 ms, etc.) jusqu'à ce qu'il ne soit pas capturé. Montez à l'avant-dernier PCL (c.-à-d., 190 ms) et diminuez en intervalles de 1 ms pour trouver le PCL le plus précis avant la perte de capture (c.-à-d. 184 ms).
    REMARQUE :
    Les mêmes paramètres de stimulation sont utilisés pour les deux S1 et S2 (1/2 mA, largeur d'impulsion de 1 ms). Voir La figure 3 pour des exemples représentatifs, ou des valeurs publiées précédemment sur les mesures d'électrophysiologie cardiaque porcine37.
    1. Pour établir la période réfractaire efficace ventriculaire (VERP), utilisez l'électrode de stimulus sur le ventricule gauche latéral pour identifier l'intervalle S1-S2 le plus court auquel le S2 (battement prématuré) initie la dépolarisation ventriculaire.
      REMARQUE: La période réfractaire est l'intervalle d'accouplement S1-S2 le plus court et le plus court.
    2. Pour définir la longueur du cycle de Wenckebach (WBCL), utilisez l'électrode de stimulus sur l'oreillette droite pour trouver l'intervalle S1-S1 le plus court auquel la conduction atrioventriculaire 1:1 se propage par la voie normale de conduction.
      REMARQUE: Ne pas le faire représente 2nd bloc cardiaque degré.
    3. Pour définir le temps de récupération du nœud sinus (SNRT), utilisez l'électrode de stimulus sur l'atrium droit pour appliquer un train de stimulation (S1-S1) et mesurer le délai entre la dernière impulsion dans le train de rythme, et la récupération de l'activité spontanée de nœud sinoatrial-négocié.
    4. Pour établir une période réfractaire efficace de noeud atrioventriculaire (AVNERP), utilisez l'électrode de stimulus sur l'oreillette droite pour trouver l'intervalle de couplage S1-S2 le plus court auquel la stimulation auriculaire prématurée est suivie d'un potentiel de faisceau qui suscite un QRS complexe, ce qui signifie la dépolarisation ventriculaire.

4. Cartographie optique de la tension transmembranaire et du calcium intracellulaire

REMARQUE: Un découpleur mécanique devrait être employé pour réduire au minimum des artefacts de mouvement pendant la cartographie optique et pour éviter l'hypoxie3,38,39,40. (-/-) La blebbistatine (concentration circulante de 5 m) peut être ajoutée lentement sous forme de dose de bolus de 0,5 mm en 5 ml de perfusate (100x de concentration finale)41. Alternativement, BDM peut être initialement inclus dans les médias perfusate à une concentration circulante de 20 mM.

  1. Préparer le colorant de tension en dissolvant 5 mg de RH237 en 4 ml d'anhydre DMSO. Diluer le colorant aliquot avec jusqu'à 5 ml de milieu et de vortex. Ajouter lentement RH237 (62,1 g par 500 ml de perfusate) proximal à la canule aortique.
    REMARQUE: Le tissu myocardique peut être taché de RH237, si nécessaire, pendant toute la durée de l'expérience.
  2. Préparer le colorant de calcium en dissolvant 1 mg de Rhod2-AM en 1 ml d'anhydre DMSO. Mélanger le colorant avec 50 oL d'acide pluronique, placer dans un bain de soniating de 37 oC jusqu'à 10 min, puis diluer avec jusqu'à 5 ml de support. Ajouter lentement le colorant de calcium (50 g par 500 ml de perfusate) proximal à la canule aortique.
    REMARQUE: Pour assurer une coloration de teinture uniforme, les colorants doivent être ajoutés lentement (à 30 s). Rhod-2AM prend jusqu'à 10 min pour atteindre le pic de fluorescence, tandis que RH237 tache le cœur dans un 1-2 min. À l'aide de la charge de colorant décrit, le rapport signal/bruit (SNR) varie de 42 à 86 et 35-69 pour la tension et le calcium, respectivement, peut être prévu. Les valeurs SNR peuvent être calculées comme SNR (comptes de pic à pic)/(déviation standard pendant l'intervalle diastolique)42.
  3. Positionnez le matériel d'imagerie (caméra, séparateur d'images, objectif) comme le montre la figure 1, pour vous concentrer sur un champ de vision approprié.
    REMARQUE: Le séparateur est configuré avec un miroir dichroïque (660 nm) qui passe RH237 et reflète les spectres d'émission rhod2. Des filtres à haute transmission sont utilisés pour le RH237 (710 nm de long pas) et Rhod2 (585 à 40 nm) émis par la lumière (long passage ET710, voir Tableau des matériaux). Une lentille large-pupil 50 mm/F0.95l est attachée à l'avant du séparateur d'image. Cette configuration se traduit par une séparation adéquate de la lumière des émissions, comme précédemment validé43,44.
  4. Connectez la caméra à un poste de travail et acquérez des images à l'aide d'un logiciel sélectionné, avec un temps d'exposition de 0,5 à 2 ms. Effectuez l'alignement de l'image à l'aide d'un logiciel qui peut diviser les régions désirées, la reposition et afficher une soustraction à l'échelle grise ou une pseudo-couleur en plus de mettre en évidence le désalignement (voir tableau des matériaux pour l'option logicielle).
  5. Éteignez la lumière ambiante pour minimiser les interférences de fluorescence provenant de l'éclairage ambiant. Testez les lumières LED (525 nm, 1,4 mW/mm2) avant le début de l'imagerie afin d'assurer un éclairage épicardique uniforme et maximal, tel que déterminé par la profondeur du puits du capteur.
    REMARQUE: Chaque lumière est dirigée par un filtre d'excitation (535 à 25 nm). Les lumières LED peuvent être déclenchées manuellement avant le tournage pour maximiser la linéarité du signal. La fluorescence émise par l'epicardium passe par le séparateur d'image et les filtres d'émission. Les images fractionnementsont sont projetées sur un capteur haute vitesse. Le champ de vision est d'environ 12 cm x 10 cm, ou 5,9 cm x 4,7 cm pour chaque image fendue, selon le choix de l'objectif et la distance du cœur.
  6. Pour les études de cartographie optique, imagez le myocarde pendant le rythme des sinus, la fibrillation ventriculaire (Figure 4) ou le rythme dynamique (S1-S1, 1-2 mA, largeur d'impulsion de 1 ms) via une électrode de stimulation positionnée sur le ventricule gauche (figure 5). Commencez par une longueur de cycle de 350 ms et une réduction de 10 à 50 ms pour générer des courbes de restitution (Figure 5E)35,36.

5. Nettoyage

  1. Retirez le cœur du système et égouttez tout perfusate. Rincer le tube du système et les chambres avec de l'eau purifiée.
  2. Pour l'entretien courant, rincer périodiquement le système avec une solution de détergent ou une solution diluée de peroxyde d'hydrogène, au besoin.

6. Traitement des données

  1. Confirmer la qualité du signal optique tout au long de l'étude en ouvrant un fichier vidéo, en sélectionnant une région d'intérêt et en traçant la fluorescence moyenne au fil du temps à l'aide d'un logiciel approprié ou d'un algorithme personnalisé.
  2. Analyser les données d'imagerie telles que décrites précédemment23,33,43,45,46, pour quantifier le potentiel d'action et les paramètres temporels transitoires de calcium, y compris le temps d'activation, temps d'accouplement tension-calcium (différence entre les temps d'activation Vm et Ca) et mesures de durée de repolarisation.
    1. Appliquer le seuil pour isoler les pixels épicardiaux fluorescents et jeter les données d'arrière-plan bruyantes.
      REMARQUE: Le seuil simplifiera et accélérera l'analyse sur les grandes vidéos.
    2. Filtrer spatialement les signaux optiques sur une surface épicardique de tailles de noyau allant de 3 mm x 3 mm à 5 mm x 5 mm, comme on le voit dans la figure 4 et la figure 5.
      REMARQUE: Ce dernier permettra d'améliorer le SNR sans déformer les caractéristiques potentielles d'action, la morphologie transitoire du calcium, ou le contour global des fronts d'onde19,47. Cela peut être inutile si vous utilisez un capteur avec de grands pixels ou si binning lors de l'acquisition.
    3. Filtrer temporellement les signaux avec un filtre numérique lowpass (p. ex., 5e ordre Butterworth) avec une fréquence de coupure comprise entre 100 et 75 Hz pour éliminer le contenu insignifiant du signal45.
      REMARQUE: Voir Figure 5C pour un exemple de traces traitées représentatives.
    4. Appliquer l'élimination et la soustraction de la dérive, par l'intermédiaire du raccord polynomial de Nth-ordre, pour réduire au minimum les effets du photoblanchiment, du mouvement, ou d'autres sources significatives de variation.
    5. Après le traitement et la normalisation des données optiques sur une vidéo entière, calculez le potentiel d'action et les paramètres transitoires de calcium d'intérêt. Déterminer le temps d'activation, défini comme le temps de dérivé maximal pendant la dépolarisation, et la fluorescence maximale afin de calculer les temps et les périodes de repolarisation (durée potentielle d'action [APD] et [Ca2]i durée [CaD], voir Figure 5).
    6. Après que les paramètres temporels soient calculés, générer des cartes isochronales pour dépeindre des aspects d'un potentiel d'action unique ou d'un transitoire de calcium sur toute la surface épicardique imageàque à l'aide d'algorithmes personnalisés23,33, 43,45,46.
      REMARQUE: Voir Figure 5D par exemple.

Representative Results

La figure 1A montre un diagramme du système isolé de perfusion cardiaque, qui comprend le circuit de tubes, la pompe, le filtre, l'oxygénant, les réservoirs et les éléments chauffants. Le placement des électrodes ECG (configuration de plomb II) et de rythme est indiqué dans la figure 1B, et la configuration d'imagerie est représentée dans la figure 1C. Un schéma des composants optiques et des chemins lumineux est montré dans la figure 1D.

Des études expérimentales ont été réalisées sur des cœurs entiers intacts isolés chez les jeunes porcs du Yorkshire (14 à 42 jours, n ' 18) dont la taille variait de 2,5 à 10,5 kg de poids corporel et de 18 à 137 g de poids cardiaque(figure 2A). Après le transfert du cœur isolé vers un système Langendorff (37 oC), la fréquence cardiaque s'est stabilisée à 70 à 4,5 bpm (moyenne et SEM) à moins de 10 minutes de défibrillation et est demeurée constante tout au long de la durée de l'étude (figure 2B). Un débit moyen de 184 à 17 ml/min (moyenne et SEM) a été mesuré, ce qui a ralenti à 70 à 7,5 ml/min après avoir perfugé avec des supports réchauffés contenant un découpleur mécanique (figure 2C).

Des ECG de Plomb II ont été enregistrés pendant toute la durée de l'étude au rythme des sinus (figure 3A) ou en réponse au rythme externe (figure 3B-E) pour quantifier les paramètres électrophysiologiques. Pour l'évaluation du PE, le rythme dynamique (S1-S1) a été appliqué à l'oreillette droite pour identifier le WBCL et le SNRT (temps de récupération après le début de S1-S1, Figure 3C), dans lequel WBCL a été désigné comme le PCL le plus court qui a initié une conduction atriale à conduction ventriculaire. Un protocole de stimulation S1-S2 a été mis en œuvre à l'aide d'une électrode de stimulation bipolaire sur le ventricule gauche afin d'identifier l'intervalle de couplage le plus court qui a déclenché la dépolarisation ventriculaire, identifiant ainsi VERP (Figure 3D). Alternativement, un protocole de stimulation auriculaire S1-S2 est appliqué pour identifier AVNERP (S1-S2), comme indiqué dans la figure 3E. Des exemples représentatifs de paramètres d'électrophysiologie du cœur de porc s'alignent étroitement avec ceux publiés précédemment37.

Des expériences de cartographie optique ont été réalisées au rythme des sinus, à la fibrillation ventriculaire spontanée (figure 4), ou au rythme dynamique (S1-S1) du ventricule gauche (LV) pour générer des courbes de restitution électrique et calcique représentées dans Figure 5. Les images représentatives d'un cœur de porcelet chargé de colorant sont montrées à la figure 4 avec des potentiels d'action optique correspondants (Vm) et des transitoires de calcium (Ca) recueillis dans deux régions d'intérêt sur la surface épicardique (ventricule droit [RV] - bleu, LV et rouge) . Les signaux non traités sont affichés pendant le rythme des sinus et pendant la fibrillation ventriculaire. Comme mentionné précédemment, le rythme épicardial dynamique (S1-S1) a également été utilisé lors d'expériences de cartographie optique pour normaliser toute légère différence dans la fréquence cardiaque intrinsèque (Figure 5A-E). Les signaux bruts sont affichés (RV - bleu, LV et rouge), qui ont été utilisés pour représenter le potentiel d'action — temps d'accouplement transitoire de calcium (figure 5C),temps d'activation et de durée (Figure 5D), restitution électrique et calcium (Figure 5E). Pour les préparations myocardiques épaisses, le filtrage spatial avec la taille du noyau 3 mm x 3 mm est approprié pour le potentiel d'action épicardique ou l'analyse transitoire de calcium19,47. En conséquence, les images à haute résolution spatiale (dans la configuration décrite 1240 x 1024 au total, ou 620 x 512 par canal, taille de 6,5 millions de pixels) sont souvent binées spatialement pendant ou après l'acquisition (figure 5C). Le traitement d'image peut être effectué pour générer des cartes d'activation et de repolarisation à l'aide d'algorithmes personnalisés23,33,43,45 ( Figure3D), avec le temps d'activation de chaque pixel sur le cœur a été défini comme le dérivé maximum du potentiel d'action ou de l'upstroke transitoire de calcium.

Figure 1
Figure 1 : Configuration expérimentale. (A) Diagramme du système isolé de perfusion cardiaque; flèches dénotent la direction du flux. (B) Un cœur cannulé est montré avec le placement d'électrode. RA - oreillette droite, RV - ventricule droit, LV - ventricule gauche, ECG - électrocardiogramme de plomb II. (C) La plate-forme d'imagerie à proximité du tissu cardiaque. (D) L'émission de chaque sonde complémentaire (tension, calcium) est séparée par longueur d'onde à l'aide d'un dispositif de fractionnement d'image avec des filtres d'émission appropriés et un miroir dichroïque. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Mesures du poids, du taux et du débit du cœur. (A) Rapport poids-coeur/poids corporel pour chaque porcelet utilisé dans l'étude (n - 18). (B) Fréquence cardiaque mesurée à 10 min après défibrillation et de nouveau à la fin de l'étude (environ 1 h). (C) Le débit coronaire diminue brusquement après la perfusion avec un découpleur mécanique (BDM) en raison de la réduction de la demande d'oxygène. Les barres d'échelle représentent la moyenne - SEM. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Exemples représentatifs d'enregistrements d'électrocardiogrammes de plomb II recueillis au rythme des sinus ou en réponse au rythme externe. (A) Rythme normal des sinus. (B) Exemple de rythme épicardial à une longueur de cycle de 400 ms (S1-S1), qui a été utilisé pour des expériences d'imagerie. (C) Top: Atrial pacing to identify WBCL; la capture réussie est observée à S1 - 250 ms où l'on observe une conduction auriculaire à ventriculaire. Notez que le rythme auriculaire peut être utilisé pour déterminer SNRT (temps de décharge noeud sinus, après avoir commencé le rythme externe). En bas : Comme la longueur du cycle S1 est réduite à 205 ms, la conduction du ventricule échoue. (D) Haut : rythme epicardial (S1-S2) pour identifier LE VERP; La capture réussie est observée à S1 - 450 ms, S2 à 300 ms. Fond : Comme la longueur du cycle S2 est réduite à 250 ms, le tissu ventriculaire ne parvient pas à se capturer. (E) Atrial pacing (S1-S2) pour identifier AVNERP. Haut : Une capture réussie est observée à S1 à 450 ms, S2 à 200 ms. Fond : Comme la longueur du cycle S2 est réduite à 199 ms, la conduction du ventricule échoue. Les flèches bleues dénotent des pointes de rythme, des flèches rouges dénotent la capture (« C ») ou aucune capture (« NC »). S1-S1 - rythme dynamique, S1-S2 - stimulation extrastimulus. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Données optiques pendant le rythme des sinus et la fibrillation ventriculaire. Gauche : Images représentatives d'un cœur de porc chargé de colorant (Vm - tension, RH237; Ca et calcium, Rhod2), vue antérieure. Tension transmembranaire filtrée spatialement et signaux fluorescents intracellulaires de calcium d'un coeur de porc pendant le rythme de sinus (centre). Signaux de tension et de calcium pendant la fibrillation ventriculaire (droite). Taille sa région de signal (15 x 15 pixels, 2,4 x 2,4 mm2, 30 x 30 x 4,8 x 4,8 mm2 taille salké) représentée sa taille de noyau rouge et bleu. Unités F/F. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Données optiques provenant des cœurs de porc perfused de Langendorff. Signaux de fluorescence du calcium non transformés et filtrés spatialement (A) et (B) intracellulaires de fluorescence du calcium provenant des ventricules droit et gauche pendant le rythme électrique au sommet. Les signaux non filtrés et moyenne spatiale représentent des potentiels d'action optique et des transitoires de calcium provenant de régions d'intérêt (les unités de signalisation sont F/F). (C) Une superposement de transitoires normalisés illustre le temps d'accouplement transitoire potentiel-calcium (faible passage filtré à 75 Hz). (D) Le traitement des signaux à travers la surface épicardique pour générer des cartes isochronales des paramètres temporels, y compris le temps d'activation (tacte) et le temps de repolarisation de 80%. (E) Courbes de restitution transitoires électriques et calciques générées à plusieurs fréquences (à gauche) avec analyse statistique (à droite) pour illustrer un temps de repolarisation plus long à des longueurs de cycle plus lentes. Barres d'échelle - moyenne - SEM. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Chimique Formule Poids moléculaire g/L
Chlorure de sodium Nacl 58.44 5.26
Gluconate de sodium C6H11NaO7 218.14 5.02
Trihydrate d'acétate de sodium C2H3NaO23H2O 136.08 3.68
Chlorure de potassium Kcl 74.55 0.63
Chlorure de magnésium (anhydre) MgCl2 95.21 0.1405
8,4 % bicarbonate de sodium NaHCO3 Annonces 84.01 13
Mannitol C6H14O6 182.17 16.3
Sulfate de magnésium MgSO4 120.37 4
Ph 7.4
Osmolarité (mOsmol/L) 294

Tableau 1 : Recette de cardioplégie modifiée dedel Nido.

Discussion

Bien que les modèles de recherche cardiovasculaire s'étendent des préparations cellulaires aux préparations in vivo, il y a un compromis inhérent entre la pertinence clinique et l'utilité expérimentale. Sur ce spectre, le cœur isolé perfused Langendorff reste un compromis utile pour l'étude de la physiologie cardiaque48. Le modèle du cœur entier représente un niveau plus élevé d'intégration fonctionnelle et structurelle que les monocouches à cellule unique ou tissulaire, mais évite également les complexités confondantes associées aux modèles in vivo. Un avantage majeur au cours des expériences de cartographie optique double est que la surface épicardique du cœur isolé peut être observée, et l'imagerie par fluorescence du potentiel transmembranaire et la manipulation du calcium peuvent être utilisés pour surveiller la physiologie cardiaque34.

Les modèles de rongeurs sont le plus souvent utilisés pour les préparations cardiaques isolées plutôt que pour les animaux plus gros, en partie en raison du coût associé de l'augmentation de la taille de tous les éléments impliqués (p. ex., volume de solution, circuit de perfusion, quantité de colorants et découpleurs mécaniques) avec une plus grande instabilité et la propension pour les arythmies chez les grands animaux10,36,49. Un avantage à l'aide de coeurs de porc est qu'ils ressemblent étroitement au coeur humain dans la structure, la taille et le taux de contraction, donc plus précisément modelant des paramètres hémodynamiques comme le flux sanguin coronaire et la sortie cardiaque. De même, les humains et les porcs ont la manipulation semblable de calcium, les intervalles d'électrocardiogramme37,et la morphologie potentielle d'action comprenant les canaux sous-jacents qu'il représente12,50,51, 52. Ce protocole décrit en détail les étapes de la création d'un modèle animal reproductible pour caractériser en détail la fonction myocardique. L'imagerie simultanée de la tension transmembranaire (RH237) et du calcium intracellulaire (Rhod2), utilisée en conjonction avec des protocoles électrophysiologiques établis, offre la possibilité de repérer les mécanismes responsables de l'altération du Fonction. La méthodologie décrite peut être utilisée pour les tests de sécurité précliniques, le dépistage toxicologique et l'étude de pathologies génétiques ou autres. En outre, la méthodologie décrite peut être modifiée et adaptée pour une utilisation avec d'autres modèles cardiaques (par exemple, canine, humain) en fonction de l'accent de recherche spécifique53,54,55.

Il y a quelques modifications critiques à garder à l'esprit lors de la transition d'un modèle de rongeur plus petit à un modèle de porc plus grand pour les préparations isolées et entières de coeur. Pendant la préparation et la configuration, nous recommandons d'ajouter l'albumine au perfusate pour maintenir la pression oncotique et réduire l'oœdème (plus antifoam, si nécessaire)56,57,58,59. En outre, perfusate contenant de l'albumine peut également aider dans les études métaboliques qui nécessitent également l'acide gras-supplémentation pour le média60,61. Contrairement aux cœurs de rongeurs, le cœur de porc plus grand n'a pas besoin d'être immergé dans les médias chauds en raison de son rapport surface/volume plus faible et du volume accru de médias réchauffés qui circulent à travers les vaisseaux coronaires, ce qui maintient mieux la température. Comme nous l'avons mentionné précédemment, nous avons placé des sondes de température à l'intérieur du ventricule droit et sur la surface épicardique des ventricules droit et gauche, en n'observant que de légères fluctuations de température de 1 à 2 oC dans les trois endroits de l'étude. Fait important, de tels débits plus rapides peuvent également augmenter la probabilité de bulles et d'une embolie potentielle. Pour contourner ce problème, nous vous recommandons d'utiliser un piège à bulles avec de grands tubes de forage menant directement jusqu'à la canule aortique. De même, nous avons trouvé plus utile d'avoir deux individus travaillant en tandem pour cannuler l'aorte sur un cœur plus grand (et plus lourd); une personne pour tenir l'aorte ouverte avec des hemostats robustes et une autre pour fixer l'aorte au canule à l'aide de ruban ombilical. Dans la méthodologie décrite, nous avons constaté que la perfusion avec la cardioplégie et la défibrillation étaient essentielles au rétablissement cardiaque, qui est contraire aux préparations de coeur de rongeur. Dans notre expérience, seulement quelques coeurs excisés ont repris l'activité sinus-conduite normale sans cardioversion.

Pour améliorer les paramètres de l'imagerie optique, une préparation cardiaque suspendue a limité l'effet de l'éblouisser qui peut se produire avec un cœur submergé. En outre, le cœur suspendu évite également toute compression ou compromis des vaisseaux coronaires sur l'aspect postérieur du cœur qui peut se produire lors de la pose du cœur horizontalement pour l'imagerie verticale. Nous avons également constaté que le chargement de colorants fluorescents après le piège à bulles (près de la canule aortique) a grandement amélioré la coloration des tissus et des signaux optiques. Enfin, pour améliorer les paramètres d'électrophysiologie cardiaque, l'utilisation d'une plus grande électrode de stimulation coaxiale a facilité le rythme auriculaire réussi. Bien que nous décrivions l'utilisation d'électrocardiogrammes pour identifier la capture et la perte de capture pour divers paramètres d'EP, des cathéters intracardiaques ou des électrodes d'enregistrement bipolaires peuvent également être employés.

Notre étude s'est concentrée sur le développement d'une méthodologie pour la cartographie optique double et l'évaluation électrophysiologique cardiaque dans un modèle de coeur porcin isolé et intact. En raison de similitudes avec le cœur humain juvénile, le coeur porcin reste un modèle populaire pour des études focalisés sur la cardiologie pédiatrique ou les défauts congénitaux de coeur. Fait important, l'approche décrite peut être adaptée à l'utilisation avec des cœurs adultes de plus grande taille et/ou différentes espèces d'intérêt. En effet, d'autres laboratoires peuvent constater que l'utilisation de cœurs canins ou humains (donneur ou malade) sont plus applicables pour leur objectif de recherche spécifique53,54,55. Une autre limitation potentielle à cette étude est l'utilisation d'un découpleur mécanique pour réduire l'artefact de mouvement pendant l'imagerie. Blebbistatin est devenu le découpleur de choix dans les applications d'imagerie cardiaque en raison de ses effets minimes sur les paramètres ECG, l'activation et les périodes réfractaires41,62,63. Le BDM est un choix moins coûteux, qui peut être particulièrement important dans les grandes études animales qui nécessitent de plus grands volumes de perfusate et de découpleur mécanique, mais il est connu pour avoir un plus grand impact sur les courants de potassium et de calcium qui peuvent modifier le potentiel d'action morphologie64,65,66,67. Si BDM est utilisé, notez que le raccourcissement APD augmente la vulnérabilité des cœurs aux arrythmias induites par le choc68. Inversement, la principale limitation à l'utilisation de la blebbistatin est sa photosensibilité et sa phototoxicité, bien que des formulations alternatives qui ont réduit ces effets69,70,71. Enfin, la méthodologie décrite utilise un système de caméra unique pour l'expérimentation de cartographie optique double, mais il est important de noter que les études de recherche axées sur la fibrillation ventriculaire et / ou le suivi des ondes électriques à travers la surface épicardique devrait modifier cette approche pour inclure l'imagerie panoramique en trois dimensions, telle que décrite par d'autres15,19,72,73,74,75 .

Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Les auteurs remercient le Dr Matthew Kay pour ses conseils expérimentaux utiles, et Manelle Ramadan et Muhaymin Chowdhury pour l'assistance technique. Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (R01HL139472 à NGP, R01 HL139712 à NI), l'Institut de recherche pour enfants, l'Institut national de cardiologie pour enfants et l'Institut Sheikh Zayed pour l'innovation chirurgicale pédiatrique.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(-)-Blebbistatin Sigma-Aldrich B0560-5MG Mechanical Uncoupler
2,3-Butanedione monoxime (BDM) Sigma-Aldrich B0753-100G Mechanical Uncoupler
Albumin Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A9418
Analog signal interface emka Technologies itf16USB
Antifoam Sigma-Aldrich A5758-250ML
Antifoam Y-30 Emulsion Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A5758
Aortic cannula, 5/16” Cole-Parmer 45509-60
Bubble trap Sigma-Aldrich CLS430641U-100EA
CaCl2 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ C77-500
Camera, sCMOS Andor Technology Zyla 4.2 PLUS
Coaxial stimulation electrode (atria) Harvard Apparatus 73-0219
Defibrillator Zoll M Series
Dichroic mirror Chroma Technology T660lpxrxt-UF2
Differential amplifier Warner Instruments DP-304A
Emission filter, calcium Chroma Technology ET585/40m
Emission filter, voltage Chroma Technology ET710lp
EP stimulator (Bloom) Fisher Medical DTU-215B
Excitation filter Chroma Technology CT510/60bp
Excitation lights Thorlabs SOLIS-525C
Filter McMaster-Carr 8147K52
Filter cartridge, polypropylene Pentair PD-5-934
Filter housing McMaster-Carr 9979T21
Flow transducer Transonic ME6PXN
Glucose Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 158968
Heating coil Radnoti 158821
Hemofilter Hemocor HPH 400
Hemostatic Forceps World Precision Instruments 501326
Image Splitter Cairn Research OptoSplit II
KCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO P3911
KH2PO4 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ 423-316
Large-bore tubing, I.D. 3/8” Fisher Scientific 14-169-7H
Lens 50 mm, 0.95 f-stop Navitar DO-5095
Metamorph Molecular Devices Image Alignment
MgSO4 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M-7506
Mucasol detergent Sigma-Aldrich Z637181-2L
Na Pyruvate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO P2256
NaCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S-3014
NaHCO3 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ S-233
Needle Electrodes 29 G, 2 mm AD Instruments Inc. MLA1204
Noise eliminator Quest Scientific Humbug
Perfusion pump PolyStan A/S 1481
Pressure transducer World Precision Instruments BLPR2
Reservoir, 2 L Cole-Parmer UX-34541-07
RH237 AAT Bioquest Inc. 21480
Rhod2-AM AAT Bioquest Inc. 21062
Stimulation electrode (ventricle) Harvard Apparatus 73-0160
Surgical Suture McKesson Medical-Surgical 890186
Transducer amplifier World Precision Instruments TBM4M
Tubing flow console Transonic TS410
Umbilical tape Jorvet J0025UA
Water bath/circulator VWR 89400-970
Surgical Tools
Bandage shears Harvard Apparatus 72-8448 Lister Bandage Scissors, Angled, Blunt/Blunt, 42.0 mm blade length, 17.0 cm
Electrocautery Dalwha Corp. Ltd. BA2ALD001 Model: 200 Basic
Hemostat Roboz RS-7476 St Vincent Tube Occluding Forceps
Hemostatic forceps Harvard Apparatus 72-8960 Hartmann Hemostatic Forceps, Curved, Serrated 2.2 mm tip width, 9.5 cm
Hemostats Harvard Apparatus 72-8985 Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Curved, Serrated, 2 mm tip 14 cm
Mayo scissors WPI 501749 14.5 cm, Straight
Metzenbaum scissors WPI 501747 11.5 cm, Straight
Mosquito forceps Harvard Apparatus 72-8980 Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Straight, Smooth, 2 mm tip width 12 cm
Needle holder Harvard Apparatus 72-8828 Webster Needle Holders, Straight, Smooth,13.0 cm overall length
Pediatric cross clamp Roboz RS-7660 Cooley-Derra Clamp 6.25" 5 mm Calibrations
Right angle forceps WPI 501240 Baby Mixter Hemostatic Forceps, 14 cm, Right Angle
Scalpel Ted Pella 549-4 Scalpel Handle No. 4, 13.7 cm Stainless Steel and 10 No. 22 Blades
Scissors Harvard Apparatus 72-8380 Operating Scissors, Straight, Blunt/Blunt, 42 mm blade,12 cm
Straight Serrated forceps WPI 500363 Dressing Forceps 15.5 cm
Towel clamp WPI 501700 Backhaus Towel Clamp, 13 cm, Curved, Locking handle, SS
Weitlaner retractor WPI 501314 Weitlaner Retractor, Self-Retaining, 10.2 cm, 2x 3 Sharp Prongs
Disposables
3-0 prolene suture Various vendors Various vendors
Vessel loop Aspen surgical 011001PBX Sterion® Vessel Loop, 0.8 mm x 406 mm
Cardioplegia (Plegisol) Pfizer 00409-7969-05 Plegisol; St Thomas crystalloid cardioplegia solution 20 mL/kg
Heparin Various vendors Various vendors 300 U/kg
Syringe and Needle Various vendors Various vendors 60 mL & 18 G respectively
Umbilical tape Ethicon U12T

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