Optokardiographie und Elektrophysiologie Studien an Ex Vivo Langendorff-perfundierten Herzen

Medicine
 

Summary

Ziel dieser Studie war es, eine Methode zur Untersuchung der Herzdynamik anhand eines translationalen Tiermodells zu etablieren. Der beschriebene experimentelle Ansatz beinhaltet eine duale Emissions-Optokardiographie in Verbindung mit einer elektrophysiologischen Studie zur Beurteilung der elektrischen Aktivität in einem isolierten, intakten Schweineherzmodell.

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Swift, L. M., Jaimes III, R., McCullough, D., Burke, M., Reilly, M., Maeda, T., Zhang, H., Ishibashi, N., Rogers, J. M., Posnack, N. G. Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts. J. Vis. Exp. (153), e60472, doi:10.3791/60472 (2019).

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Abstract

Kleintiermodelle werden in der kardiovaskulären Forschung am häufigsten verwendet, da genetisch veränderte Arten verfügbar sind und im Vergleich zu größeren Tieren niedrigere Kosten entstehen. Größere Säugetiere eignen sich jedoch besser für translationale Forschungsfragen im Zusammenhang mit normaler Herzphysiologie, Pathophysiologie und präklinischen Tests von therapeutischen Wirkstoffen. Um die technischen Barrieren zu überwinden, die mit dem Einsatz eines größeren Tiermodells in der Herzforschung verbunden sind, beschreiben wir einen Ansatz zur Messung physiologischer Parameter in einem isolierten, von Langendorff durchsetzten Ferkelherz. Dieser Ansatz kombiniert zwei leistungsstarke experimentelle Werkzeuge zur Beurteilung des Zustands des Herzens: die Studie zur Elektrophysiologie (EP) und die gleichzeitige optische Kartierung von Transmembranspannung und intrazellulärem Kalzium unter Verwendung von parameterempfindlichen Farbstoffen (RH237, Rhod2-AM). Die beschriebenen Methoden eignen sich gut für translationale Studien zur Untersuchung des Herzleitsystems, Veränderungen in der Wirkungspotentialmorphologie, Kalziumhandhabung, Anregungs-Kontraktionskopplung und die Inzidenz von Herzalternanen oder Arrhythmien.

Introduction

Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind weltweit eine der Hauptursachen für Krankheit und Tod. Daher liegt ein Primärforschungsschwerpunkt auf der Optimierung von Methoden, die verwendet werden können, um normale Herzphysiologie und zugrunde liegende Mechanismen zu untersuchen, die zur Morbidität und Mortalität beim Menschen beitragen können. Grundlegende kardiovaskuläre Forschung hat sich traditionell auf Kleintiermodelle, einschließlich Nagetiere und Kaninchen1,2,3, aufgrund der Verfügbarkeit von genetisch veränderten Arten4,5, kostengünstiger, geringerer experimenteller Stellfläche und höherer Durchsatz. Die Verwendung eines Schweinemodells hat jedoch das Potenzial, klinisch relevantere Daten zu liefern6. Tatsächlich haben frühere Studien Ähnlichkeiten in der Herzelektrophysiologie (EP) zwischen Mensch und Schwein dokumentiert, einschließlich ähnlicher Ionenströme7, Wirkungspotentialform8und Reaktionen auf pharmakologische Tests9. Darüber hinaus hat das Schweineherz Kontraktil- und Entspannungskinetik, die mit Menschen besser vergleichbar sind als Nagetiere oder Kaninchen10. Im Vergleich zu einem Canine-Modell ähnelt die Schweinekoronaranatomie eher einem menschlichen Herz11,12 und ist das Modell der Wahl für Studien, die sich auf Herzentwicklung, pädiatrische Kardiologie und/oder angeborene Herzfehler konzentrieren 13. Obwohl es Unterschiede zwischen dem Schwein und dem menschlichen Herzen8gibt, machen diese Ähnlichkeiten das Schweineherz zu einem wertvollen Modell für die kardiovaskuläre Forschung14.

Die retrograde Perfusion des Herzens ist seit der Gründung durch Oskar Langendorffzueinem Standardprotokoll für das Studium der Herzdynamik ex vivo15 geworden. Dementsprechend kann die Langendorff-Perfusion ohne autonome Einflüsse zur Unterstützung eines isolierten, intakten Herzens verwendet werden. Dieses Modell ist ein nützliches Werkzeug, um die Herzelektrophysiologie und Kontraktilität zwischen gesunden und nicht-gesunden Herzen direkt zu vergleichen. Da die Herzdynamik sowohl zeitlich als auch räumlich komplex ist, kann eine leichte Veränderung in einer Region die Fähigkeit des gesamten Herzens, als Syncytium zu arbeiten, dramatisch beeinträchtigen17. Daher ist eine hochräumlich-zeitliche Bildgebung von parameterempfindlichen Farbstoffen ein nützliches Werkzeug zur Überwachung der Herzfunktion über die Oberfläche des Herzens18,19. Die gleichzeitige Dual-Bildgebung von Spannungs- und Kalzium-empfindlichen Fluoreszenzsonden ermöglicht die Beurteilung der elektrischen Aktivität, der Kalziumhandhabung und der Anregungs-Kontraktionskopplung auf Gewebeebene20,21, 22,23,24,25,26,27,28. Langendorff-Perfusion und/oder optische Kartierungstechniken wurden bisher eingesetzt, um den Rückgang der Herzleistung aufgrund von Alterung oder genetischen Mutationen zu dokumentieren und die Sicherheit von pharmakologischen Wirkstoffen oder Umweltexpositionen zu bewerten29 ,30,31,32,33.

Im klinischen Umfeld wird häufig eine invasive kardiale Elektrophysiologie-Studie verwendet, um Herzrhythmusstörungen zu untersuchen, Pathologien zu identifizieren und mögliche Behandlungsmöglichkeiten zu lokalisieren. In ähnlicher Weise beschreiben wir ein EP-Protokoll, das verwendet werden kann, um die Sinusknotenfunktion zu bewerten, die atrioventrikuläre Leitung zu messen und die Refraktorität des Myokardgewebes zu identifizieren. Die beschriebene EP-Studie kann in Verbindung mit optischer Kartierung oder Optokardiographie34durchgeführt werden, um die Herzphysiologie in isolierten Herzen vollständig zu charakterisieren. Im beschriebenen Protokoll wurde eine Fluoreszenz-Bildgebung mit hoher Raumzeit mit einer Kombination von Spannungsfarbstoffen (RH237) und Calcium (Rhod-2AM) in einem Dual-Emissions-Setup durchgeführt. Zusätzlich wurden die Parameter der Herzelektrophysiologie sowohl im Sinusrhythmus als auch als Reaktion auf die programmierte elektrische Stimulation überwacht.

Protocol

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Eighth Edition) durchgeführt. Alle in diesen Studien verwendeten Methoden und Protokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Protocol Committee am Children es National Hospital gemäß den vom NIH veröffentlichten Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren genehmigt. Alle in dieser Studie verwendeten Tiere wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren human gepflegt.

1. Vorbereitung

  1. 6 L modifizierte Krebs-Henseleit-Lösung16 (mM: 118.0 NaCl, 3.3 KCl, 1.2 MgSO4, 24.0 NaHCO3, 1.2 KH2PO4, 10.0 Glucose, 2.0 Natriumpyruvat, 2% Albumin, 2.0 CaCl2) vorbereiten Fügen Sie CaCl2 am Tag des Experiments hinzu, da Kalziumchlorid im Laufe der Zeit in Gegenwart von Phosphaten endlos aus der Lösung als Calciumphosphat ausfällt.
  2. Stellen Sie den pH-Wert nach steriler Filterung auf 7,4 ein (Porengröße: 0,22 m). Überprüfen Sie die Osmolalität der Lösung, um einen Bereich von 275 bis 310 mOsm/kg zu gewährleisten. 1 L auf Eis abkühlen für den Gebrauch unmittelbar nach dem Ausverbrauch des Herzens. Erwärmen Sie 3 L im Wasserbad auf ca. 37 °C, bevor Sie mit Carbogen (95% O2, 5% CO2)sprudeln.
    HINWEIS: Erwärmung minimiert Blasen und potenzielle Embolie, da kalte Flüssigkeit hat eine erhöhte Kapazität von Gas zu lösen; Wenn also die modifizierten Krebs-Henseleit-Medien durch das Perfusionssystem gehen und sich erwärmt, wird das Gas als Blasen freigesetzt.
  3. Bereiten Sie 2 L Cardioplegie (modifizierte del Nido cardioplegia Lösung, Tabelle 1). Genug Cardioplegie in einer Eiswürfelschale einfrieren, um einen 500 ml Becher zu füllen.
  4. Schalten Sie die auf 42 °C eingestellten Wasserbäder ein. Schalten Sie die Pumpen ein, um die Perfusate in einem geschlossenen hydronischen Heizkreislauf zu zirkulieren (eine vollständige Liste der Materialien finden Sie in der Materialtabelle und Inabbildung 1).
    HINWEIS: Ein beheiztes Zirkulierendes Wasserbad wird verwendet, um die wasserummantelten Rohre und Wärmetauscher zu erwärmen.
  5. Reinigen Sie Schläuche und Kammern, indem Sie 2 L einer 1%igen Lösung von Universalwaschmittel in Wasser durch das System laufen lassen. Spülen Sie alle Schlauchkreise und Kammern des Langendorff-Systems mit >4 L gereinigtem Wasser. Führen Sie Pumpen aus, bis das gesamte Wasser aus dem System entfernt wurde.
  6. Fügen Sie einen synthetischen Membranfilter in Übereinstimmung mit den Perfusionspumpen (Polypropylenfilter, Porengröße >5 m) hinzu. Gas enden einen Mikrofaser-Sauerstoffator (Hämofilter) mit 95%O2 und 5%CO2 bei 80 kPa.
    HINWEIS: Bei der Verwendung von Albumin gibt es oft Schaum, der mit Sauerstoffversorgung und/oder der Pumpaktivität durch den Schlauchkreislauf verbunden ist. Eine Antischaumverbindung (Antischaum-Y30-Emulsion) kann periodisch (ca. alle 30 min) zugesetzt werden, um sie bei auftretender Weise zu löschen.
  7. Überprüfen Sie eine Zweipunktkalibrierung (0 und 60 mmHg) für den Drucksensor, der sich über der Aorta oder in der Blasenfalle befindet; bei Bedarf kalibrieren.
  8. Unmittelbar vor der Herzexzision die Medien in das Langendorff-Schlaufersystem gießen. Stellen Sie sicher, dass Perfusate durch Mikrofaser-Sauerstoffgeräte (Hämofilter) geht, die mit sauerstoffhaltigem Perfusat vergast werden, das dann durch Wärmetauscher fließt, um eine Mediaperfusatetemperatur von 37 °C an der Aorta zu halten.
  9. Stellen Sie das zirkulierende Wasserbad auf einige Grad höher als 37 °C, z. B. 42 °C, um den Wärmeverlust während des Austauschs und im gesamten System zu berücksichtigen. Überwachen Sie die zirkulierende Perfusatetemperatur mit Thermoelementen.

2. Herzexzision und Langendorff-Perfusion

  1. Besen Sie das Schwein mit einer intramuskulären (I.M.) Injektion von Ketamin (20 mg/kg) und Xylazin (2 mg/kg) und intubieren sie mit einem Endotrachealrohr. Zur Induktion eine intravenöse (I.V.) Bolusinjektion von Fentanyl (50 g/kg) und Rocuronium (1 mg/kg) verabreichen. Halten Sie die Anästhesie mit inhaliertem Isofluran (0,5 x 3 %), Fentanyl (10 x 25 g/kg) und Pancuronium (1 mg/kg) aufrecht.
    HINWEIS: Für diese Proof-of-Principle-Studie wurden jugendliche Yorkshire-Schweine (14 bis 42 Tage alt, n = 18) verwendet, die von 2,5 bis 10,5 kg Körpergewicht und 18 bis 137 g Herzgewicht reichten(Abbildung 2). Wenn eine zusätzliche Injektion zur Induktion erforderlich ist, kann Ketamin (10 mg/kg) I.M. injiziert werden.
  2. Sobald das Tier vollständig beästhetisiert und nicht ansprechbar ist, führen Sie eine Sternotomie durch, um die aufsteigende Aorta und das rechte Vorhof zu entlarven.
    1. Mit einem Skalpell, machen Sie einen Mittellinienschnitt von der Oberseite des Brustbeins am Brusteinlass, bis zum xiphoiden Prozess. Sezieren Sie mit einer Kauterie (oder Schere) das darunter liegende Fett und den Muskel, bis das Brustbein sichtbar ist.
    2. Aus dem xiphoiden Prozess schneiden Sie das Brustbein mittelseitl durch das Manubrium entweder mit einer chirurgischen Knochenschere oder einer Knochensäge. Setzen Sie Retraktoren in den Schnitt ein, um das Herz freizulegen.
  3. Geben Sie eine Bolusdosis Heparin (300 U/kg) in die rechte Vorhöfe mit einer 18 G Nadel und Spritze, um Fleckengerinnsel bei organizipierender Exzision zu minimieren. Legen Sie saugfähige Pads in die Brusthöhle und Eis um das Herz.
  4. Mit einer Schere vorsichtig durch das Perikard schneiden, die Aorta durch stumpfe Sezieren aus dem umgebenden Bindegewebe isolieren und die Aorta knapp unterhalb des ersten arteriellen Asts auf dem Aortenbogen klemmen. Mit einer 50 ml Spritze mit einer 18 G Nadel eiskalte Kardioplegie (20 ml/kg) durch die Oberseite der aufsteigenden Aorta injizieren.
  5. Schneiden Sie durch die Gefäße, die zum Herzen führen, und entfernen Sie das Herz mit der aufsteigenden Aorta intakt und tauchen Sie das ausgeschnittene Herz in eiskalte Kardioplegie.
  6. Greifen Sie die Wände der Aorta mit einem Paar Hämostate und schieben Sie sie auf eine gerippte Kanüle, die an Schläuchen befestigt ist, was zu 1 L eiskaltem Cardioplegie-Medium führt, das über dem Herzen schwebt (ca. 95 cm, um 70 mm Hg zu liefern). Lassen Sie Flüssigkeit eindringen und füllen Sie die Aorta, bis sie überläuft, um zu verhindern, dass eine Blase in die Vaskulatur eintritt.
    HINWEIS: Die Verwendung eines mechanischen Entkopplers (2,3-Butandion-Monoxim [BDM] oder Blebbistatin) verringert die koronare Perfusionsrate, wenn der Sauerstoffbedarf des Gewebes abnimmt.
  7. Sichern Sie die Aorta an der Kanüle mit Nabelband und verankern Sie sie weiter, indem Sie die Hämostate binden, um das Gewicht des Herzens zu tragen, das jetzt an der Kanüle hängt (Abbildung 1C). Lassen Sie die kalten Medien das Herz bei einem konstanten Druck von 70 mmHg über die Schwerkraft retrofieren. Halten Sie das Herz in kalte Kardioplegie unterGetaucht, bis es bereit ist, auf das erwärmte (37 °C) Langendorff-Perfusionssystem (<10 min) übertragen zu werden.
    HINWEIS: Die Aorta auf kleineren Herzen (<50 g, bis zu 2 Wochen altes Schwein) trägt das Gewicht des Herzens, aber größere Herzen laufen Gefahr, aus der Kanüle zu rutschen. Während der anfänglichen Konnulation und beim Bewegen auf das erwärmte System, verhindern Sie, dass Luft in die Aorta, die koronare Emboli verursachen kann. Verwenden Sie große Bohrungsschläuche (>3/8" Innendurchmesser), mit denen Blasen schneller aufsteigen können als die Lösung, die in die Aorta eintritt.
  8. Übertragen Sie das Herz auf das Langendorff-System (37 °C), ohne Luft in die Kanüle zu bringen. Lassen Sie den normalen Sinusrhythmus die Vaskulatur des verbleibenden Blutes und der Kardioplegie spülen.
    HINWEIS: In der beschriebenen Studie wurde bei isolierten junglichen Ferkelherzen eine durchschnittliche Anfangsdurchflussrate von 184 x 17 ml/min beobachtet. Der Durchfluss sank auf 70 x 7,5 ml/min (mittelwertig SEM), nachdem er mit erwärmten Medien, die einen mechanischen Entkoppler (20 mM BDM) enthalten, durchdren wurde. Tauchen Sie das Herzgewebe nicht unter, da es sich auf die Kardiographie einlassen kann. Die Gewebetemperatur wird durch den koronaren Fluss im Schweineherz aufgrund seines größeren Volumens und seiner kleineren Oberfläche im Vergleich zu Nagetieren aufrechterhalten. Bei vollem Durchfluss lagen die Epicardium- und Endokardtemperaturen zwischen 35 °C und 37 °C.
    ACHTUNG: Tragen Sie bei der Arbeit mit mechanischen Entkopplern geeignete persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Augenverschleiß. Das Herz kann Medien schnell und unerwartet auswerfen.
  9. Defibrilat das Herz im Falle von stoßbaren Arrhythmien (ventrikuläre Tachykardie, Kammerflimmern), indem externe Paddel an der Spitze und Basis des Herzens platziert und liefert einen einzigen Schock bei 5 J, Erhöhung in 5 J-Schritten (oder wie von der Defibrillator) bis 50 J, Kardioversion oder unschockbarer Rhythmus. Wiederholen Sie bei Bedarf Stöße bei 50 J.
    HINWEIS: In der vorgestellten Studie erforderten 89 % der Präparate Defibrillation. Nach dem Ausgleich (ca. 10 min) wurde bei jugendlichen Ferkelherzen eine durchschnittliche Herzfrequenz von 70 x 4,5 bpm (mittelwert- SEM) beobachtet(Abbildung 2).
  10. Spülen Sie das Herz mit mindestens 1 L modifizierten Krebs-Henseleit-Medien, ohne umzukreisen, um Restblut und Kardioplegie zu entfernen. Sobald die Medien klar durch das Herz laufen, schließen Sie die Zirkulaschleife, um Perfusate zu rezirkulieren.

3. Elektrophysiologie-Studie

  1. Um ein Standard-Blei-II-Elektrokardiogramm (EKG) während des gesamten Studiums aufzuzeichnen, befestigen Sie eine 29 G Nadelelektrode an das ventrikuläre Epikardie in der Nähe des Scheitelpunkts, mit einer weiteren Elektrode im rechten Atrium. Schließen Sie die positiven und negativen Eingänge eines Differenziellen Bioverstärkers an den Scheitelpunkt bzw. das rechte Atrium an.
  2. Befestigen Sie eine bipolare Stimuluselektrode an der rechten Vorrarie und eine zweite bipolare Reizelektrode an der seitlichen linken Herzkammer zum Tempo.
  3. Beschleunigen Sie das Herz mit einem elektrophysiologischen Stimulator, wobei der Anfangsstrom auf die doppelte diastolische Schwelle (1 x 2 mA) und eine Pulsbreite von 1 ms35,36eingestellt ist.
    HINWEIS: Wenn die Stimulation keine Reaktion auslöst, kann die Pulsbreite auf bis zu 2 ms erhöht werden. Bei großen koaxialen Elektroden (bipolare Stimulation) wird mehr Strom (ca. 10x) benötigt.
  4. Identifizieren Sie den Temposchwellenwert, indem Sie eine Reihe von Stimulusimpulsen (1,2 mA, 1 ms Pulsbreite) bei definierten Tempozykluslängen (PCL) anwenden, um eine konsistente Stimulusreaktion zu gewährleisten.
    HINWEIS: Sobald die intrinsische Rate festgelegt ist, kann der Anfangsimpulszug mit einer etwas kürzeren PCL beginnen.
  5. Führen Sie extrastimulus tempoing entweder mit einem S1-S1- oder S1-S2-Schrittzug durch, im letzteren folgte ein Zug mit 6 x 8 Impulsen (S1) von einem einzigen Impuls (S2). Verringern Sie den S2-PCL schrittweise um 10 ms (d. h. 200 ms, 190 ms, 180 ms usw.), bis er nicht erfasst werden kann. Steigen Sie auf die vorletzte PCL (d. h. 190 ms) und verringern Sie in 1 ms Intervallen, um die genaueste PCL vor dem Verlust der Erfassung (d. h. 184 ms) zu finden.
    HINWEIS:
    Die gleichen Stimulationsparameter werden sowohl für S1 als auch für S2 (1 x 2 mA, 1 ms Pulsbreite) verwendet. Siehe Abbildung 3 für repräsentative Beispiele oder zuvor veröffentlichte Werte zu den Messungen der Schweineherzelektrophysiologie37.
    1. Um die ventrikuläre effektive Feuerfestperiode (VERP) zu bestimmen, verwenden Sie die Reizelektrode am seitlichen linken Ventrikel, um das kürzeste S1-S2-Intervall zu identifizieren, bei dem der S2 (vorzeitiger Schlag) eine ventrikuläre Depolarisation initiiert.
      HINWEIS: Die Feuerfestperiode ist das kürzeste erreichbare S1-S2-Kupplungsintervall.
    2. Um die Wenckebach-Zykluslänge (WBCL) zu definieren, verwenden Sie die Reizelektrode auf dem rechten Atrium, um das kürzeste S1-S1-Intervall zu finden, bei dem sich 1:1 atrioventrikuläre Leitung über den normalen Leitungsweg fortausbreitet.
      HINWEIS: Andernfalls stellt dies einen2. Grad Herzblock dar.
    3. Um die Sinusknoten-Wiederherstellungszeit (SNRT) zu definieren, verwenden Sie die Stimuluselektrode auf dem rechten Atrium, um einen Schrittzug (S1-S1) anzuwenden und die Zeitverzögerung zwischen dem letzten Impuls im Schrittzug und der Wiederherstellung spontaner sinoataler Knoten-vermittelter Aktivität zu messen.
    4. Um eine atrioventrikuläre Knoten-effektive Feuerfestperiode (AVNERP) zu etablieren, verwenden Sie die Reizelektrode auf dem rechten Atrium, um das kürzeste S1-S2-Kopplungsintervall zu finden, bei dem auf die vorzeitige Vorhofstimulation ein Sein Bündelpotential folgt, das ein QRS auslöst. Komplex, der eine ventrikuläre Depolarisation bedeutet.

4. Optische Kartierung von Transmembranspannung und intrazellulärem Calcium

HINWEIS: Ein mechanischer Entkoppler sollte verwendet werden, um Bewegungsartefakte während der optischen Kartierung zu minimieren und Hypoxie3,38,39,40zu vermeiden. (-/-) Blebbistatin (5 m zirkulierende Konzentration) kann langsam als Bolusdosis von 0,5 mM in 5 ml Perfusat (100x Endkonzentration)41zugesetzt werden. Alternativ kann BDM zunächst in die perfusaten Medien mit einer zirkulierenden Konzentration von 20 mM aufgenommen werden.

  1. Bereiten Sie den Spannungsfarbstoff vor, indem Sie 5 mg RH237 in 4 ml wasserfreies DMSO auflösen. Den Farbstoff aliquot mit bis zu 5 ml Medien und Wirbel verdünnen. Fügen Sie rh237 (62,1 g pro 500 ml Perfusat) proximal in die Aortenkanüle ein.
    HINWEIS: Das Myokardgewebe kann bei Bedarf während der gesamten Dauer des Experiments erneut mit RH237 gefärbt werden.
  2. Bereiten Sie den Calciumfarbstoff vor, indem Sie 1 mg Rhod2-AM in 1 ml wasserfreies DMSO auflösen. Mischen Sie den Farbstoff mit 50 l Pluronsäure, legen Sie ihn bis zu 10 min in ein 37 °C-Beschallungsbad und verdünnen Sie ihn dann mit bis zu 5 ml Medien. Fügen Sie den Calciumfarbstoff (50 g pro 500 ml Perfusat) proximal in die Aortenkanüle ein.
    HINWEIS: Um eine gleichmäßige Färbefärbung zu gewährleisten, sollten Farbstoffe langsam zugegeben werden (>30 s). Rhod-2AM benötigt bis zu 10 min, um die Maximale Fluoreszenz zu erreichen, während RH237 das Herz innerhalb von 1 x 2 min färbt. Mit der beschriebenen Farbbelastung sind Signal-Rausch-Verhältnisse (SNR) von 42 bis 86 bzw. 35 bis 69 für Spannung bzw. Kalzium zu erwarten. SNR-Werte können als SNR = (Peak-to-Peak-Zahlen)/(Standardabweichung während des diastolischen Intervalls)42berechnet werden.
  3. Positionieren Sie die Bildverarbeitungshardware (Kamera, Bildspalter, Objektiv) wie in Abbildung 1dargestellt, um sich auf ein entsprechendes Sichtfeld zu konzentrieren.
    HINWEIS: Der Splitter ist mit einem dichroitischen Spiegel (660+ nm) konfiguriert, der RH237 passiert und Rhod2-Emissionsspektren reflektiert. Für den ausgesendeten Rh237 (710 nm langen Pass) und Rhod2 (585 x 40 nm) emittierten Licht (Langpass ET710, siehe Materialtabelle)werden hochtransmissionsfreie Emissionsfilter eingesetzt. An der Vorderseite des Bildteilers ist ein Breitpupillobjektiv mit 50 mm/F0,95l befestigt. Diese Konfiguration führt zu einer ausreichenden Emissionslichttrennung, wie zuvor validiert43,44.
  4. Verbinden Sie die Kamera mit einer Workstation und erfassen Sie Bilder mit ausgewählter Software, mit einer Belichtungszeit von 0,5 bis 2 ms. Führen Sie die Bildausrichtung mit Hilfe von Software durch, die die gewünschten Bereiche aufteilen, überlagern und eine Graustufensubtraktion oder Pseudofarbe anzeigen kann. um Fehlausrichtung hervorzuheben (siehe Tabelle der Materialien für Software-Option).
  5. Schalten Sie das Raumlicht aus, um Fluoreszenzstörungen durch Umgebungsbeleuchtung zu minimieren. Testen Sie die LED-Leuchten (525 nm, 1,4 mW/mm2) vor Beginn der Bildgebung, um eine gleichmäßige und maximale Epikartodinvierbeleuchtung zu gewährleisten, wie durch die Brunnentiefe des Sensors bestimmt wird.
    HINWEIS: Jedes Licht wird durch einen Anregungsfilter (535 x 25 nm) geleitet. LED-Leuchten können vor dem Filmen manuell ausgelöst werden, um die Signallinearität zu maximieren. Die emittierte Fluoreszenz aus dem Epikardium wird durch den Bildteiler und die Emissionsfilter geleitet. Split-Bilder werden auf einen Hochgeschwindigkeitssensor projiziert. Das Sichtfeld beträgt ca. 12 cm x 10 cm oder 5,9 cm x 4,7 cm für jedes geteilte Bild, je nach Wahl der Linse und Entfernung vom Herzen.
  6. Für optische Kartierungsstudien stellen Sie das Myokard während des Sinusrhythmus, des Kammerflimmerns(Abbildung 4) oder des dynamischen Tempos (S1-S1, 1,2 mA, 1 ms Pulsbreite) über eine Stimulationselektrode auf dem linken Ventrikel (Abbildung 5) ab. Beginnen Sie mit einer Schrittzykluslänge von 350 ms und einer Dekrementierung um 10 bis 50 ms, um Restitutionskurven zu erzeugen (Abbildung 5E)35,36.

5. Aufräumen

  1. Entfernen Sie das Herz aus dem System und entleeren Sie alle Perfusate. Spülen Sie die Systemschläuche und Kammern mit gereinigtem Wasser.
  2. Für die routinemäßige Wartung spülen Sie das System bei Bedarf periodisch mit Waschmittellösung oder einer verdünnten Wasserstoffperoxidlösung ab.

6. Datenverarbeitung

  1. Bestätigen Sie die optische Signalqualität während der gesamten Studie, indem Sie eine Videodatei öffnen, einen Bereich von Interesse auswählen und die mittlere Fluoreszenz im Laufe der Zeit mithilfe eines geeigneten Softwarepakets oder benutzerdefinierten Algorithmus zeichnen.
  2. Analysieren Sie bildgebende Daten wie zuvor beschrieben23,33,43,45,46, um das Aktionspotenzial und die transienten zeitlichen Parameter, einschließlich Aktivierungszeit, zu quantifizieren. Spannungs-Calcium-Kopplungszeit (Differenz zwischen Vm- und Ca-Aktivierungszeiten) und Repolarisationsdauermessungen.
    1. Wenden Sie Schwellenwerte an, um fluoreszierende Epikardialpixel zu isolieren und laute Hintergrunddaten zu verwerfen.
      HINWEIS: Durch Schwellenwerte wird die Analyse großer Videos vereinfacht und beschleunigt.
    2. Räumliche Filteroptische Signale über eine epikardiale Oberfläche mit Kerngrößen von 3 mm x 3 mm bis 5 mm x 5 mm, wie in Abbildung 4 und Abbildung 5dargestellt.
      HINWEIS: Letzteres wird die SNR verbessern, ohne mögliche Wirkungspotentiale, Kalziumtransientmorphologie oder Gesamtkontur der Wellenfronten19,47zu verzerren. Dies kann nicht erforderlich sein, wenn Sie einen Sensor mit großen Pixeln verwenden oder wenn Sie während der Erfassung binning.
    3. Zeitliche Filtersignale mit einem digitalen Tiefpassfilter (z.B. Butterworth 5. Ordnung) mit einer Grenzfrequenz zwischen 100 und 75 Hz, um unbedeutende Signalinhalte45zu eliminieren.
      HINWEIS: Siehe Abbildung 5C für ein Beispiel für repräsentative verarbeitete Ablaufverfolgungen.
    4. Wenden Sie Driftentfernung und Subtraktion über Nth-Order-Polynom-Fitting an, um die Auswirkungen von Photobleichungen, Bewegung oder anderen signifikanten Variationsquellen zu minimieren.
    5. Nach der Verarbeitung und Normalisierung optischer Daten über ein ganzes Video, berechnen Sie Daseinwirkungspotenzial und Kalzium transiente Parameter von Interesse. Bestimmen Sie die Aktivierungszeit, definiert als die Zeit der maximalen Ableitung während der Depolarisation, und die Spitzenfluoreszenz, um die prozentualen Zeiten und Perioden der Repolarisation zu berechnen (Aktionspotenzialdauer [APD] und [Ca2+]i Dauer [CaD], siehe Abbildung 5).
    6. Nachdem zeitliche Parameter berechnet wurden, generieren Sie isochronale Karten, um Aspekte eines einzelnen Aktionspotentials oder Kalziumtransienten über die gesamte abgebildete Epikardialoberfläche mithilfe benutzerdefinierter Algorithmen23,33, 43,45,46.
      HINWEIS: Siehe Abbildung 5D für ein Beispiel.

Representative Results

Abbildung 1A zeigt ein Diagramm des isolierten Herzperfusionssystems, das den Schlauchkreislauf, die Pumpe, den Filter, den Sauerstoffator, die Reservoirs und Diebeselemente umfasst. Die Platzierung der EKG-Elektroden (Lead-II-Konfiguration) und der Tempoelektroden ist in Abbildung 1Bdargestellt, und die Bildgebung s.i.z. ist in Abbildung 1Cdargestellt. Ein Schaltplan der optischen Komponenten und Lichtpfade ist in Abbildung 1Ddargestellt.

Experimentelle Studien wurden an intakten, ganzen Herzen durchgeführt, die von junggebliebenen Yorkshire-Schweinen isoliert wurden (14 bis 42 Tage, n = 18), die von 2,5 bis 10,5 kg Körpergewicht und 18 bis 137 g Herzgewicht reichten(Abbildung 2A). Nach der Übertragung des isolierten Herzens auf ein Langendorff-System (37 °C) stabilisierte sich die Herzfrequenz innerhalb von 10 min Defibrillation auf 70 x 4,5 bpm (mittelwert) und blieb während der gesamten Studiendauer konstant (Abbildung 2B). Es wurde ein durchschnittlicher Durchfluss von 184 x 17 ml/min (mittelwert ig SEM) gemessen, der sich auf 70 x 7,5 ml/min verlangsamte, nachdem er mit erwärmten Medien, die einen mechanischen Entkoppler enthielt, durchdrung war (Abbildung 2C).

Blei-II-EKGs wurden während der gesamten Dauer der Studie während des Sinusrhythmus (Abbildung 3A) oder als Reaktion auf externes Tempo (Abbildung 3B-E) zur Quantifizierung elektrophysiologischer Parameteraufgezeichnet. Für die EP-Bewertung wurde das dynamische Tempo (S1-S1) auf das rechte Atrium angewendet, um die WBCL und SNRT (Wiederherstellungszeit nach Beginn von S1-S1, Abbildung 3C) zu bestimmen, wobei WBCL als die kürzeste PCL bezeichnet wurde, die eine Probe zur ventrikulären Leitung einleitete. Ein S1-S2-Schrittprotokoll wurde mit einer bipolaren Stimuluselektrode am linken Ventrikel implementiert, um das kürzeste Kopplungsintervall zu identifizieren, das eine ventrikuläre Depolarisation initiierte, wodurch VERP ermittelt wurde (Abbildung 3D). Alternativ wird ein S1-S2-Trial-Tempoprotokoll angewendet, um AVNERP (S1-S2) zu lokalisieren, wie in Abbildung 3Edargestellt. Repräsentative Beispiele für die Parameter der Schweineherzelektrophysiologie stimmen eng mit den zuvor veröffentlichten37überein.

Optische Kartierungsexperimente wurden während des Sinusrhythmus, des spontanen Kammerflimmerns(Abbildung 4) oder während des dynamischen Tempos (S1-S1) des linken Ventrikels (LV) durchgeführt, um elektrische und Kalzium-Restitutionskurven zu erzeugen, die in Abbildung 5. Repräsentative Bilder eines mit Farbstoffen belasteten Ferkelherzens sind in Abbildung 4 mit entsprechenden optischen Wirkungspotentialen (Vm) und Calcium (Ca)-Transienten dargestellt, die aus zwei Interessenbereichen auf der Epikardenoberfläche (rechte Herzkammer [RV] = blau, LV = rot) gesammelt wurden. . Unverarbeitete Signale werden während des Sinusrhythmus und beim Kammerflimmern angezeigt. Wie bereits erwähnt, wurde dynamisches Epikardial-Pacing (S1-S1) auch bei optischen Kartierungsexperimenten verwendet, um einen geringfügigen Unterschied in der intrinsischen Herzfrequenz zu normalisieren (Abbildung 5A-E). Es werden Rohe Signale (RV = blau, LV = rot) angezeigt, die verwendet wurden, um das Aktionspotential darzustellen — Kalziumtransiente Kopplungszeit (Abbildung 5C), Aktivierung und Dauer (Abbildung 5D), elektrische und Kalziumrestitution (Abbildung 5E). Für dicke myokardische Präparate eignet sich die räumliche Filterung mit einer Kerngröße von 3 mm x 3 mm für epikardiale Wirkungspotentiale oder Kalziumtransientenanalyse19,47. Dementsprechend werden Bilder mit hoher räumlicher Auflösung (in den beschriebenen Setup1240 x 1024 insgesamt oder 620 x 512 pro Kanal, 6,5 m Pixelgröße) oft räumlich während oder nach der Erfassung(Abbildung 5C)abgetrennt. Die Bildverarbeitung kann durchgeführt werden, um Aktivierungs- und Repolarisationskarten mit benutzerdefinierten Algorithmen23,33,43,45 ( Abbildung3D) zu generieren. Jedes Pixel auf dem Herzen wurde als die maximale Ableitung des Aktionspotentials oder des kalziumtransienten Aufschlags definiert.

Figure 1
Abbildung 1: Versuchsaufbau. (A) Diagramm des isolierten Herzperfusionssystems; Pfeile bezeichnen die Strömungsrichtung. (B) Ein kanüliertes Herz wird mit Elektrodenplatzierung angezeigt. RA = rechte Vorhöfin, RV = rechter Ventrikel, LV = linker Ventrikel, EKG = Blei-II-Elektrokardiogramm. (C) Die bildgebende Plattform in unmittelbarer Nähe zum Herzgewebe. (D) Die Emission jeder komplementären Sonde (Spannung, Kalzium) wird durch Wellenlänge durch eine Bildspaltungsvorrichtung mit geeigneten Emissionsfiltern und dichroitischem Spiegel getrennt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Herzgewichts-, Raten- und Durchflussmessungen. (A) Verhältnis von Herzgewicht zu Körpergewicht für jedes in der Studie verwendete Ferkel (n = 18). (B) Herzfrequenz gemessen 10 min nach Defibrillation und wieder am Ende der Studie (ca. 1 h). (C) Der koronare Fluss sinkt nach perfusion mit einem mechanischen Entkoppler (+BDM) aufgrund des reduzierten Sauerstoffbedarfs steil ab. Maßstabsleisten stehen für den Mittelwert SEM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Repräsentative Beispiele für Blei-II-Elektrokardiogrammaufnahmen, die während des Sinusrhythmus oder als Reaktion auf externes Tempo gesammelt wurden. (A) Normaler Sinusrhythmus. (B) Beispiel für epikardiale Pacing bei einer Zykluslänge von 400 ms (S1-S1), das für bildgebende Experimente verwendet wurde. (C) Oben: Vorhofschritt zur Identifizierung von WBCL; eine erfolgreiche Erfassung wird bei S1 = 250 ms beobachtet, wobei eine vorgerichtliche bis ventrikuläre Leitung beobachtet wird. Beachten Sie, dass Vorhof-Tempo verwendet werden kann, um SNRT zu bestimmen (Zeit bis zur Sinusknotenentladung, nach Beginn des externen Tempos). Unten: Da die S1-Zykluslänge auf 205 ms verringert wird, schlägt die Leitung zum Ventrikel fehl. (D) Oben: Epikardiale Schrittdieses (S1-S2) zur Identifizierung von VERP; Eine erfolgreiche Erfassung wird bei S1 = 450 ms beobachtet, S2 = 300 ms. Unten: Da die S2-Zykluslänge auf 250 ms verringert wird, kann das ventrikuläre Gewebe nicht erfassen. (E) Vorhof-Tempo (S1-S2) zur Identifizierung von AVNERP. Oben: Erfolgreiche Erfassung wird bei S1 = 450 ms beobachtet, S2 = 200 ms. Unten: Da die S2-Zykluslänge auf 199 ms verringert wird, schlägt die Leitung zum Ventrikel fehl. Blaue Pfeile bezeichnen Tempospitzen, rote Pfeile bezeichnen die Erfassung ('C') oder keine Erfassung ('NC'). S1-S1 = dynamisches Tempo, S1-S2 = Extrastimulus-Tempo. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Optische Daten während des Sinusrhythmus und des Kammerflimmerns. Links: Repräsentative Bilder eines mit Farbstoffen beladenen Schweineherzens (Vm = Spannung, RH237; Ca = Calcium, Rhod2), vordere Ansicht. Räumlich gefilterte Transmembranspannung und intrazelluläre Calciumfluoreszenzsignale eines Schweineherzens während des Sinusrhythmus (Mitte). Spannungs- und Kalziumsignale beim Kammerflimmern (rechts). Die Größe des Signalbereichs (15 x 15 Pixel = 2,4 x 2,4 mm2, 30 x 30 = 4,8 x 4,8 mm2 Kernelgröße) wird als rote und blaue Quadrate dargestellt. Einheiten = F/F. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Optische Daten von Langendorff-durchfundierten Schweineherzen. Unverarbeitete, räumlich gefilterte (A) Transmembranspannung und (B) intrazelluläre Calciumfluoreszenzsignale von den rechten und linken Ventrikeln während des elektrischen Tempos an der Spitze. Ungefilterte, räumlich gemittelte Signale zeigen optische Aktionspotentiale und Kalziumtransienten aus Interessengebieten (Signaleinheiten sind F/F). (C) Eine Überlagerung normalisierter Transienten veranschaulicht die Wirkungspotential-Calcium-Transienten-Kopplungszeit (Tiefpass gefiltert bei 75 Hz). (D) Verarbeitung von Signalen über die Epikardinle, um isochronale Karten von zeitlichen Parametern zu erzeugen, einschließlich Aktivierungszeit(t-Akt) und 80% Repolarisationszeit. (E) Elektrische und kalziumtransiente Restitutionskurven, die bei mehreren Frequenzen (links) mit statistischer Analyse (rechts) erzeugt werden, um längere Repolarisationszeiten bei langsameren Taktzykluslängen zu veranschaulichen. Skalenbalken = Mittelwert - SEM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Chemische Formel Molekülmasse g/L
Natriumchlorid Nacl 58.44 5.26
Natriumglukonat C6H11NaO7 218.14 5.02
Natriumacetat-Trihydrat C2H3NaO2•3H2O 136.08 3.68
Kaliumchlorid Kcl 74.55 0.63
Magnesiumchlorid (wasserfrei) MgCl2 95.21 0.1405
8,4% Natriumbicarbonat NaHCO3 84.01 13
Mannitol C6H14O6 182.17 16.3
Magnesiumsulfat MgSO4 120.37 4
Ph 7.4
Osmolarität (mOsmol/L) 294

Tabelle 1: Geändertes cardioplegia-Rezept von del Nido.

Discussion

Obwohl kardiovaskuläre Forschungsmodelle von zellulären bis hin zu In-vivo-Präparaten reichen, besteht ein inhärenter Kompromiss zwischen klinischer Relevanz und experimenteller Nützlichkeit. In diesem Spektrum bleibt das isolierte Langendorff-perfundierte Herz ein nützlicher Kompromiss für das Studium der Herzphysiologie48. Das gesamte Herzmodell stellt ein höheres Maß an funktioneller und struktureller Integration dar als Einzelzellen- oder Gewebemonolayer, vermeidet aber auch die verwirrenden Komplexitäten, die mit In-vivo-Modellen verbunden sind. Ein großer Vorteil bei zwei optischen Kartierungsexperimenten ist, dass die Epikardinatidiale Oberfläche des isolierten Herzens beobachtet werden kann und fluoreszenzbildgebungsbildende Transmembranpotential und Kalziumhandhabung zur Überwachung der Herzphysiologie34verwendet werden können.

Nagetiermodelle werden am häufigsten für isolierte Herzpräparate im Gegensatz zu größeren Tieren verwendet, was zum Teil auf die damit verbundenen Kosten für die Aufdimensionierung aller beteiligten Elemente zurückzuführen ist (z. B. Lösungsvolumen, Perfusionskreislauf, Farbmenge und mechanische Entkoppler). zusammen mit größerer Instabilität und Neigung für Arrhythmien bei größeren Tieren10,36,49. Ein Vorteil bei der Verwendung von Schweineherzen ist, dass sie dem menschlichen Herzen in Struktur, Größe und Kontraktionsrate sehr ähnlich sind, wodurch hämodynamische Parameter wie koronare Durchblutung und Herzleistung genauer modelliert werden. Ebenso haben Menschen und Schweine ähnliche Kalziumhandhabung, Elektrokardiogrammintervalle37und Aktionspotential Morphologie einschließlich der zugrunde liegenden Kanäle, dass es12,50,51, 52. Dieses Protokoll beschreibt detailliert die Schritte zur Erstellung eines reproduzierbaren großen Tiermodells, um die Myokardfunktion umfassend zu charakterisieren. Die gleichzeitige Bildgebung von Transmembranspannung (RH237) und intrazellulärem Kalzium (Rhod2), das in Verbindung mit etablierten elektrophysiologischen Protokollen verwendet wird, bietet die Möglichkeit, Mechanismen zu lokalisieren, die für veränderte Funktion. Die beschriebene Methodik kann für präklinische Sicherheitstests, toxikologische Seuchen und die Untersuchung genetischer oder anderer Krankheitspathologien verwendet werden. Darüber hinaus kann die beschriebene Methodik für den Einsatz mit anderen Herzmodellen (z.B. Wein, Mensch) je nach Forschungsschwerpunkt53,54,55modifiziert und angepasst werden.

Beim Übergang von einem kleineren Nagetiermodell zu einem größeren Schweinemodell für isolierte, ganzherzige Präparate sind einige wichtige Änderungen zu beachten. Während der Vorbereitung und Einrichtung empfehlen wir, albumin in die Perfusate aufzunehmen, um den Onkotischen Druck aufrechtzuerhalten und Ödeme (plus Antischaum, falls erforderlich)56,57,58,59zu reduzieren. Darüber hinaus kann Perfusate, das Albumin enthält, auch in Stoffwechselstudien helfen, die auch eine Fettsäure-Supplementierung zu den Medien erfordern60,61. Im Gegensatz zu Nagetierherzen muss das größere Schweineherz aufgrund seines geringeren Oberflächen-Volumen-Verhältnisses und des erhöhten Volumens erwärmter Medien, die durch die Herzkranzgefäße fließen, die Temperatur besser halten, nicht in warme Medien getaucht werden. Wie bereits erwähnt, platzierten wir Temperatursonden innerhalb des rechten Ventrikels und auf der Epikardialoberfläche sowohl der rechten als auch der linken Ventrikel, wodurch an allen drei Stellen der Studie nur geringe Temperaturschwankungen von 1 bis 2 °C beobachtet wurden. Wichtig ist, dass solche schnelleren Durchflussraten auch die Wahrscheinlichkeit von Blasen und einer potenziellen Embolie erhöhen können. Um dieses Problem zu umgehen, empfehlen wir die Verwendung einer Blasenfalle mit großen Bohrungsschläuchen, die direkt zur Aortenkanüle führen. In ähnlicher Weise fanden wir es am nützlichsten, zwei Personen zu haben, die zusammen arbeiten, um die Aorta auf einem größeren (und schwereren) Herzen zu kleben; eine Person, um die Aorta offen mit robusten Hämostaten zu halten und eine andere, um die Aorta an der Kanüle mit Nabelband zu sichern. In der beschriebenen Methodik fanden wir heraus, dass Perfusion mit Kardioplegie und Defibrillation für die Herzerholung von entscheidender Bedeutung sind, was im Gegensatz zu Nagetierherzpräparaten steht. Nach unserer Erfahrung nahmen nur wenige ausgeschnittene Herzen die normale Sinus-getriebene Aktivität ohne Kardioversion wieder auf.

Um optische bildgebende Endpunkte zu verbessern, schränkte ein hängendes Herzpräparat die Wirkung von Blendung ein, die bei einem untergetauchten Herzen auftreten kann. Darüber hinaus vermeidet das hängende Herz auch jede Kompression oder Gefährdung der Herzkranzgefäße auf dem hinteren Aspekt des Herzens, die auftreten können, wenn das Herz horizontal für vertikale Bildgebung nach unten gelegt wird. Wir fanden auch heraus, dass das Laden von Fluoreszenzfarbstoffen nach der Blasenfalle (in der Nähe der Aortenkanüle) die Gewebefärbung und optische Signale erheblich verbesserte. Um die Endpunkte der Herzelektrophysiologie zu verbessern, erleichterte die Verwendung einer größeren koaxialen Stimulationselektrode ein erfolgreiches Vorhoftempo. Obwohl wir die Verwendung von Elektrokardiogrammen beschreiben, um die Erfassung und den Verlust der Erfassung für verschiedene EP-Parameter zu identifizieren, können auch intrakardiale Katheter oder bipolare Aufzeichnungselektroden verwendet werden.

Unsere Studie konzentrierte sich auf die Entwicklung einer Methodik für die duale optische Kartierung und die elektrische Beurteilung von Herz in einem isolierten, intakten Schweineherzmodell. Aufgrund von Ähnlichkeiten mit dem jugendlichen menschlichen Herz bleibt das Schweineherz ein beliebtes Modell für Studien, die sich auf die pädiatrische Kardiologie oder angeborene Herzfehler konzentrieren. Wichtig ist, dass der beschriebene Ansatz an die Verwendung mit größeren Erwachsenenherzen und/oder verschiedenen Arten von Interesse angepasst werden kann. In der Tat können andere Laboratorien feststellen, dass die Verwendung von Hund oder menschlichen Herzen (entweder Spender oder erkrankt) für ihren spezifischen Forschungsschwerpunkt53,54,55besser anwendbar sind. Eine weitere mögliche Einschränkung dieser Studie ist die Verwendung eines mechanischen Entkopplers, um Bewegungsartefakt während der Bildgebung zu reduzieren. Blebbistatin ist aufgrund seiner minimalen Auswirkungen auf EKG-Parameter, Aktivierung und Feuerfestperioden41,62,63zum Entkoppler der Wahl in kardialen Bildgebungsanwendungen geworden. BDM ist eine kostengünstigere Wahl, die besonders wichtig in großen Tierstudien sein kann, die größere Mengen an Perfusaten und mechanischen Entkopplern erfordern, aber es ist bekannt, dass es einen größeren Einfluss auf Kalium- und Kalziumströme hat, die das Wirkungspotenzial verändern können. Morphologie64,65,66,67. Wenn BDM verwendet wird, beachten Sie, dass APD-Verkürzung erhöht die Herz-Anfälligkeit für schockinduzierte Arrythmias68. Umgekehrt ist die Hauptbeschränkung für die Verwendung von Blebbistatin seine Lichtempfindlichkeit und Phototoxizität, obwohl alternative Formulierungen, die diese Effekte reduziert haben69,70,71. Schließlich nutzt die beschriebene Methodik ein einziges Kamerasystem für duale optische Kartierungsexperimente, aber es ist wichtig zu beachten, dass Forschungsstudien, die sich auf Kammerflimmern und/oder die Verfolgung elektrischer Wellen über die Epikardinatäre konzentrieren. dieser Ansatz müsste geändert werden, um dreidimensionale Panorama-Bildgebung einzubeziehen, wie von anderen15,19,72,73,74,75 beschrieben .

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Die Autoren danken Dr. Matthew Kay für seine hilfreiche experimentelle Anleitung und Manelle Ramadan und Muhaymin Chowdhury für technische Hilfe. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (R01HL139472 bis NGP, R01 HL139712 to NI), Children es Research Institute, Children es National Heart Institute und Sheikh Zayed Institute for Pediatric Surgical Innovation unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(-)-Blebbistatin Sigma-Aldrich B0560-5MG Mechanical Uncoupler
2,3-Butanedione monoxime (BDM) Sigma-Aldrich B0753-100G Mechanical Uncoupler
Albumin Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A9418
Analog signal interface emka Technologies itf16USB
Antifoam Sigma-Aldrich A5758-250ML
Antifoam Y-30 Emulsion Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A5758
Aortic cannula, 5/16” Cole-Parmer 45509-60
Bubble trap Sigma-Aldrich CLS430641U-100EA
CaCl2 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ C77-500
Camera, sCMOS Andor Technology Zyla 4.2 PLUS
Coaxial stimulation electrode (atria) Harvard Apparatus 73-0219
Defibrillator Zoll M Series
Dichroic mirror Chroma Technology T660lpxrxt-UF2
Differential amplifier Warner Instruments DP-304A
Emission filter, calcium Chroma Technology ET585/40m
Emission filter, voltage Chroma Technology ET710lp
EP stimulator (Bloom) Fisher Medical DTU-215B
Excitation filter Chroma Technology CT510/60bp
Excitation lights Thorlabs SOLIS-525C
Filter McMaster-Carr 8147K52
Filter cartridge, polypropylene Pentair PD-5-934
Filter housing McMaster-Carr 9979T21
Flow transducer Transonic ME6PXN
Glucose Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 158968
Heating coil Radnoti 158821
Hemofilter Hemocor HPH 400
Hemostatic Forceps World Precision Instruments 501326
Image Splitter Cairn Research OptoSplit II
KCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO P3911
KH2PO4 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ 423-316
Large-bore tubing, I.D. 3/8” Fisher Scientific 14-169-7H
Lens 50 mm, 0.95 f-stop Navitar DO-5095
Metamorph Molecular Devices Image Alignment
MgSO4 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M-7506
Mucasol detergent Sigma-Aldrich Z637181-2L
Na Pyruvate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO P2256
NaCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S-3014
NaHCO3 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ S-233
Needle Electrodes 29 G, 2 mm AD Instruments Inc. MLA1204
Noise eliminator Quest Scientific Humbug
Perfusion pump PolyStan A/S 1481
Pressure transducer World Precision Instruments BLPR2
Reservoir, 2 L Cole-Parmer UX-34541-07
RH237 AAT Bioquest Inc. 21480
Rhod2-AM AAT Bioquest Inc. 21062
Stimulation electrode (ventricle) Harvard Apparatus 73-0160
Surgical Suture McKesson Medical-Surgical 890186
Transducer amplifier World Precision Instruments TBM4M
Tubing flow console Transonic TS410
Umbilical tape Jorvet J0025UA
Water bath/circulator VWR 89400-970
Surgical Tools
Bandage shears Harvard Apparatus 72-8448 Lister Bandage Scissors, Angled, Blunt/Blunt, 42.0 mm blade length, 17.0 cm
Electrocautery Dalwha Corp. Ltd. BA2ALD001 Model: 200 Basic
Hemostat Roboz RS-7476 St Vincent Tube Occluding Forceps
Hemostatic forceps Harvard Apparatus 72-8960 Hartmann Hemostatic Forceps, Curved, Serrated 2.2 mm tip width, 9.5 cm
Hemostats Harvard Apparatus 72-8985 Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Curved, Serrated, 2 mm tip 14 cm
Mayo scissors WPI 501749 14.5 cm, Straight
Metzenbaum scissors WPI 501747 11.5 cm, Straight
Mosquito forceps Harvard Apparatus 72-8980 Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Straight, Smooth, 2 mm tip width 12 cm
Needle holder Harvard Apparatus 72-8828 Webster Needle Holders, Straight, Smooth,13.0 cm overall length
Pediatric cross clamp Roboz RS-7660 Cooley-Derra Clamp 6.25" 5 mm Calibrations
Right angle forceps WPI 501240 Baby Mixter Hemostatic Forceps, 14 cm, Right Angle
Scalpel Ted Pella 549-4 Scalpel Handle No. 4, 13.7 cm Stainless Steel and 10 No. 22 Blades
Scissors Harvard Apparatus 72-8380 Operating Scissors, Straight, Blunt/Blunt, 42 mm blade,12 cm
Straight Serrated forceps WPI 500363 Dressing Forceps 15.5 cm
Towel clamp WPI 501700 Backhaus Towel Clamp, 13 cm, Curved, Locking handle, SS
Weitlaner retractor WPI 501314 Weitlaner Retractor, Self-Retaining, 10.2 cm, 2x 3 Sharp Prongs
Disposables
3-0 prolene suture Various vendors Various vendors
Vessel loop Aspen surgical 011001PBX Sterion® Vessel Loop, 0.8 mm x 406 mm
Cardioplegia (Plegisol) Pfizer 00409-7969-05 Plegisol; St Thomas crystalloid cardioplegia solution 20 mL/kg
Heparin Various vendors Various vendors 300 U/kg
Syringe and Needle Various vendors Various vendors 60 mL & 18 G respectively
Umbilical tape Ethicon U12T

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References

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