Identificación de nuevos reguladores de la transpiración de plantas mediante el cribado térmico de imágenes a gran escala en Helianthus Annuus

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Biology

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Summary

Proporcionamos un método para identificar moduladores de transpiración foliar mediante cribado a gran escala de una biblioteca compuesta.

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Guo, K., Mellinger, P., Doan, V., Allen, J., Pringle, R. N., Jammes, F. Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus. J. Vis. Exp. (155), e60535, doi:10.3791/60535 (2020).

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Abstract

La adaptación de las plantas a las tensiones bióticas y abióticas se rige por una variedad de factores, entre los que la regulación de la apertura estomatal en respuesta al déficit de agua o patógenos juega un papel crucial. La identificación de moléculas pequeñas que regulan el movimiento estomatal puede contribuir, por lo tanto, a comprender la base fisiológica por la que las plantas se adaptan a su entorno. Los enfoques de cribado a gran escala que se han utilizado para identificar los reguladores del movimiento estomatal tienen limitaciones potenciales: algunos dependen en gran medida de la vía de señalización hormonal del ácido abscés (ABA), excluyendo así los mecanismos independientes de la ABA, mientras que otros dependen de la observación de efectos fisiológicos indirectos a largo plazo como el crecimiento y desarrollo de las plantas. El método de cribado presentado aquí permite el tratamiento a gran escala de plantas con una biblioteca de productos químicos junto con una cuantificación directa de su transpiración por imágenes térmicas. Dado que la evaporación del agua a través de la transpiración da como resultado un enfriamiento de la superficie de la hoja, las imágenes térmicas proporcionan un enfoque no invasivo para investigar los cambios en la conductancia estomatal a lo largo del tiempo. En este protocolo, las plántulas Helianthus annuus se cultivan hidropónicamente y luego se tratan mediante la alimentación de las raíces, en la que la raíz primaria se corta y se sumerge en el producto químico que se está probando. Las imágenes térmicas seguidas de un análisis estadístico de los cambios de temperatura cotiledóres a lo largo del tiempo permiten la identificación de moléculas bioactivas que modulan la apertura estomatal. Nuestros experimentos de prueba de concepto demuestran que un producto químico se puede llevar desde la raíz cortada hasta el cotilería de la plántula de girasol en 10 minutos. Además, cuando las plantas son tratadas con ABA como un control positivo, se puede detectar un aumento en la temperatura de la superficie de la hoja en cuestión de minutos. Nuestro método permite así la identificación eficiente y rápida de nuevas moléculas que regulan la apertura estomatal.

Introduction

La tolerancia al estrés en las plantas es un rasgo poligénico influenciado por una variedad de características y mecanismos moleculares, celulares, de desarrollo y fisiológicos1. Las plantas en un entorno fluctuante necesitan modular continuamente sus movimientos estomatales para equilibrar la demanda fotosintética de carbono manteniendo el agua suficiente y previniendo la invasión de patógenos2; sin embargo, los mecanismos por los cuales se toman estas "decisiones" de compensación se entienden mal3. La introducción de moléculas bioactivas en las plantas puede modular su fisiología y ayudar a sondear nuevos mecanismos de regulación.

El cribado a gran escala de moléculas pequeñas es una estrategia eficaz utilizada en el descubrimiento de fármacos contra el cáncer y ensayos farmacológicos para probar los efectos fisiológicos de cientos a miles de moléculas en un corto período de tiempo4,5. En biología vegetal, el cribado de alto rendimiento ha demostrado su eficacia, por ejemplo, en la identificación de la molécula sintética pyrabactin6, así como el descubrimiento del receptor de ácido abscístico (ABA)7,8. Desde entonces, agonistas y antagonistas de los receptores ABA, y pequeñas moléculas capaces de modular la expresión de genes reporteros inducibles ABA han sido identificados9,10,11,12,13,14,15. Los enfoques de cribado de alto rendimiento disponibles actualmente para identificar pequeños compuestos que pueden modular la apertura estomatal tienen algunos inconvenientes: (i) los protocolos que giran alrededor de la vía de señalización ABA pueden impedir la identificación de nuevos mecanismos independientes de aba, y (ii) las estrategias in vivo utilizadas para la identificación de moléculas pequeñas bioactivas dependen principalmente de sus efectos fisiológicos sobre la germinación de semillas o el crecimiento de la plántula, y no en la regulación de la transpiración vegetal por se.

Además, aunque hay muchas maneras de tratar las plantas con moléculas bioactivas, la mayoría de ellas no son adecuadas para un estudio a gran escala del movimiento estomatal. En resumen, las tres técnicas más comunes son la aplicación foliar mediante pulverización o inmersión, tratamiento del sistema radicular y riego radicular. La aplicación foliar no es compatible con las metodologías más comunes y rápidas para medir la apertura estomatal ya que la presencia de gotas en la superficie de la hoja interfiere con la recopilación de datos a gran escala. Las principales limitaciones del riego radicular son los grandes requisitos de volumen de muestra, la retención potencial de los compuestos por elementos en la rizosfera, y la dependencia de la toma activa de raíces.

Aquí, presentamos un método a gran escala para identificar nuevos compuestos que regulan la transpiración de plantas que no necesariamente implican mecanismos DE respuesta a la sequía ABA o conocidos y permite un tratamiento eficiente y confiable de las plantas. En este sistema, las plantas de Helianthus annuus son tratadas utilizando un enfoque de alimentación de raíces que consiste en cortar la raíz primaria de las plántulas cultivadas hidropónicamente y sumergir el sitio de corte en la solución de la muestra. Una vez tratado, el efecto de cada compuesto en la transpiración de las plantas se mide utilizando una cámara termográfica infrarroja. Dado que un determinante importante de la temperatura de la superficie de la hoja es la tasa de evaporación de la hoja, los datos de imágenes térmicas pueden correlacionarse directamente con la conductancia estomatal. El cambio relativo en la temperatura foliar después del tratamiento químico proporciona así un medio directo para cuantificar la transpiración de la planta.

H. annuus es uno de los cinco mayores cultivos de semillas olea-oilenales en el mundo16 y los descubrimientos realizados directamente en esta planta pueden facilitar futuras transferencias de tecnología. Además, las plántulas H. annuus tienen cotiledón grande y plano, así como una gruesa raíz primaria, que era ideal para el desarrollo de este protocolo. Sin embargo, este método se puede adaptar fácilmente a otras plantas y una variedad de compuestos.

Este protocolo se puede utilizar para identificar eficazmente moléculas capaces de desencadenar el cierre estomatal o promover la apertura estomatal, lo que tiene implicaciones importantes para entender las señales que regulan la conductividad estomatal y la adaptación de las plantas al medio ambiente Tensiones.

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Protocol

1. Cultivo de las plantas

  1. Agregue una capa de vermiculita fina de 4 cm de espesor a las bandejas de planta estándar de 10 pulg. x 20 pulgadas (254 mm x 501 mm) sin orificios.
  2. Coloque los soportes de semillas (ver Tabla de Materiales)2 cm de distancia en las bandejas de la planta.
  3. Llene los soportes de semillas con vermiculita.
  4. Coloque una semilla de girasol con su extremo puntiagudo hacia abajo en cada soporte de semilla, empujando hacia abajo para que la mitad de la semilla permanezca expuesta.
    NOTA: Una semilla de girasol es asimétrica y el extremo puntiagudo desde donde emergerá el radio debe apuntar hacia abajo. La colocación adecuada de las semillas es importante, ya que la reorientación de la raíz y el tallo no son posibles dentro de los soportes de semillas. El extremo redondeado de la semilla debe extenderse más allá de la parte superior del soporte de semillas.
  5. Una vez que las semillas estén en su lugar, cúbralas con una capa adicional de 2 cm de espesor de vermiculita fina. Agua por enano desde arriba. La superficie debe permanecer húmeda después de una hora. Si ese es el caso, cubra las bandejas con tapas.
  6. Cultivar plantas en una cámara de crecimiento o un invernadero. Las condiciones recomendadas son una intensidad de luz de 140 mmol fotones-2s-1 y un fotoperiodo de 16 h de luz a 22oC y 9 h de oscuridad a 20oC durante 5 días.
    NOTA: El riego no debe ser necesario a menos que la superficie se seque visiblemente.

2. Configuración del sistema hidropónico

  1. Encuentre un recipiente de tamaño adecuado para el cultivo hidropónicamente de plantas. El tamaño del envase debe adaptarse al espacio disponible en la cámara de crecimiento o invernadero. Se recomienda una profundidad mínima de 15 cm.
  2. Llene el recipiente con agua destilada y agregue fertilizante hidropónico general según lo indicado por el fabricante. La solución hidropónica resultante debe ser aireada y en constante movimiento, lo que se puede lograr mediante el uso de bombas de aire y agua.
  3. Preparen los flotadores hidropónicos.
    1. Corte una hoja de espuma de poliestireno expandido de 2 cm de espesor (ver Tabla de Materiales)a las dimensiones del recipiente. La hoja debe cubrir la mayor parte de la superficie del recipiente con el fin de limitar el crecimiento de algas. Una herramienta de quema de madera es eficaz para cortar espuma de poliestireno y es lo suficientemente versátil para este protocolo.
      ADVERTENCIA: Los humos o vapores liberados durante el corte en caliente de espuma de poliestireno son graves riesgos para la salud. Utilice la protección respiratoria adecuada. Los usuarios también pueden satisfacer los requisitos de ventilación cortando la espuma bajo una campana de humo.
    2. Haga agujeros (1-2 cm de diámetro) en la lámina de espuma de poliestireno utilizando una herramienta de quema de madera. La distancia entre los centros de dos agujeros se puede ajustar a las necesidades del experimento. Sin embargo, se recomienda una distancia mínima de 2,5 cm.

3. Transferencia de plántulas a hidroponía y crecimiento de plantas

  1. Extraiga suavemente las plántulas de 5 días de edad de la vermiculita y transfiera inmediatamente a un recipiente lleno de agua durante 30 minutos. Este paso eliminará el exceso de vermiculita y suavizará los pericarpos restantes. La raíz primaria emergente debe ser visible.
  2. Retire las paredes del pericarpo a mano si es necesario para optimizar la futura expansión de los cotiledons.
  3. Transfiera las plántulas dentro de los soportes de semillas al flotador de espuma de poliestireno. Cultivar las plantas con una intensidad de luz de 140oM-m -2s-1, una humedad relativa del 65% y un fotoperiodo de 16 h de luz a 22oC y 9 h de oscuridad a 20oC durante 2 días.

4. Preparación previa al tratamiento

NOTA: Este procedimiento se aplica a la prueba de 20 productos químicos de una pequeña biblioteca de compuestos en triplicado, con 100 m de ABA en 10 mM MES-KOH (pH a 6,2) y 10 mM MES-KOH (pH a 6,2) que contiene 1% (v/v) de dimetil sulfóxido (DMSO) como controles positivos y negativos, respectivamente.

  1. Asegúrese de que haya suficientes plantas listas para el tratamiento. Las plantas listas para el tratamiento deben ser lo suficientemente maduras como para tener cotilediones completamente desplegadas, pero lo suficientemente jóvenes como para que la proliferación de raíces laterales sea mínima. Para realizar un cribado estándar, se necesitan 69 plantas de este tipo.
  2. Retire la placa de 96 pocillos que contiene los pequeños compuestos del congelador de -80 oC. Descongelar a temperatura ambiente.
  3. Prepare 80 ml de búfer MES-KOH de 10 mM ajustado a un pH de 6,2 con 1 M KOH.
  4. Microtubos de 2 ml sin tapa de etiqueta. Preparar al menos seis tubos para el tratamiento de control negativo (10 mM MES-KOH (pH a 6,2) que contiene 1% (v/v) DMSO). Utilice tres tubos para el tratamiento de ABA (100 m ABA en 10 mM MES-KOH pH a 6,2), control positivo). Utilice los 60 tubos restantes para analizar el efecto de los 20 productos químicos en triplicado.
  5. Transfiera 10 ml de cada producto químico (10 mM en DMSO) a cada uno de los tres tubos debidamente etiquetados. Pipet 10 l de 10 mM ABA disuelto en DMSO en tres tubos y 10 l de DMSO en los seis tubos de control.
    ADVERTENCIA: Por naturaleza, algunos compuestos pueden causar efectos graves para la salud y los usuarios deben tomar las medidas de protección adecuadas.
  6. Añadir 990 ml de 10 mM MES-KOH (pH a 6,2) a cada uno de los 69 tubos. Dispensar el tampón MES con suficiente fuerza para mezclar el producto químico con el tampón MES, pero tenga mucho cuidado de no usar tanta fuerza que los productos químicos y el tampón MES squirt fuera del tubo. Alternativamente, vórtice a baja velocidad.

5. Configure la cámara termográfica

  1. Monte la cámara termográfica en un soporte de copia. Conecte todos los cables a un ordenador portátil.
    NOTA: La grabación se realiza en condiciones de temperatura (20 oC a 25 oC), humedad (50% a 70%) y la calidad de la luz (110 a 140 mófonos-2s-1) similar a los utilizados para el cultivo de las plantas.
  2. Encienda la cámara y luego el portátil y abra el software de análisis de imágenes térmicas.
    NOTA: Las instrucciones posteriores para la grabación se aplican a un software específico utilizado (consulte Tabla de materiales).
  3. Ajuste los ajustes de grabación.
    1. Pase el ratón sobre el botón rojo de grabación en la parte superior de la ventana central. Aparecerá un menú desplegable. Haga clic en el icono de llave en el icono Grabar configuración.
    2. Seleccione el modo de registro y las opciones adecuados. Se podría utilizar la opción de registro periódicamente, con un fotograma capturado por minuto y una parada manual. Tenga en cuenta el destino del archivo donde el software guardará el vídeo. Cierre la ventana Configuración de registro.

6. Preparación y tratamiento de plantas

  1. Coloque los tubos sin tapa que contengan los productos químicos en los bastidores de tubos. Alternativamente, una hoja de espuma de poliestireno se puede cortar y pinchar con una herramienta de quema de madera como se describe en el paso 2.3 para hacer un bastidor de tubo personalizado. El diámetro de cada orificio debe estar muy cerca del diámetro externo de los tubos sin tapa para mantenerlos firmemente.
    NOTA: El campo de visión de la cámara es un factor limitante que debe tenerse en cuenta a la hora de decidir cómo se mantendrán los tubos sin tapa en su lugar.
  2. Distribuir uniformemente los tubos de control positivos y negativos, así como los tubos experimentales en los bastidores para tener en cuenta el sesgo relacionado con la posición17.
  3. Preparar los siguientes materiales junto a las plantas cultivadas hidropónicamente: tijeras de microdisección, un plato poco profundo con agua, delicadas toallitas de tarea, los 69 tubos sin tapa que contienen los diferentes productos químicos.
  4. Repita los pasos siguientes para cada planta que se va a tratar. El brote de girasol siempre permanecerá en el soporte de semillas.
    1. Levante cuidadosamente el soporte de semillas y sumerja rápidamente la raíz en el plato poco profundo que contiene agua.
    2. Cortar la raíz primaria bajo el agua para evitar la cavitación. El corte debe ocurrir 0,8-1 cm por debajo del extremo más basal del soporte de semillas.
    3. Inserción de la planta recién cortada en uno de los tubos que contienen los productos químicos.
    4. Si hay gotas de agua en los cotiledón, seque suavemente con una delicada toallita de tarea.
      NOTA: Estos cuatro pasos deben realizarse lo más rápido posible (10 min o menos) para evitar incoherencias en el estudio cinético.
  5. Mueva las plantas debajo de la cámara termográfica y asegúrese de que todas las plantas estén dentro del campo de visión de la cámara. Ajuste la altura de la cámara y la posición de los bastidores según sea necesario.

7. Grabación

  1. Enfoca la cámara a la superficie de los cotiledón pulsando Ctrl + Alt + A.
  2. Pase el ratón sobre el botón rojo y haga clic en la opción Grabar una película. Se debe abrir una nueva ventana que confirme que la grabación debe abrirse.
  3. Detenga la grabación 1-2 horas más tarde.
    NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.

8. Recopilación de datos

  1. Ir a Archivo ? Abiertos ? Busque el archivo . SEQ y ábralo.
  2. Deja de tocar la película.
  3. En el lado izquierdo de la ventana principal, haga clic en añadir un icono de ROI del cursor de medición (3x3 píxeles). ROI significa Región de Interés.
  4. Pase el ratón sobre el centro de un cotileón de la primera planta y haga clic izquierdo una vez. El cursor 1 ya está en su lugar. Etiquete el segundo cotileon de la primera planta repitiendo el procedimiento. Debe tenerse en cuenta el orden de las etiquetas.
  5. Repita el procedimiento. Todas las plantas deben estar etiquetadas con dos cursores.
  6. Haga clic en el icono Editar ROIs. En la ventana principal, haga clic izquierdo y mantenga presionado en la esquina superior izquierda y desplácese a la esquina inferior derecha para seleccionar todos los IU.
  7. Pase el ratón sobre el icono Visor de estadísticas y seleccione Trazado temporal. Se abrirá una nueva ventana.
  8. Dirige la película. Un gráfico se llenará con los datos.
  9. En esta ventana, haga clic en la flecha doble en la esquina superior derecha para abrir un nuevo menú.
  10. Haga clic en el icono Guardar. Guardar como valores X e Y en el trazado (.csv). Cierre el software una vez exportados los datos.

9. Análisis de datos

  1. Abra el archivo .csv con un software de análisis de datos (por ejemplo, Microsoft Excel). Tenga en cuenta que las tres primeras columnas (De a C) proporcionan información sobre el número de fotograma, el tiempo absoluto y el tiempo relativo. Las columnas restantes proporcionan la temperatura de cada ROI a lo largo del tiempo.
  2. Decidir la naturaleza de la herramienta estadística que se utilizará; esta decisión depende de diferentes factores, incluido el diseño experimental.
    NOTA: En nuestro ejemplo, se calcula una puntuación estándar, o puntuación z, para cada muestra en función de la media de la población y la desviación estándar de la población. Para cada muestra, se calcula un valor p a partir de la puntuación z. Este método permite la confirmación de los controles positivos y negativos, así como la identificación de nuevos compuestos que se probarán más.

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Representative Results

Un experimento con el tinte rojo Eritrosina B (0,8 kDa) demuestra la capacidad de los productos químicos para ser absorbidos visiblemente a través de una raíz cortada en los cotiledones de una plántula de girasol en 10 minutos(Figura 1).

Cuando las plantas son tratadas con ABA, se detecta un aumento en la temperatura de las hojas en los cotilediones de girasol en cuestión de minutos. Este aumento de la temperatura de la hoja se asocia con una disminución de la apertura estomatal y la conductancia estomatal. Se observa un aumento de la temperatura foliar de 15 min después del tratamiento con 10 oM ABA (valor p a 0,02) y 20 min con 5 oM ABA (valor p a 0,003)(Figura 2). En general, estos resultados muestran que las mediciones de la temperatura de la hoja por imágenes térmicas son un buen proxy para medir la apertura y la conductancia estomatales.

La Figura 3 muestra un experimento de prueba de concepto utilizando un subconjunto de 20 productos químicos de la colección NatProd con controles positivos (100 M ABA) y negativos. En este experimento representativo, un tratamiento estadístico basado en la puntuación estándar permite la identificación de productos químicos que promueven el cierre estomatal o, si bien el ensayo debe optimizarse para ese propósito específico, los productos químicos que promueven la apertura estomatal. En el ejemplo dado, una visualización del mapa térmico de las puntuaciones estándar permite la rápida identificación de productos químicos #02 y #16 como candidatos potenciales.

La figura 4 resume los pasos importantes del flujo de trabajo.

Figure 1
Figura 1: Eficacia del enfoque de alimentación de la raíz cortada. (A) Una plántula alimentada durante 1 h con Eritrosina B en 10 mM MES-KOH (pH a 6,2) es visiblemente roja (imagen derecha) en comparación con el control (imagen izquierda). Las imágenes fueron tomadas después de la alimentación de la raíz cortada seguida de una incubación durante la noche en etanol absoluto para eliminar los pigmentos vegetales naturales. Bar 10 mm. (B) Acumulación de eritrosina B en cotiledonas con el tiempo. La eritrosina B se puede detectar mediante espectrofotometría en extractos vegetales de cotilediones 8 min (valor p a 0,032) después de la transferencia de plántulas de girasol de raíz cortada al tinte. Las barras de error indican que SEM. * indica el valor p < 0.05 (n a 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Relaciones entre la temperatura de la hoja, la apertura estomatal y la conductividad para mostrar la sensibilidad del diseño experimental. (A) Imagen representativa que muestra las diferencias en la temperatura de la hoja entre 100 M de plántulas de girasol tratadas con ABA (+ABA) y no tratadas (Control) después de 30 minutos visualizadas por imágenes térmicas. (B) Izquierda: las plantas tratadas con ABA de 100 m durante 30 min muestran una temperatura aumentada en comparación con las plantas de control (* indica valor p < 0,01), n a 3). Derecha: las medidas de apertura estomatal en las exfoliaciones epidémicas de las mismas plantas muestran una disminución en la apertura estomatal (ancho/largo) (* indica el valor p < 0,01, n a 3, el número de estomas por planta 162). (C) La conductancia de la hoja medida con un porómetro de la hoja y junto con las mediciones de la temperatura de la hoja muestran que existe una fuerte correlación (coeficiente de Pearson a -0,89, n a 6) entre la temperatura de la superficie de la hoja y la conductancia estomatal. Las plantas tratadas con ABA de 100 m durante 30 min muestran un aumento de la temperatura y una disminución de la conductividad en comparación con las plantas de control (n x 6). (D) El estudio de dosis-respuesta muestra una reducción de la temperatura de la hoja en plantas tratadas con concentraciones de ABA tan bajas como 5 m después de 20 min de tratamiento (valor p a 0,0037, n a 3). Las barras de error indican SEM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Resultados representativos del cribado de 20 compuestos químicos. (A) Mapa de calor de las puntuaciones Z que reflejan las respuestas de las plantas a 20 compuestos probados en triplicados. El rojo oscuro y el azul oscuro indican un nivel de confianza de >99% para el cierre y la apertura estomatales, respectivamente. Seis plantas fueron tratadas con DMSO (control), tres fueron tratadas con 100 m de ABA, y otras plantas fueron tratadas con 100 m de producto químico en triplicado. Las plantas que responden al compuesto 16 (C-16) muestran un cierre estomatal similar al observado en las plantas tratadas con ABA. Dos de las tres plantas tratadas con el compuesto 02 (C-02) muestran un aumento significativo en la apertura estomatal. (B) Cinética de la respuesta de las plantas a los compuestos 02 y 16. Los cambios medios de temperatura a lo largo del tiempo se muestran en las plantas que responden al tratamiento de control (n a 6), a 100 oA. ABA (n a 3) o a 100 oM de cada compuesto (n a 3). Las barras de error indican que el SEM. Los cambios en la temperatura son consistentemente estadísticamente significativos después de 10 min de tratamiento ABA (valor p a 0,026, n a 3), 15 minutos de tratamiento con C-16 (valor p a 0,030, n a 3) y 71 min de C-02 (valor p a 0,044, n a 3) en comparación con el control. Las fluctuaciones compartidas por todas las muestras es ruido de fondo debido al control dinámico de la temperatura ambiente en la cámara de crecimiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Resumen del flujo de trabajo de detección. Tenga en cuenta que las imágenes representan pasos importantes y son independientes entre sí. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El número de compuestos que se pueden probar en un día determinado depende principalmente de (i) el espacio ambientalmente controlado disponible para el cultivo de las plantas y para realizar la pantalla, así como (ii) el número de individuos que pueden participar en el paso 6 del protocolo. Recomendamos el uso de tres réplicas experimentales para consolidar la interpretación de los resultados después del tratamiento estadístico. En un día típico, uno a dos individuos pueden examinar 60 compuestos en triplicados sin dificultad probando por ejemplo [60 productos químicos + 6 controles negativos (DMSO) + 3 controles positivos (ABA)] por la mañana, al mediodía y por la tarde.

Este método se basa en plántulas sanas con cotiledón completamente desarrollado. Como la toma de imágenes se produce desde arriba, una plántula ideal debe mostrar un ángulo de 90o entre el hipopotatil y la hoja cotileonaria con el fin de recopilar tanta información como sea posible. Este ángulo está regulado principalmente por la luz y por lo tanto debe optimizarse ajustando las condiciones de crecimiento. Nuestros resultados muestran que un producto químico tarda alrededor de 10 minutos en llegar a los cotiledons y unos minutos más en responder a un producto químico como ABA. Esta observación hace que el paso 6.4 sea el paso más sensible al tiempo en el protocolo. Por lo tanto, es fundamental tratar todas las plantas en un ensayo determinado en menos de 15 minutos para evitar discrepancias entre las respuestas de las plantas. Entre los factores externos que afectan pasivamente a las mediciones foliares de temperatura, es probable que la ventilación introduzca sesgos relacionados con la posición o una variabilidad significativa entre las réplicas. Los usuarios deben tener cuidado al controlar los flujos de ventilación y limitar los sesgos relacionados con la posición distribuyendo aleatoriamente las muestras antes de registrarlas. Para tener en cuenta otros factores potenciales, el registro debe realizarse bajo condiciones de temperatura, humedad y luz similares a las utilizadas para cultivar las plantas, ya que cualquier cambio en estas condiciones puede afectar al cierre de los estomas y/o a la temperatura foliar. Por último, se debe evaluar su toxicidad un compuesto capaz de modular el cierre estomatal. Esto es particularmente cierto si el compuesto desencadena el cierre estomatal, ya que se sabe que es una consecuencia indirecta del estrés intenso experimentado por la planta.

Al proporcionar un método de administración eficaz de moléculas bioactivas y un método para medir directamente la transpiración de plantas, este protocolo aborda algunos de los inconvenientes asociados con los enfoques de cribado actuales, como se menciona en la introducción. Nuestro protocolo no es exclusivo de las plántulas de girasol y se puede aplicar a la mayoría de los dicots con un ángulo de hipocotílo a cotilenio de 90o. Las imágenes térmicas de los cotiledón arabidopsis son efectivas18,19 y nuestro protocolo podría adaptarse a plántulas con cotiledones igualmente pequeños. Además, las imágenes por fluorescencia de clorofila podrían utilizarse para medir el rendimiento fotosintético en combinación. Aunque son menos eficaces en el tiempo, las mediciones de la acumulación impulsada por transpiración en cotiledonas de eritrosina B añadidas a cada producto químico podrían utilizarse potencialmente para evaluar las tasas de transpiración si no hay una cámara termográfica disponible. En total, este método de cribado a gran escala evalúa eficientemente la respuesta foliar de las plantas a las moléculas bioactivas y es fácilmente adaptable a una variedad de aplicaciones.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

El trabajo fue apoyado por Pomona College Start-up Funds y Hirsch Research Initiation Grants Fund (to FJ) así como el Programa de Biología Molecular de Pomona College a través del Programa Estelar de Asistente de Investigación de Verano (a KG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1020 plastic growing trays without drain holes Standard 10 x 20 inch trays
2.0 mL microtubes, capless Genesee Scientific 22-283NC
Abscisic acid (ABA) Sigma-Aldrich A1049
Air pump Active Aqua AAPA7.8L 2 Outlets, 3W, 7.8 L/min
Airstones
Chemical compound library MicroSource Discovery Natural Product Collection
Creative Versa-Tool (wood burning tool) Nasco 9724549
Dimethylsulfoxide (DMSO), plant cell culture tested Sigma-Aldrich D4540
Dwarf Sunspot Sunflower seeds Outsidepride.com
Erythrosin B Sigma-Aldrich 200964
Hydroponics fertilizer set (FloraBloom, FloraGrow, FloraMicro) General Hydroponics GL51GH1421.31.11
Kimwipes Delicate Task Wipers Kimberly-Clark Professional 34155
Laptop Dell
MES hydrate Sigma-Aldrich M2933
Microdissection scissors
Microsoft Excel Microsoft
Potassium hydroxide (KOH) Sigma-Aldrich P5958
ResearchIR Software FLIR
R-Tech Rigid Polystyrene Foam Board Insulfoam
Seedholders Araponics N/A
Super Tub (plastic utility tub) Maccourt ST3608 36 x 24 x 8 inch tub used for hydroponics
T450sc LWIR (Long-Wave Infrared) Handheld Thermal Imaging Camera FLIR FLIR-T62101 Comes with required charging cable and USB cable needed to connect to laptop
Vermiculite
Water filter SunSun HW-304B Pro Canister Filter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Basu, S., Ramegowda, V., Kumar, A., Pereira, A. Plant adaptation to drought stress. F1000Research. 5, (2016).
  2. McLachlan, D. H., Kopischke, M., Robatzek, S. Gate control: guard cell regulation by microbial stress. The New Phytologist. 203, (4), 1049-1063 (2014).
  3. Leung, J., Bazihizina, N., Mancuso, S., Valon, C. Revisiting the Plant's Dilemma. Molecular Plant. 9, (1), 7-9 (2016).
  4. Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nature Reviews Drug Discovery. 10, (3), 188-195 (2011).
  5. Wigglesworth, M. J., Murray, D. C., Blackett, C. J., Kossenjans, M., Nissink, J. W. Increasing the delivery of next generation therapeutics from high throughput screening libraries. Current Opinion in Chemical Biology. 26, 104-110 (2015).
  6. Zhao, Y., et al. Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated. Nature Chemical Biology. 3, (11), 716-721 (2007).
  7. Park, S. Y., et al. Abscisic acid inhibits type 2C protein phosphatases via the PYR/PYL family of START proteins. Science. 324, (5930), 1068-1071 (2009).
  8. Ma, Y., et al. Regulators of PP2C phosphatase activity function as abscisic acid sensors. Science. 324, (5930), 1064-1068 (2009).
  9. Cao, M., et al. An ABA-mimicking ligand that reduces water loss and promotes drought resistance in plants. Cell Research. 23, (8), 1043-1054 (2013).
  10. Okamoto, M., et al. Activation of dimeric ABA receptors elicits guard cell closure, ABA-regulated gene expression, and drought tolerance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, (29), 12132-12137 (2013).
  11. Rodriguez, P. L., Lozano-Juste, J. Unnatural agrochemical ligands for engineered abscisic acid receptors. Trends in Plant Science. 20, (6), 330-332 (2015).
  12. Kim, T. H., et al. Chemical genetics reveals negative regulation of abscisic acid signaling by a plant immune response pathway. Current Biology. 21, (11), 990-997 (2011).
  13. Ito, T., et al. Novel Abscisic Acid Antagonists Identified with Chemical Array Screening. ChemBioChem. 16, (17), 2471-2478 (2015).
  14. Ye, Y., et al. A Novel Chemical Inhibitor of ABA Signaling Targets All ABA Receptors. Plant Physiology. 173, (4), 2356-2369 (2017).
  15. Takeuchi, J., et al. Designed abscisic acid analogs as antagonists of PYL-PP2C receptor interactions. Nature Chemical Biology. 10, (6), 477-482 (2014).
  16. Rauf, S., et al. Progress in modification of sunflower oil to expand its industrial value. Journal of the Science of Food and Agriculture. 97, (7), 1997-2006 (2017).
  17. Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions. Briefings in Bioinformatics. 16, (6), 974-986 (2015).
  18. Costa, J. M., Grant, O. M., Chaves, M. M. Thermography to explore plant-environment interactions. Journal of Experimental Botany. 64, (13), 3937-3949 (2013).
  19. Merlot, S., et al. Use of infrared thermal imaging to isolate Arabidopsis mutants defective in stomatal regulation. The Plant Journal. 30, (5), 601-609 (2002).

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