الكشف عن الهجرة وتسلل العدلات في الفئران

* These authors contributed equally
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

هنا، نقدم ثلاث طرق لتقييم الهجرة العدلات والتسلل في كل من الجسم الحي وفي المختبر. ويمكن استخدام هذه الأساليب لاكتشاف العلاجات الواعدة التي تستهدف هجرة العدلات.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Lu, Q., Yuan, K., Li, X., Jiang, H., Huo, G., Jia, W., Huang, G., Xu, A. Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice. J. Vis. Exp. (156), e60543, doi:10.3791/60543 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

العدلات هي عضو رئيسي في الجهاز المناعي الفطري وتلعب أدوارًا محورية في الدفاع المضيف ضد مسببات الأمراض وردود الفعل الالتهابية المرضية. يمكن تجنيد العدلات في مواقع الالتهاب عن طريق توجيه السيتوكينات وchemokines. يمكن أن يؤدي التسلل الساحق من العدلات إلى تلف الأنسجة العشوائية، كما هو الحال في التهاب المفاصل الروماتويدي (RA). العدلات المعزولة من exudate الباسيتي تستجيب لchemoattractant محددة، N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)، في المختبر في ترانسويل أو زغموند غرفة المقالات. يمكن استخدام تجربة الحقيبة الهوائية لتقييم الضريبة الكيميائية للالعدلات نحو البوليس الدهني (LPS) في الجسم الحي. وكثيرا ما يستخدم نموذج الماوس التهاب المفاصل الناجم عن الساعد (AA) في البحوث RA، وتلطيخ الهيستوكيميائية المناعية للأقسام المشتركة مع مكافحة النقوي (MPO) أو اللاستاز المضادة للالعدلات (NE) هو وسيلة راسخة لقياس قياس تسلل العدلات. يمكن استخدام هذه الطرق لاكتشاف العلاجات الواعدة التي تستهدف هجرة العدلات.

Introduction

العدلات هي خلايا الدم البيضاء الأكثر وفرة وتمثل 50-70٪ من إجمالي خلايا الدم البيضاء في البشر1. العدلات هي واحدة من المستجيبين الأولية خلال الالتهاب الحاد. يمكن تجنيد العدلات إلى مواقع الالتهاب عن طريق توجيه السيتوكينات وchemokines الصادرة عن الخلايا المقيمة في الأنسجة2،3،4، والتي تتوسطها التفاعلات بين جزيئات التصاق الخلية على سطح العدلات وخلايا بطانة الرحم الوعائية5. العدلات أساسية لاستضافة الدفاع وتلعب دورا في ردود الفعل الالتهابية المرضية بسبب قدرتها القوية على تلف الأنسجة عن طريق إطلاق أنواع الأكسجين التفاعلي (ROS) وغيرها من الجزيئات الضارة بالأنسجة3،6.

وقد وصفت الدراسات السابقة العديد من بروتوكولات العزلة العدلات من الفئران أو البشر. أوه وآخرون أظهرت طريقة فصل التدرج الكثافة لعزل العدلات البشرية من الدم البشري كله7. ومع ذلك ، فإن عزل العدلات الكافية من دم الفئران أمر صعب بسبب حجم الدم الصغير. بدلا من ذلك، يمكن الحصول على أعداد كبيرة من العدلات الماوس نقية وقابلة للحياة من السائل الماوس الجانبية، ويمكن استخدام هذه العدلات تنقية الجسم الحي لفحص عدة جوانب من وظائف الخلوية في الجسم الحي، بما في ذلك تسلل العدلات، والهجرة، chemotaxis، انفجار الأكسدة، cytokine وفخ خارج الخلية (NET) الإنتاج8. يمكن استخدام المقالات عبر ويل9 أو مقالات غرفة Zigmond10،11 لتقييم هجرة العدلات في المختبر. ويستخدم نموذج الحقيبة الهوائية لتقييم الهجرة وتسلل العدلات في الجسم الحي. نموذج الحقيبة الهوائية تحت الجلد هو نموذج مناسب في الجسم الحي لدراسة هجرة الخلايا الالتهابية.

تقليديا ، كانت تعتبر العدلات مزيلات مسببات الأمراض في المراحل الحادة من الالتهاب. ومع ذلك، أظهرت النتائج الأخيرة أن العدلات هي خلايا معقدة تؤدي مجموعة كبيرة ومتنوعة من الوظائف المتخصصة. العدلات يمكن تنظيم العديد من العمليات مثل الإصابة الحادة والإصلاح، تولد الورم، استجابة المناعة الذاتية، والالتهاب المزمن12،13. العدلات أيضا تعديل الاستجابات المناعية التكيفية ويمكن تنظيم الخلايا B والخلايا التائية14،15. نقص كبير في العدلات يؤدي إلى الوفيات أو نقص المناعة الحاد في البشر واستنفاد العدلات في الفئران يؤدي إلى الوفاة، في حين أن التنشيط المفرط أو تجنيد العدلات في الأعضاء يسبب العديد من الأمراض المناعية، مثل التهاب المفاصل الروماتويدي (RA) والذئبة اللامعة الجهازية (SLE)6. العدلات هي الخلايا الأكثر وفرة في السائل الزليلي لمرضى RA. العدلات تنتج كميات مفرطة من النقويبأوكسيديز (MPO) والإيلاستاز العدلات (NE) عن طريق التدهور، مما يؤدي إلى تفاقم تآكل الغضاريف. MPO هو إنزيم بيروكسيديز أعرب عنه أساسا في حبيبات العدلات16. ويرتبط NE مع تدمير الغضاريف المفصلية17. يمكن استخدام MPO و NE لتقييم حالة هجرة العدلات والتسلل في أنسجة مرضى RA.

توفر هذه المقالة ثلاث طرق تقليدية لتقييم هجرة العدلات العادية المستحثة في كل من الجسم الحي والمختبر ، وكذلك تسلل العدلات المرضية في نموذج التهاب مشترك خاص بالماوس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد استعرضت جامعة بكين جميع الإجراءات التجريبية ووافقت عليها لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها بالطب الصيني.

ملاحظة: تم استخدام الفئران C57BL/6 (7-8 أسابيع من العمر).

1- عزل العدلات

  1. اقتناء الخلايا الطاردة للبُرُقُيّة البُرُيّة
    1. إعداد الطازجة 10٪ محلول البروتيوس بيبتوني في ddH2O. حساب الحجم اللازم وفقا لعدد الفئران.
      ملاحظة: تعيين عدد الفئران كما N، (2N+1) مل من الحل يجب أن تذوب وتصفيتها مقدما.
    2. رش مساحة العمل مع الإيثانول 70٪. استخدام حاقن الأنسولين لرسم 1 مل من محلول بيبتوني وفقاعات التفريغ.
    3. إجراء الحقن ة داخل البطن الأولى من 1 مل من محلول بيبتون لكل فأر.
      1. الاستيلاء على الماوس في موقف الرأس إلى أسفل بيد واحدة. تطهير بقعة الحقن مع كرات القطن المنقوعة بالكحول.
        ملاحظة: يكمن موضع الحقن المفضل في الجانب الجانبي من الربع السفلي الأيسر أو الأيمن من البطن.
      2. غرس الكواشف بسرعة. حقن 1 مل في تجويف البُرُق من كل فأر مع حاقن الأنسولين.
        ملاحظة: يجب أن تكون الزاوية بين الإبرة والجلد حوالي 15-30 درجة لتجنب إصابة الأمعاء أو الأعضاء الأخرى.
    4. السماح للاستجابة الالتهابية لتطوير بين عشية وضحاها. بعد 12 ساعة، إجراء الحقن ة الثانية بنفس الطريقة التي الحقن الأول.
    5. بعد ثلاث ساعات من الحقن ة الثانية، تخدير الفئران بالكامل مع 5٪ الإيسولوران لمدة 5 دقيقة في غرفة تخدير الغاز بسرعة 2 لتر / دقيقة. إزالة الفئران مخدر من الغرفة والتضحية بها عن طريق خلع عنق الرحم.
      ملاحظة: يتم ضمان عمق كاف من التخدير عن طريق قرص إصبع يقرص قبل نقل الفئران من الغرفة إلى وحدة التنفس واحد. يجب ألا تتحرك الساقين عندما يتم قرص القدمين.
      ملاحظة: يجب معالجة كافة الخطوات التالية في غطاء ثقافة الأنسجة.
    6. رش الماوس مع الإيثانول 70٪. وضع الماوس على وسادة بلاستيكية معقمة وإصلاح الأطراف مع الإبر.
    7. استخدم مجموعة معقمة من الأدوات الجراحية لإجراء شق أفقي (~ 1 سم) في منتصف أسفل البطن. رفع الجلد من الجزء العلوي من البطن مع ملقط وقطع على طول خط الوسط من البطن وفضح الجدار الصفاق سليمة.
    8. حقن 5 مل من العقيمة RPMI-1640 متوسطة كاملة في تجويف البطن مع إبرة 30 G × 1/2". أدخل الإبرة من خلال الجدار البُرَقمع مع حافة الرُكَر المواجهة لأعلى وحقن الحجم بأكمله.
    9. يهز لوحة أفقيا لمدة 5 دقيقة. تدليك البطن بلطف عدة مرات.
    10. حقن إبرة 23 G x 1 1/4 بوصة في المساحة الجانبية للبطن. استخراج السائل البطني (~ 5 مل) وجمعه في أنبوب الطرد المركزي 50 مل.
      ملاحظة: ضع الأنابيب على الجليد في أقرب وقت ممكن في حالة تنشيط العدلات.
    11. حقن آخر 5 مل من متوسطة كاملة وتكرار الإجراء لإزالة الخلايا المتبقية من التتمة. تجمع السائل البيتوني في أنبوب الطرد المركزي 50 مل.
    12. الطرد المركزي السائل الباتوني المجمع عند 400 × ز لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    13. تجاهل السوبرناستانت. إعادة تعليق الخلايا في 1 مل من RPMI-1640 متوسطة كاملة.
      ملاحظة: لا دوامة لتجنب التنشيط العدلات.
  2. عزل العدلات
    1. أضف 4 مل من متوسط تدرج الكثافة المعد حديثاً بنسبة 70.2% (على سبيل المثال، Percoll) في أنبوب طرد مركزي 15 مل.
    2. تراكب بعناية 4 مل من إعداد حديثا 54.8٪ وسط التدرج الكثافة على 70.2٪ متوسط التدرج كثافة ببطء على طول حافة الأنبوب مع نصائح ماصة حادة في أنبوب الطرد المركزي 15 مل.
      ملاحظة: توخي الحذر لتجنب إزعاج الواجهة بين متوسط تدرج الكثافة بنسبة 54.8% ومتوسط تدرج الكثافة بنسبة 70.2%.
    3. تراكب بعناية 1 مل تعليق الخلية العضوية على رأس 54.8٪ كثافة التدرج الطبقة المتوسطة ببطء مع نصائح ماصة حادة(الشكل 1A).
      ملاحظة: توخي الحذر لتجنب إزعاج الواجهة بين تعليق الخلية ومتوسط تدرج الكثافة بنسبة 54.8%.
    4. جهاز طرد مركزي عند 1500 × ز لمدة 30 دقيقة عند 22 درجة مئوية دون كبح.
    5. جمع العدلات في واجهة 54.8٪ متوسط التدرج الكثافة و 70.2٪ كثافة التدرج الطبقات المتوسطة(الشكل 1B)إلى أنبوب جديد.
    6. إضافة 1 مل من RPMI-1640 متوسطة كاملة إلى الخلايا التي تم جمعها وإعادة تعليق الخلايا بعناية عن طريق الأنابيب بلطف عدة مرات. الطرد المركزي في 100 × ز لمدة 10 دقيقة في RT وإزالة بعناية supernatant.
    7. كرر خطوة الغسيل (الخطوة 1.2.6) مرة واحدة.
    8. إضافة 0.5 مل من الثقافة المتوسطة إلى بيليه وإعادة تعليق الخلايا عن طريق الأنابيب بلطف عدة مرات. اتخاذ aliquot 50 ميكرولتر لحساب الخلايا باستخدام محلل أمراض الدم التلقائي.

2. العدلية الهجرة الاستئصال يُقسِر

  1. قياس الهجرة العدلات من قبل Transwell assay9 أو Zigmond غرفة القياس كما سبق وصفه10،11.

3. كيس الهواء

  1. حقن الهواء الأول
    1. في اليوم 0، تخدير الفئران بالكامل مع 5٪ isoflurane لمدة 3 دقيقة في غرفة تخدير الغاز بسرعة 2 لتر / دقيقة، والحفاظ على تخدير كل فأر في وحدة تنفس واحدة مع 2٪ isoflurane بسرعة 0.5 لتر / دقيقة.
      ملاحظة: يتم ضمان عمق كاف من التخدير عن طريق قرص إصبع يقرص قبل نقل الفئران من الغرفة إلى وحدة التنفس واحد. يجب ألا تتحرك الساقين عندما يتم قرص القدمين.
    2. استخدم فلتر 0.22 ميكرومتر متصل بحقنة 5 مل للحصول على حجم 3 مل من الهواء المعقم.
    3. رفع الجلد الخلفي للفأر ة بأشعة تحت الجلد مع ملاقط وحقن تحت الجلد 3 مل من الهواء المعقم باستخدام 26 G × 3/8 "إبرة.
    4. بعد العلاج، قم بإزالة الفئران من وحدة التنفس. مراقبة الفئران للتأكد من أنها على قيد الحياة حتى تبدأ في التحرك.
  2. حقن الهواء الثاني
    1. في اليوم الثالث، احقن 3 مل إضافية من الهواء المعقم في الجيب الهوائي المحدد سابقًا للحفاظ على الحقيبة الهوائية كما هو موضح في القسم 3.1.
  3. العلاج
    1. في اليوم 6، 6 ساعة قبل التضحية، وحقن علاجات مختلفة في الحقيبة الهوائية. حقن 1 مل من الفوسفات العازلة المالحة (PBS) كتحكم سلبي. حقن 1 مل من 1 ميكروغرام / مل LPS كتحكم إيجابي للحث على التهاب موضعي.
    2. تخدير الفئران بالكامل مع 5٪ isoflurane لمدة 3 دقيقة في غرفة تخدير الغاز بسرعة 2 لتر / دقيقة ، والحفاظ على تخدير كل فأر في وحدة تنفس واحدة مع 2٪ isoflurane بسرعة 0.5 لتر / دقيقة. إعداد العازلة غسل وفقا لجدول المواد.
      ملاحظة: يتم ضمان عمق كاف من التخدير عن طريق قرص إصبع يقرص قبل نقل الفئران من الغرفة إلى وحدة التنفس واحد. يجب ألا تتحرك الساقين عندما يتم قرص القدمين.
    3. لكل حقيبة هوائية، اغسل الحقيبة الهوائية بمل واحد من العازلة واجمع الإكسوديت الالتهابي في أنبوب طرد مركزي 15 مل. غسل الحقيبة الهوائية مع 2 مل من غسل العازلة 2x وجمع exudate التهابية في نفس أنبوب الطرد المركزي.
    4. الطرد المركزي في 100 × ز لمدة 10 دقيقة في RT. تجاهل الخلايا supernatant وإعادة تعليق في 1 مل من العازلة غسل. عد الخلايا لتحديد نسبة العدلات باستخدام محلل أمراض الدم التلقائي.
      ملاحظة: راجع النتائج التمثيلية في الشكل 2.

4. تحريض نموذج الماوس الناجم عن التهاب المفاصل الناجم عن التعليمات (AA)

  1. تعليق كامل Freund 'sadjuvant (CFA) عن طريق دوامة ما لا يقل عن 5 ق، ثم رسم 100 ميكرولتر من التعليق في حاقن الأنسولين.
    ملاحظة: نوصي باستخدام CFA جديدة تماما في التجارب لضمان العقم.
  2. تطفل الفئران كما هو موضح في الخطوة 3.1.1.
  3. وضع علامة على مخلب المختار وحقن 20 ميكرولتر من CFA في مساحة مفصل الكاحل. حقن 20 ميكرولتر من التعليق في أربع بقع معافية على مخلب المختار (80 ميكرولتر في المجموع).
  4. إزالة الفئران من وحدة التنفس ووضع الفئران المصنعة في غرفة جديدة. مراقبة الفئران للتأكد من أنها تتنفس حتى تستعيد القدرة على التحرك.
  5. كل 3 أيام، وتقييم قطر المفصل عن طريق قياس قطر مفصل الكاحل باستخدام مقياس سمك الجيب(الشكل 3A).
  6. كل 3 أيام, تقييم شدة التهاب المفاصل عن طريق معيار تسجيل التهاب المفاصل(الشكل 3C):0, طبيعي, أي دليل على وجود حُمّي وتورم; 1, التهاب المفاصل أخف, حُمّي وتورم خفيف يقتصر على التارسال أو مفصل الكاحل; 2, التهاب المفاصل المعتدل, وتورم خفيف ومعتدل يمتد من الكاحل إلى التارسال; 3, التهاب المفاصل الحاد, التهاب المفاصل وتورم معتدل يمتد من الكاحل إلى مفاصل مشط القدم; 4، والتهاب المفاصل الأكثر حدة، وورم وتورم شديد تشمل الكاحل والقدم والأرقام، أو ankylosis من الطرف.

5. تلطيخ المناعة الكيميائية للأقسام المشتركة

  1. العزل المشترك
    1. التضحية الماوس في القسم 4 باستخدام خلع عنق الرحم بعد التخدير مع إيفوروران. رش الماوس مع الإيثانول 70٪.
    2. إزالة الجلد وجزء من العضلات من الساق الخلفية مع ملاقط ومقص. رش المفصل مع الإيثانول بنسبة 70٪ وإزالة بقية العضلات باستخدام منشفة ورقية.
    3. إصلاح مفصل الكاحل في 4٪ paraformaldehyde لمدة 2 أيام في RT. Decalcify المفصل في 10٪ EDTA لمدة 1 شهر في RT وتغيير المتوسط أسبوعيا.
    4. تضمين الأنسجة في البارافين وإعداد أقسام الأنسجة 4 ميكرومتر سميكة.
      1. وضع الأنسجة في قالب ملحوظ مع حجم معين من البارافين السائل. بارد لفترة وجيزة.
      2. ضبط سمك في 4 ميكرومتر وقطع شرائح على ميكروتومي. تعويم المقاطع في حمام مائي 43 درجة مئوية.
      3. قم بتركيب المقاطع على الشرائح ووضع الشرائح في الفرن على درجة حرارة 70 درجة مئوية لمدة ساعتين. للاستخدام في المستقبل، حافظ على الشرائح عند -20 درجة مئوية.
  2. سافرانين O وتلطيخ أخضر سريع للأقسام المشتركة
    ملاحظة: يتم إجراء خطوات تلطيخ التالية في RT.
    1. ضع الشرائح من الخطوة 5.1.4.3 في رف وأداء يغسل التالية لإعادة ترطيب في RT: xylene لمدة 5 دقيقة (3x)، 100٪ الإيثانول لمدة 2 دقيقة (2x)، 95٪ الإيثانول لمدة 2 دقيقة (2x)، 70٪ الإيثانول لمدة 2 دقيقة، و 50٪ الإيثانول لمدة 15 دقيقة غسل في مياه الصنبور الجارية لمدة 3 دقيقة.
    2. وصمة عار في 0.1٪ حل أخضر سريع لمدة 5 دقيقة. شطف في 1٪ حمض الخليك لمدة 10 s.
    3. وصمة عار في 0.1٪ safranin O حل تلطيخ لمدة 20 دقيقة. تزج الشرائح في الغسل التالية: 95٪ الإيثانول لمدة 2 دقيقة (2x)، 100٪ الإيثانول لمدة 2 دقيقة (2x)، والزيلين لمدة 2 دقيقة (2x).
    4. قم بتركيب أقسام الأنسجة ومراقبة الأنسجة تحت المجهر.
      ملاحظة: انظر الصور التمثيلية في الشكل 4A.
  3. تلطيخ المناعة الكيميائية لتصور العدلات
    1. خبز أقسام البارافين لمدة 2 ساعة في 78 درجة مئوية. ضع الشرائح في رف وانفذ السُلح التالية لإعادة الترطيب في RT: xylene لمدة 15 دقيقة (2x)، والإيثانول بنسبة 100% لمدة 5 دقيقة (2x)، والإيثانول بنسبة 95% لمدة 5 دقيقة، والإيثانول بنسبة 80% لمدة 5 دقيقة، وH2O لمدة 3 سنوات، وPBS لمدة 3 سنوات.
      ملاحظة: لا تدع الشرائح تجف في أي وقت أثناء هذه الخطوة.
    2. إضافة قطرة واحدة من العازلة permeabilization لتغطية الأنسجة. تحضن المقاطع في صينية يتم التحكم في الرطوبة فيها عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
    3. شطف الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة 3 دقيقة (3x). تجنب الإننارة مباشرة.
    4. تنفيذ الحرارة الناجمة عن إستضدال epitope استرجاع باستخدام غلاية الضغط.
      1. ترتيب الشرائح في رف. تزج الشرائح في المرجل الضغط مليئة المخزن المؤقت استرجاع.
      2. وضع المرجل الضغط على فرن الميكروويف. اضبط يفرن الميكروويف على حرارة 600 واط وسخّن الشرائح لمدة 10 دقيقة.
      3. بعد الغليان، والحفاظ على الشرائح في المرجل لتبرد إلى 90 درجة مئوية. إخراج الشرائح وشطف لهم في برنامج تلفزيوني لمدة 3 دقيقة (3x).
    5. إخماد الذاتية بيروكسيديز النشاط في أعدت حديثا 3% H2O2 في RT لمدة 15 دقيقة. شطف الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة 3 دقيقة (3x).
    6. حدد دائرة كبيرة حول العينة بقلم مسعور ، وتجنب لمس العينة. كتلة مع 3٪ الزلال مصل البقر (BSA) في غرفة تسيطر عليها الرطوبة في 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
    7. إزالة حل الحظر. أضف 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المخففة PBS إلى كل قسم بسرعة. ثم، احتضان الشرائح في صينية تسيطر عليها الرطوبة في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: يتم استخدام نسب تخفيف مختلفة للأجسام المضادة المختلفة (1:25 لMPO و 1:20 لNE).
    8. في اليوم الثاني، أخرج الدرج واتركه يقف عند RT لمدة 30 دقيقة. ثم، شطف الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة 3 دقيقة (3x).
    9. أضف 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المخففة PBS إلى الأنسجة.
      ملاحظة: تم تطبيق نسب تخفيف مختلفة: 1:1,000 لMPO و 1:1,500 لNE.
    10. احتضان الشرائح في صينية التي تسيطر عليها الرطوبة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم، شطف الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة 3 دقيقة (3x).
    11. تطوير في المخفف 3,3'-diaminobenzidine (DAB) حل لمدة 5 دقيقة. إبقاء العين على رد الفعل في حالة تطور لون داكن. شطف الشرائح في الماء المقطر.
    12. مضادة الشرائح في هيماتوكسيلين لمدة 10 ق. شطف الشرائح في مياه الصنبور لمدة 5 دقيقة.
    13. شطف في حمض الكحول حل التمايز فائق السرعة لمدة 3 s. ثم شطف في ماء الصنبور لمدة 10 دقيقة.
    14. تزج الشرائح في النظافة التالية في RT: 80٪ الإيثانول لمدة 5 دقيقة، 95٪ الإيثانول لمدة 5 دقيقة، 100٪ الإيثانول لمدة 5 دقيقة، والزيلين لمدة 15 دقيقة (2x). إصلاح قسيمة الغطاء مع حل تصاعد. مراقبة الأنسجة تحت المجهر.
      ملاحظة: انظر الصور التمثيلية في الشكل 4B.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم جمع الخلايا الطاردة البريتونية من سائل اللاعف من الفئران. أعيد تعليق الخلايا في 1 مل من RPMI-1640 متوسطة كاملة، الطبقات على خطوتين (54.8٪/70.2٪) من تدرج الكثافة المتقطع(الشكل 1A)،والطرد المركزي عند 1500 × ز لمدة 30 دقيقة. تم استرداد العدلات (≥95٪، ~ 1 × 107 العدلات / الماوس) من الواجهة السفلية(الشكل 1B).

وأجريت تجارب الحقيبة الجوية للتحقيق في تجنيد العدلات التي حفزتها LPS في الجسم الحي(الشكل 2A). تم قياس المجموعات الفرعية للكريات البيض في إفرازات الحقيبة الهوائية(الشكل 2B).

تم تقييم هجرة العدلات في RA عن طريق نموذج التهاب المفاصل المستحث ة CFA. بالمقارنة مع مجموعة التحكم ، أظهرت مجموعة AA وذمة كبيرة في مخلب. في المجموعة AA ، زاد قطر مفصل الكاحل(الشكل 3B)وارتفعت درجة التهاب المفاصل باستمرار(الشكل 3D).

تلف الغضاريف هو متلازمة تمثيلية من RA, تم تنفيذ safranin O-سريع تلطيخ الغضاريف الخضراء لتقييم الضرر الغضروف في الماوس AA. كما هو مبين في الشكل 4A، تسبب تحدي CFA في كمية كبيرة من تسلل الكريات البيض ، وتآكل الغضاريف الكبير وتضخم الزليلي. مستويات التعبير MPO و NE هي علامات تمثيلية لتسلل العدلات. تم إجراء الاختبارات الكيميائية المناعية لمراقبة تسلل العدلات في المفاصل. تم تنظيم التعبير MPO و NE بشكل ملحوظ في القسم المشترك(الشكل 4B).

Figure 1
الشكل 1: عزل العدلات. (أ)خلايا الطاردات البُبيرية التي أعيد تعليقها في مل واحد من وسيط RPMI-1640 الكامل كانت الطبقات على خطوتين (54.8٪/70.2٪) تدرج الكثافة المتقطع. (B)بعد الطرد المركزي عند 1500 × ز لمدة 30 دقيقة ، تم استرداد العدلات (≥ 95 ٪ ، ~ 1 × 107 العدلات / الماوس) من الواجهة السفلية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: النتائج التمثيلية لكيس الهواء. (أ)توضيح لكيس الهواء. (ب)النتائج التمثيلية لتسلل مجموعة الكريات البيض الفرعية في كيس الهواء. برنامج تلفزيوني: السيطرة؛ LPS: 1 ميكروغرام/مل LPS. يتم تقديم البيانات على أنها متوسط ± SD. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: النتائج التمثيلية لنموذج الماوس الناجم عن التهاب المفاصل الناجم عن التعليمات. (أ)تم قياس قطر مفصل الكاحل باستخدام مقياس سمك الجيب. (ب)تم تقييم تورم المفصل على أساس قطر مفصل الكاحل (n = 7). (C)صور لكل درجة التهاب المفاصل. (د)تم تصنيف شدة التهاب المفاصل على مقياس من 0-4 نقاط (ن = 7). يتم تقديم البيانات على أنها متوسط ± SD. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: النتائج التمثيلية لتلطيخ الغضاريف الخضراء Safranin O-fast والمواد المناعية الكيميائية للأقسام المشتركة من التحكم والفئران AA. (أ)النتائج التمثيلية لتلطيخ الغضاريف الخضراء بسرعة سافرانين للأقسام المشتركة. (ب)النتائج التمثيلية لمستوى التعبير من MPO و NE في مفاصل الكاحل. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بروتوكولات مفصلة من العدلات عالية النقاء من الدم المحيطي7، نخاع العظام والأنسجة18 كانت متاحة لفترة طويلة. هنا نعتمد طريقة لعزل العدلات من السائل البتوني19 التي العدلات ناضجة لا تزال معطلة لمزيد من الدراسات المضادة للالتهابات والمضادة للأكسدة.

استخدمنا تجربة الحقيبة الهوائية لاستكشاف تسلل العدلات الناجم عن LPS في الجسم الحي. وقد تم اقتراح هذه الطريقة كطريقة محتملة لقياس تسرب الخلايا مباشرة في البيئة الالتهابية العامة في الجسم الحي.

ومن الجدير بالذكر أن إجراء الكيس الهوائية لا يوضح وظيفة العدلات إلا بطريقة غير محددة للأعضاء ويزيل عدة خطوات من سلسلة تجنيد الكريات البيض. منذ توظيف العدلات إلى أجهزة محددة يمكن أن تعتمد على خصائص الجهاز المختلفة، جزيئات الالتصاق، وchemokines، واستكشاف الدولة وظيفية العدلات في ظروف خاصة بالأعضاء هو من أهمية كبيرة لدراسة الدور الذي العدلات يحتمل أن تلعب في بعض الأمراض3. وقد اقترح أن نماذج نقطة النهاية مطلوبة للتحقيق في تسلل العدلات. لذلك ، يمكن أن يوفر إجراء تلطيخ مناعي كيميائي على الأقسام المشتركة للفئران في نموذج AA منظورًا ثاقبًا حول العدلات في مساحة المفصل. وفقا لبياناتنا، يتم تجنيد أعداد كبيرة من العدلات في الأنسجة المشتركة وبمثابة دليل أساسي لمزيد من البحوث على وقف تسلل العدلات لعلاج RA. بالإضافة إلى ذلك ، هناك حاجة إلى إجراء مقالات شاملة ، على سبيل المثال ، تلطيخ أخضر سريع من Safranin O ، لتقييم نموذج المرض لمزيد من الدراسة.

العدلات هي مجموعة فرعية رئيسية من تسلل الخلايا الالتهابية والعمل كخط الدفاع الأول ضد مسببات الأمراض الغازية أو إصابة الأنسجة20،21. إذا تسلل العدلات إلى الأنسجة بأعداد كبيرة ، يتم إفراز مستويات عالية من السيتوكينات وNETs ، والتي قد تطغى معًا على آليات الحماية في الأنسجة وتؤدي إلى تلف الأنسجة. إصابة الأنسجة يحفز كذلك تسلل العدلات، وبالتالي تشكيل حلقة مفرغة22. وقد اقترح التدخل في هجرة الخلايا عن طريق محاصرة الخلايا المنشطة في الأجهزة اللمفاوية كنهج علاجي مهم وتم تطبيقه في التجارب السريرية مع آثار جانبية مختلفة23. اكتشاف علاج جديد لتنظيم هجرة العدلات والنشاط الالتهابي في وقت واحد هو استراتيجية واعدة لعلاج الأمراض الالتهابية في المستقبل. وعلاوة على ذلك، إذا تم الجمع بين العوامل التي تنظم الحركة، يمكن أن يؤدي تسليم الدواء بوساطة العدلات24 إلى زيادة خصوصية الدواء، وبالتالي تقليل الآثار الجانبية.

ومع ذلك، يمكن الجمع بين المزيد من التعديلات لتوسيع نطاق تطبيق المقالات المحددة أعلاه. على سبيل المثال ، في نموذج الماوس AA ، للحصول على الانطباع العام لتسلل الخلايا الالتهابية في المفصل ، يتم تشجيع الباحثين على هضم المفاصل الأنزيمية لإطلاق مجموعات الكريات البيض المقيمة ثم تطبيق قياس التدفق للعد السكان.

تتضمن البروتوكولات هنا ثلاث طرق لتقييم هجرة العدلات والتسلل. تطبيق هذه البروتوكولات مفيد لاكتشاف العلاجات المحتملة لRA وغيرها من الأمراض الالتهابية التي تنطوي على العدلات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم المنحة 81430099 و 31500704) ، ومشاريع التعاون والتبادل الدولي (رقم المنحة 2014DFA32950) ، وبرنامج البحوث من جامعة بكين للطب الصيني ( أرقام المنح BUCM-2019-JCRC006 و 2019-JYB-TD013).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1% Fast Green Solution Solarbio 8348b Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter
0.1% Safranin O Staining Solution Solarbio 8348a Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter
0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0 Sigma 324506 Sterile
100% Ethanol Beijing Chemical Works
100% Methanol Beijing Chemical Works
15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube Falcon 14-959-53A
23 G x 1 1/4" Needle BD 305120
26 G x 3/8" Needle BD 305110
3% bovine serum albumin (BSA) Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS
3% H2O2 Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol
3,3'-diaminobenzidine (DAB) kit ZSGB-BIO ZLI-9018
30 G x 1/2" Needle BD 305106
30% H2O2 Beijing Chemical Works
5 mL Syringe BD Z683574
50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube Falcon 14-432-22
50% Ethanol Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O
54.8% Percoll Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1×PBS, stand still
70% Ethanol Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O
70.2% Percoll Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1×PBS, stand still
80% Ethanol Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O
95% Ethanol Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O
Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution Beyotime C0165S
ANTIBODIES
Anti-Myeloperoxidase Antibody Abcam ab208670
Anti-Neutrophil Elastase Antibody Abcam ab21595
Automatic Hematology Analyzer Sysmex XS-800i
Bovine Serum Albumin (BSA) VWR 0332-100G
Complete Freund's Adjuvant, 10 mg/ml sigma 1002036152
Cover Slip CITOGLAS 10212432C
Dial Thickness Gauge Mitutoyo 7301
Eppendorf Microtubes, 1.5 mL Sigma Z606340
Foetal Bovine Serum (FBS) Premium PAN P30-1302
Gas Anesthesia System ZS Dichuang ZS-MV-IV
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) PPLYGEN C1309 This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining.
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-016-1A Sterile
Hematoxylin Staining Solution ZSGB-BIO ZLI-9609
Lipopolysaccharide (LPS) Sigma L3012
MEDIA AND SUPPLEMENTS
Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit Solarbio G1371
N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) Sigma 47729
Penicillin Streptomycin Solution, 100× Invitrogen 1514022
Percoll GE Healthcare 10245207 Density gradient medium
Permeabilization Buffer Mix 100 μL Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100
Phosphate Buffer Saline (PBS), 1× Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10×PBS, autoclaved
Phosphate Buffer Saline (PBS), 10× Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved
PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS
POWDER
Proteose Peptone Oxoid 1865317
Retrieval Buffer Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0
Retrieval Buffer A Stock for IHC Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5OH2O) in 200 mL dH2O
Retrieval Buffer B Stock for IHC Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H20) in 200 mL dH2O
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium Sigma R8758
RPMI-1640 Complete Medium RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin.
Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL BD 328421
Slide CITOGLAS 10127105P-G
SOLUTION
Stock Isotonic Percoll (SIP) Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10×PBS, stand still for 20 min
Wash Buffer in Air Pouch Assay Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS
Xylene Beijing Chemical Works

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Klein, C. Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes. Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).
  2. Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of Neutrophil Chemotaxis. Adhesion Protein Protocols. Coutts, A. S. Humana Press. Totowa, NJ. 23-35 (2007).
  3. Margraf, A., Ley, K., Zarbock, A. Neutrophil Recruitment: From Model Systems to Tissue-Specific Patterns. Trends in Immunology. 40, (7), 613-634 (2019).
  4. Bardoel, B. W., Kenny, E. F., Sollberger, G., Zychlinsky, A. The balancing act of neutrophils. Cell Host & Microbe. 15, (5), 526-536 (2014).
  5. Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49, (9), 1618-1631 (2010).
  6. Thieblemont, N., Wright, H. L., Edwards, S. W., Witko-Sarsat, V. Human neutrophils in auto-immunity. Seminars in Immunology. 28, (2), 159-173 (2016).
  7. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), e745 (2008).
  8. Filippi, M. D. Neutrophil transendothelial migration: updates and new perspectives. Blood. 133, (20), 2149-2158 (2019).
  9. Kouspou, M. M., Price, J. T. Analysis of cellular migration using a two-chamber methodology. Methods in Molecular Biology. 787, 303-317 (2011).
  10. Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis. PLoS One. 5, (12), e15309 (2010).
  11. Walheim, C. C., Zanin, J. P., de Bellard, M. E. Analysis of trunk neural crest cell migration using a modified Zigmond chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3330 (2012).
  12. Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil's Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99, (2), 1223-1248 (2019).
  13. Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3, (30), eaat4579 (2018).
  14. Tillack, K., Breiden, P., Martin, R., Sospedra, M. T lymphocyte priming by neutrophil extracellular traps links innate and adaptive immune responses. Journal of Immunology. 188, (7), 3150-3159 (2012).
  15. Puga, I., et al. B cell-helper neutrophils stimulate the diversification and production of immunoglobulin in the marginal zone of the spleen. Nature Immunology. 13, (2), 170-180 (2011).
  16. Strzepa, A., Pritchard, K. A., Dittel, B. N. Myeloperoxidase: A new player in autoimmunity. Cellular Immunology. 317, 1-8 (2017).
  17. Momohara, S., Kashiwazaki, S., Inoue, K., Saito, S., Nakagawa, T. Elastase from polymorphonuclear leukocyte in articular cartilage and synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis. Clinical Rheumatology. 16, (2), 133-140 (1997).
  18. Swamydas, M., Luo, Y., Dorf, M. E., Lionakis, M. S. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 110, (1), 3.20.1-3.20.15 (2015).
  19. Luo, Y., Dorf, M. E. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 22, (1), 3.20.1-3.20.6 (1997).
  20. Carlson, M., et al. Human neutrophil lipocalin is a unique marker of neutrophil inflammation in ulcerative colitis and proctitis. Gut. 50, (4), 501-506 (2002).
  21. Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6, (3), 173-182 (2006).
  22. Zhang, S., et al. Tanshinone IIA ameliorates chronic arthritis in mice by modulating neutrophil activities. Clinical and Experimental Immunology. 190, (1), 29-39 (2017).
  23. Forster, R., Sozzani, S. Emerging aspects of leukocyte migration. European Journal of Immunology. 43, (6), 1404-1406 (2013).
  24. Hu, L., et al. Neutrophil-Mediated Delivery of Dexamethasone Palmitate-Loaded Liposomes Decorated with a Sialic Acid Conjugate for Rheumatoid Arthritis Treatment. Pharmaceutical Research. 36, (7), 97 (2019).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics