Oppdage migrering og infiltrasjon av nøytrofiler hos mus

* These authors contributed equally
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her presenterer vi tre metoder for å vurdere nøytrofil migrasjon og infiltrasjon både in vivo og in vitro. Disse metodene kan brukes til å oppdage lovende terapeutiske midler rettet mot nøytrofil migrasjon.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Lu, Q., Yuan, K., Li, X., Jiang, H., Huo, G., Jia, W., Huang, G., Xu, A. Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice. J. Vis. Exp. (156), e60543, doi:10.3791/60543 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Nøytrofiler er et stort medlem av det medfødte immunsystemet og spiller sentrale roller i vertsforsvar mot patogener og patologiske inflammatoriske reaksjoner. Nøytrofiler kan rekrutteres til betennelsessteder via veiledning av cytokiner og chemokiner. Overveldende infiltrasjon av nøytrofiler kan føre til ukritisk vevsskade, for eksempel ved revmatoid artritt (RA). Nøytrofiler isolert fra peritoneal ekssudat reagerer på en definert kjemoattractant, N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), in vitro i Transwell eller Zigmond kammeranalyser. Luftposeeksperimentet kan brukes til å evaluere chemotaxis av nøytrofiler mot lipopolysakkarid (LPS) in vivo. Den adjuvant-induserte leddgikt (AA) musemodellen brukes ofte i RA-forskning, og immunohistokjemisk farging av fellesseksjoner med anti-myelopeproksil (MPO) eller antinøytrofile elastase (NE) antistoffer er en veletablert metode for å måle nøytrofil infiltrasjon. Disse metodene kan brukes til å oppdage lovende terapier rettet mot nøytrofil migrasjon.

Introduction

Nøytrofiler er den mest rikelig hvite blodlegemer og står for 50-70% av hele hvite blodlegemer befolkningen hos mennesker1. Nøytrofiler er en av de primære responderne under akutt betennelse. Nøytrofiler kan rekrutteres til betennelsessteder via veiledning av cytokiner og chemokiner utgitt av vev-resident celler2,3,4, som er mediert av interaksjoner mellom celle vedhesjon molekyler på overflaten av nøytrofiler og vaskulære endotelceller5. Nøytrofiler er grunnleggende for å være vert for forsvar og spille en rolle i patologiske inflammatoriske reaksjoner på grunn av deres kraftige evne til å skade vev via frigjøring av reaktive oksygenarter (ROS) og andre vevsskadelige molekyler3,6.

Tidligere studier har beskrevet flere nøytrofile isolasjonsprotokoller fra mus eller mennesker. Oh et al. demonstrerte en tetthet gradient separasjonmetode for å isolere menneskelige nøytrofiler fra hele humant blod7. Imidlertid er isolasjonen av tilstrekkelignøytrofiler fra museblod vanskelig på grunn av det lille blodvolumet. Alternativt kan et stort antall rene og levedyktige musnøytrofiler fremkalles fra museperitonealvæske, og disse rensede nøytrofiler kan brukes ex vivo til å undersøke flere aspekter av cellulære funksjoner ex vivo, inkludert nøytrofil infiltrasjon, migrasjon, chemotaxis, oksidativ trøkk, cytokin og nøytrofil ekstracellulær felle (NET) produksjon8. Transwell assays9 eller Zigmond kammer analyserer 10,11 kan brukes til å evaluere nøytrofil migrasjon in vitro. Luftposemodellen brukes til å evaluere migrering og infiltrasjon av nøytrofiler in vivo. Den subkutane luftposemodellen er en praktisk in vivo-dyremodell for å studere migrering av inflammatoriske celler.

Tradisjonelt ble nøytrofiler ansett som patogene eliminatorer i akutte faser av betennelse. Imidlertid har nyere funn vist at nøytrofiler er kompliserte celler som utfører en betydelig rekke spesialiserte funksjoner. Nøytrofiler kan regulere mange prosesser som akutt skade og reparasjon, tumorigenese, autoimmun respons og kronisk betennelse12,13. Nøytrofiler modulerer også adaptive immunresponser og kan regulere B-celler og T-celler14,15. Betydelig mangel på nøytrofiler fører til dødelighet eller alvorlig immunsvikt hos mennesker og nøytrofil uttømming hos mus fører til dødsfall, mens overdreven aktivering eller rekruttering av nøytrofiler i organer forårsaker flere immunsykdommer, som revmatoid artritt (RA) og systemisk lupus erythematosus (SLE)6. Nøytrofiler er de mest tallrike cellene i synovialvæsken til RA-pasienter. Nøytrofiler produserer store mengder myeloperoxidase (MPO) og nøytrofil elastase (NE) via nedbrytning, noe som forverrer bruskerosjon. MPO er et peroksidaseenzym som hovedsakelig uttrykkes i granulatet av nøytrofiler16. NE er forbundet med leddbrusk ødeleggelse17. MPO og NE kan brukes til å evaluere statusen for nøytrofil migrasjon og infiltrasjon i vevet til RA-pasienter.

Denne artikkelen gir tre konvensjonelle metoder for å evaluere migrering av normale nøytrofiler indusert både in vivo og in vitro, samt infiltrasjon av patologiske nøytrofiler i en mus felles-spesifikk betennelse modell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimentelle prosedyrer ble gjennomgått og godkjent av Beijing University of Chinese Medicine Animal Care and Use Committee.

MERK: C57BL/6 mus (7-8 uker gammel) ble brukt.

1. Nøytrofil isolasjon

  1. Oppkjøp av peritoneale ekssudatceller
    1. Forbered fersk 10% proteose peptoneløsning i ddH2O. Beregn volumet som trengs i henhold til antall mus.
      MERK: Angi antall mus som N, (2N+1) ml oppløsning må oppløses og filtreres på forhånd.
    2. Spray arbeidsområdet med 70% etanol. Bruk en insulininjektor til å tegne 1 ml peptoneoppløsning og utladningsbobler.
    3. Utfør den første intraperitoneale injeksjonen av 1 ml peptoneroppløsning per mus.
      1. Ta musen i en head-down posisjon med en hånd. Desinfiser injeksjonsstedet med alkohol-gjennomvåt bomullballer.
        MERK: Den foretrukne injeksjonsposisjonen ligger i det laterale aspektet av nedre venstre eller høyre kvadrant i magen.
      2. Infuse reagensene raskt. Injiser 1 ml i bukhulen til hver mus med insulininjektoren.
        MERK: Vinkelen mellom nålen og huden skal være ca. 15–30° for å unngå å skade tarmen eller andre organer.
    4. Tillat inflammatorisk respons å utvikle seg over natten. Etter 12 timer, utfør den andre injeksjonen på samme måte som den første injeksjonen.
    5. Tre timer etter den andre injeksjonen, fullt bedøve mus med 5% isofluran i 5 min i en gassanestesikammer med en hastighet på 2 L / min. Fjern bedøvede mus fra kammeret og ofre dem ved cervical dislokasjon.
      MERK: Tilstrekkelig dybde av anestesi sikres ved å klemme tærne før du flytter mus fra kammeret til enkeltpusteenheten. Bena bør ikke bevege seg når tærne er klemt.
      MERK: Alle følgende trinn bør behandles i en vevskulturhette.
    6. Spray musen med 70% etanol. Legg musen på en steril plastpute og fest lemmer med nåler.
    7. Bruk et sterilt sett med kirurgiske verktøy for å lage et horisontalt snitt (~ 1 cm) midt i underlivet. Løft huden i overlivet med tang og kutt langs midtlinjen av magen og utsett den intakte bukveggen.
    8. Injiser 5 ml sterilt RPMI-1640 komplett medium inn i bukhulen med en 30 G x 1/2"-nål. Sett nålen gjennom bukveggen med skråkant av nålen vendt opp og injiser hele volumet.
    9. Rist puten horisontalt i 5 min. Masser magen forsiktig flere ganger.
    10. Injiser en 23 G x 1 1/4"-nål i magens laterale rom. Trekk ut bukvæsken (~ 5 ml) og samle den i et 50 ml sentrifugerør.
      MERK: Plasser rørene på is så snart som mulig ved nøytrofilaktivering.
    11. Injiser ytterligere 5 ml komplett medium og gjenta prosedyren for å fjerne de gjenværende cellene fra bukhinnen. Basseng peritonealvæsken i 50 ml sentrifugerør.
    12. Sentrifuge den samlede peritonealvæsken ved 400 x g i 10 min ved romtemperatur (RT).
    13. Kast supernatanten. Resuspender cellene i 1 ml RPMI-1640 komplett medium.
      MERK: Ikke virvl for å unngå nøytrofilaktivering.
  2. Isolering av nøytrofiler
    1. Tilsett 4 ml nylagde 70,2 % tetthetgradientmedium (f.eks. Percoll) i et 15 ml sentrifugerør.
    2. Overlegg forsiktig 4 ml nylagde 54,8 % tetthetgradientmedium på gradientmediet på 70,2 % tetthet sveving sakte langs kanten av røret med skarpe pipettespisser i 15 ml sentrifugerør.
      MERK: Vær forsiktig for å unngå å forstyrre grensesnittet mellom det 54,8 % tetthetsgradientmediet og 70,2 % tetthetgradientmedium.
    3. Overlegg forsiktig 1 ml peritonealcellesuspensjon på toppen av 54,8 % tetthetgradient medium lag sakte med skarpe pipettespisser (figur 1A).
      MERK: Vær forsiktig for å unngå å forstyrre grensesnittet mellom cellesuspensjonen og 54,8 % tetthetgradientmedium.
    4. Sentrifuge ved 1500 x g i 30 min ved 22 °C uten bremsing.
    5. Samle nøytrofiler ved grensesnittet til 54,8% tetthet gradient medium og 70,2% tetthet gradient middels lag (Figur 1B) til et nytt rør.
    6. Tilsett 1 ml RPMI-1640 komplett medium til de innsamlede cellene og forsiktig resuspenderceller ved å forsiktig pipettere flere ganger. Sentrifuge ved 100 x g i 10 min ved RT og fjern forsiktig supernatanten.
    7. Gjenta vasketrinnet (trinn 1.2.6) én gang.
    8. Legg til 0,5 ml kulturmedium til pelleten og resuspender celler ved å forsiktig pipettere flere ganger. Ta en 50 μL aliquot for å telle cellene ved hjelp av en automatisk hematologianalysator.

2. Nøytrofil migrasjon analyse

  1. Mål nøytrofil migrasjon av Transwell analyse9 eller Zigmond kammeranalyse som tidligere beskrevet10,11.

3. Air veske analyse

  1. Første luftinjeksjon
    1. På dag 0, fullt bedøve mus med 5% isofluran i 3 min i en gassanestesikammer med en hastighet på 2 L / min, og opprettholde anestesi for hver mus i en enkelt pusteenhet med 2% isoflurane med en hastighet på 0,5 L / min.
      MERK: Tilstrekkelig dybde av anestesi sikres ved å klemme tærne før du flytter mus fra kammeret til enkeltpusteenheten. Bena bør ikke bevege seg når tærne er klemt.
    2. Bruk et 0,22 μm filter festet til en 5 ml sprøyte for å få 3 ml volum sterilisert luft.
    3. Løft den bakre huden til den bedøvede musen med pinsett og subkutant injiser 3 ml sterilisert luft ved hjelp av en 26 G x 3/8"-nål.
    4. Etter behandling fjerner du musene fra pusteenheten. Overvåk musene for å sikre at de er i live til de begynner å bevege seg rundt.
  2. Andre luftinjeksjon
    1. På dag 3 injiserytterligere 3 ml sterilisert luft i den tidligere etablerte luftlommen for å opprettholde luftposen som beskrevet i pkt. 3.1.
  3. Behandling
    1. På dag 6, 6 timer før offer, injiser ulike behandlinger i luftposen. Injiser 1 ml fosfatbufret saltvann (PBS) som en negativ kontroll. Injiser 1 ml 1 μg/ml LPS som positiv kontroll for å indusere lokal betennelse.
    2. Bedøve mus med 5 % isofluran i 3 min i et gassanestesikammer med en hastighet på 2 L/min, og vedlikehold anestesi for hver mus i en enkelt pusteenhet med 2 % isofluran med en hastighet på 0,5 L/min. Forbered vaskebufferen i henhold til Materialbordet.
      MERK: Tilstrekkelig dybde av anestesi sikres ved å klemme tærne før du flytter mus fra kammeret til enkeltpusteenheten. Bena bør ikke bevege seg når tærne er klemt.
    3. For hver luftpose, vask luftposen med 1 ml vaskebuffer og samle den inflammatoriske ekssudatet i et 15 ml sentrifugerør. Vask luftposen med 2 ml vaskebuffer 2x og samle den inflammatoriske ekssudatet i samme sentrifugerør.
    4. Sentrifuge ved 100 x g i 10 min ved RT. Kast supernatanten og resuspender celler i 1 ml vaskebuffer. Tell cellene for å kvantifisere nøytrofilforholdet ved hjelp av den automatiske hematologianalysatoren.
      MERK: Se representative resultater i figur 2.

4. Induksjon av adjuvant-indusert artritt (AA) musemodell

  1. Heng fullstendig Freunds adjuvans (CFA) ved å virvle minst 5 s, og trekk deretter 100 μL suspensjon i en insulininjektor.
    MERK: Vi anbefaler at du bruker helt ny CFA i eksperimenter for å sikre sterilitet.
  2. Bedøve mus som beskrevet i trinn 3.1.1.
  3. Merk den valgte poten og injiser 20 μL CFA i ankelleddet. Injiser 20 μL suspensjon i fire periartikulære flekker på den valgte poten (80 μL totalt).
  4. Fjern mus fra pusteenheten og legg de behandlede musene i et nytt kammer. Overvåk mus for å sikre at de puster til de gjenvinner evnen til å bevege seg.
  5. Hver tredje dag, vurdere felles diameter ved å måle ankelledd diameter ved hjelp av en lomme tykkelse måler (Figur 3A).
  6. Hver tredje dag, vurdere leddgikt alvorlighetsgrad ved leddgikt scoring kriterium (Figur 3C): 0, normal, ingen bevis på erytem og hevelse; 1, den mildeste leddgikt, erytem og mild hevelse begrenset til tarsals eller ankelledd; 2, moderat artritt, erytem og mild hevelse som strekker seg fra ankelen til tarsals; 3, alvorlig leddgikt, erytem og moderat hevelse som strekker seg fra ankelen til metatarsale ledd; 4, den mest alvorlige leddgikt, erytem og alvorlig hevelse omfatter ankel, fot og sifre, eller ankylose i lemmen.

5. Immunhistokjemisk farging av fellesseksjoner

  1. Felles isolasjon
    1. Ofr musen i avsnitt 4 ved hjelp av cervical dislokasjon etter anestesi med isoflurane. Spray musen med 70% etanol.
    2. Fjern huden og en del av muskelen fra bakbenet med pinsett og saks. Spray leddet med 70% etanol og fjern resten av musklene ved hjelp av et papirhåndkle.
    3. Fest ankelleddet i 4% paraformaldehyd i 2 dager ved RT. Decalcify leddet i 10% EDTA i 1 måned på RT og endre medium ukentlig.
    4. Bygg inn vevet i parafin og lag 4 μm tykke vevseksjoner.
      1. Plasser vev i en markert form med visse mengder flytende parafin. Kult kort.
      2. Sett tykkelsen på 4 μm og kutt skiver på et mikrotome. Flyteseksjoner i et 43 °C vannbad.
      3. Monter delene på lysbilder og legg lysbildene i ovnen ved 70 °C i 2 timer. For fremtidig bruk, bevar lysbildene ved -20 °C.
  2. Safranin O og rask grønn farging av fellesseksjoner
    MERK: Følgende fargingstrinn utføres på RT.
    1. Plasser lysbildene fra trinn 5.1.4.3 i et stativ og utfør følgende vask for å rehydrere ved RT: xylen i 5 min (3x), 100% etanol i 2 min (2x), 95% etanol i 2 min (2x), 70% etanol i 2 min og 50% etanol i 15 min. Vask i rennende vann fra springen i 3 min.
    2. Flekk i 0,1% rask grønn oppløsning i 5 min. Skyll i 1% eddiksyre i 10 s.
    3. Flekk i 0,1 % safranin O fargingsvæske i 20 min. Dypp skliene i følgende vask: 95 % etanol i 2 min (2x), 100 % etanol i 2 min (2x) og xylen i 2 min (2x).
    4. Monter vevsdelene og observere vevet under et mikroskop.
      MERK: Se representative bilder i figur 4A.
  3. Immunhistokjemisk farging for å visualisere nøytrofiler
    1. Stek parafinseksjonene i 2 timer ved 78 °C. Plasser lysbildene i et stativ og utfør følgende vask for å rehydrere ved RT: xylen i 15 min (2x), 100% etanol i 5 min (2x), 95% etanol i 5 min, 80% etanol i 5 min, H2O i 3 min og PBS i 3 min.
      MERK: Ikke la lysbildene tørke når som helst i løpet av dette trinnet.
    2. Legg til en dråpe permeabiliseringsbuffer for å dekke vevet. Inkubatseksjoner i fuktighetskontrollert brett ved 37 °C.
    3. Skyll sklier i PBS i 3 min (3x). Unngå å sneve vevet direkte.
    4. Utfør varmeindusert antigen epitop gjenfinning ved hjelp av en trykkkjele.
      1. Ordne lysbilder i et stativ. Fordyp lysbilder i trykkkjelen fylt med gjenfinningsbuffer.
      2. Sett trykkkjelen på en mikrobølgeovn. Sett mikrobølgeovnen på 600 W og varm opp lysbildene i 10 min.
      3. Etter koking, hold lysbildene i kjelen for å avkjøles til 90 °C. Ta ut lysbildene og skyll dem i PBS i 3 min (3x).
    5. Slukkende peroksidaseaktivitet i nylagde 3 % H2O2 ved RT i 15 min. Skyll sklier i PBS i 3 min (3x).
    6. Skisser en stor sirkel rundt prøven med en hydrofob penn, unngå å berøre prøven. Blokk med 3% storfe serum albumin (BSA) i et fuktighetskontrollert kammer ved 37 °C i 60 min.
    7. Fjern blokkeringsløsningen. Tilsett 50 μL PBS-fortynnet primær antistoff til hver seksjon raskt. Deretter inkubere lysbildene i en fuktighetsstyrt skuff ved 4 °C over natten.
      MERK: Ulike fortynningsforhold brukes til forskjellige antistoffer (1:25 for MPO og 1:20 for NE).
    8. På den andre dagen, ta ut skuffen og la den stå på RT i 30 min. Skyll deretter lysbildene i PBS i 3 min (3x).
    9. Tilsett 50 μL PBS-fortynnet sekundære antistoffer til vevet.
      MERK: Ulike fortynningsforhold ble brukt: 1:1000 for MPO og 1:1500 for NE.
    10. Inkubatet glir i fuktighetskontrollert skuff ved 37 °C i 30 min. Skyll deretter lysbildene i PBS i 3 min (3x).
    11. Utvikle smifra3,3'-diaminobenzidin (DAB) oppløsning i 5 min. Hold et øye med reaksjonen i tilfelle utvikling av en mørk farge. Skyll skliene i destillert vann.
    12. Motflekk lysbildene i hematoksysin i 10 s. Skyll skliene i vann fra springen i 5 min.
    13. Skyll i syrealkohol superrask differensieringsløsning for 3 s. Skyll deretter i vann fra springen i 10 min.
    14. Dypp lysbildene i følgende vask på RT: 80% etanol i 5 min, 95% etanol i 5 min, 100% etanol i 5 min og xylen i 15 min (2x). Fest dekksslipen med monteringsoppløsning. Vær oppmerksom på vevet under et mikroskop.
      MERK: Se representative bilder i figur 4B.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Peritoneale ekssudatceller ble samlet inn fra lavagevæske av mus. Celler ble suspendert på nytt i 1 ml RPMI-1640 komplett medium, lagdelt på en to-trinns (54,8% / 70,2%) seponert tetthet gradient (figur 1A),og sentrifugert på 1500 x g for 30 min. Nøytrofiler (≥95%, ~ 1 x 107 nøytrofiler / mus) ble gjenopprettet fra det nedre grensesnittet (Figur 1B).

Air pouch eksperimenter ble utført for å undersøke nøytrofil rekruttering stimulert av LPS in vivo (Figur 2A). Leukocytter-undersettene i luftposen ble målt (figur 2B).

Nøytrofil migrasjon i RA ble evaluert via CFA-indusert artritt murine modell. Sammenlignet med kontrollgruppen viste AA-gruppen betydelig ødem i poten. I AA-gruppen økte ankelledddiameteren (figur 3B) og leddgiktscoren steg konsekvent (figur 3D).

Bruskskade er det representative syndromet til RA, safranin O-rask grønn bruskfarging ble utført for å vurdere bruskskaden i AA-mus. Som vist i figur 4Ainduserte CFA-utfordringen en stor mengde leukocytterinfiltrasjon, signifikant bruskerosjon og synovial hyperplasi. MPO- og NE-uttrykksnivåer er representative markører for nøytrofilfiltrasjon. Immunohistokjemiske analyser ble utført for å observere nøytrofilinfiltrasjon i leddene. MPO og NE uttrykket ble betydelig oppregulert i fellesdelen (Figur 4B).

Figure 1
Figur 1: Nøytrofil isolasjon. (A) Peritoneal ekssudatceller resuspendert i 1 ml RPMI-1640 komplett medium ble lagdelt på en to-trinns (54,8% / 70,2%) gradering av den kan hets. (B) Etter sentrifugering på 1500 x g i 30 min, ble nøytrofiler (≥ 95%, ~ 1 x 107 nøytrofiler / mus) gjenopprettet fra det nedre grensesnittet. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Representative resultater av air pouch analyse. (A) Illustrasjon av luftposenanalyse. (B) Representative resultater av leukocytter subset infiltrasjon i luftposen analyse. PBS: kontroll; LPS: 1 μg/mL LPS. Data presenteres som gjennomsnittet ± SD. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Representative resultater av adjuvant-indusert artritt (AA) musemodell. (A) Ankelledddiameteren ble målt ved hjelp av en lommetykkelsesmåler. (B) Hevelse i ledd ble vurdert basert på ankelledddiameteren (n = 7). (C) Bilder av hver leddgikt score. (D) Alvorlighetsgraden av leddgikt ble gradert på en skala fra 0-4 poeng (n = 7). Data presenteres som gjennomsnittet ± SD. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Representative resultater av safranin O-rask grønn bruskfarging og immunohistokjemisk analyse av fellesseksjoner fra kontroll og AA-mus. (A)Representative resultater av safranin O-rask grønn brusk farging av felles seksjoner. (B) Representative resultater av uttrykksnivået til MPO og NE i ankelleddene. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detaljerte protokoller av svært rensede nøytrofiler fra perifert blod7,benmarg og vev18 har vært tilgjengelig i lang tid. Her vedtar vi en metode for å isolere nøytrofiler fra peritonealvæske19 hvor modne nøytrofiler forblir inaktiverte for ytterligere antiinflammatoriske og antioksidantstudier.

Vi brukte luftposeeksperimentet til å utforske LPS-indusert infiltrasjon av nøytrofiler in vivo. Denne metoden er foreslått som en potensiell metode for direkte måling av celleinfiltrasjon i det generelle inflammatoriske miljøet in vivo.

Det er bemerkelsesverdig at luftposen analysen bare demonstrerer nøytrofil funksjon på en organ-uspesifikk måte og fjerner flere trinn av leukocytter rekruttering kaskade. Siden nøytrofil rekruttering til bestemte organer kan stole på ulike organegenskaper, vedhendemolekyler og chemokiner, utforske nøytrofil funksjonell tilstand i organspesifikke forhold er av stor betydning for å studere rollen som nøytrofiler potensielt spiller i visse sykdommer3. Det har blitt foreslått at endepunktmodeller er nødvendig for å undersøke nøytrofilinfilrasjon. Derfor kan det å utføre immunohistokjemisk farging på ledddelene av mus i AA-modellen gi et innsiktsfullt perspektiv på nøytrofiler i fellesrommet. Ifølge våre data rekrutteres et stort antall nøytrofiler inn i leddvevet og fungerer som grunnleggende bevis for videre forskning på å avbryte infiltrasjonen av nøytrofiler for å behandle RA. I tillegg er omfattende analyser, for eksempel safranin O-rask grønn farging, pålagt å evaluere sykdomsmodellen for videre studier.

Nøytrofiler er den viktigste undergruppen av infiltrerende inflammatoriske celler og fungerer som den første forsvarslinjen mot invaderende patogener eller vevsskade20,21. Hvis nøytrofiler infiltrerer vev i stort antall, utskilles høye nivåer av cytokiner og NETs, noe som sammen kan overvelde beskyttelsesmekanismene i vev og føre til vevsskade. Vevsskade stimulerer ytterligere nøytrofilinfiltrasjon, og danner dermed en ond syklus22. Forstyrrer cellemigrasjon ved hjelp av fangst aktiverte celler i lymfoide organer har blitt foreslått som en viktig terapeutisk tilnærming og har blitt brukt i kliniske studier med ulike bivirkninger23. Å oppdage en ny behandling for samtidig å regulere nøytrofil migrasjon og inflammatorisk aktivitet er en lovende strategi for behandling av inflammatoriske sykdommer i fremtiden. Videre, hvis motilitetsregulerende midler kombineres, kan nøytrofilmediert legemiddellevering24 øke legemiddelspesifiteten, og dermed redusere bivirkninger.

Imidlertid kan ytterligere modifikasjoner kombineres for å utvide anvendelsen av ovennevnte analyser. For eksempel, i AA-musemodellen, for å oppnå det generelle inntrykket av infiltrasjon av inflammatoriske celler i leddet, oppfordres forskere til å enzymatically fordøye ledd for å frigjøre de bosatte leukocytterpopulasjonene og deretter bruke flytcytometri for å telle populasjonene.

Protokollene her i dokumentet inkluderer tre måter å vurdere nøytrofil migrasjon og infiltrasjon. Anvendelsen av disse protokollene er nyttig for å oppdage potensielle behandlinger for RA og andre inflammatoriske sykdommer som involverer nøytrofiler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (tilskuddsnummer 81430099 og 31500704), International Cooperation and Exchange Projects (stipendnummer 2014DFA32950), og forskningsprogrammet til Beijing University of Chinese Medicine ( gi tall BUCM-2019-JCRC006 og 2019-JYB-TD013).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1% Fast Green Solution Solarbio 8348b Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter
0.1% Safranin O Staining Solution Solarbio 8348a Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter
0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0 Sigma 324506 Sterile
100% Ethanol Beijing Chemical Works
100% Methanol Beijing Chemical Works
15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube Falcon 14-959-53A
23 G x 1 1/4" Needle BD 305120
26 G x 3/8" Needle BD 305110
3% bovine serum albumin (BSA) Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS
3% H2O2 Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol
3,3'-diaminobenzidine (DAB) kit ZSGB-BIO ZLI-9018
30 G x 1/2" Needle BD 305106
30% H2O2 Beijing Chemical Works
5 mL Syringe BD Z683574
50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube Falcon 14-432-22
50% Ethanol Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O
54.8% Percoll Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1×PBS, stand still
70% Ethanol Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O
70.2% Percoll Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1×PBS, stand still
80% Ethanol Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O
95% Ethanol Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O
Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution Beyotime C0165S
ANTIBODIES
Anti-Myeloperoxidase Antibody Abcam ab208670
Anti-Neutrophil Elastase Antibody Abcam ab21595
Automatic Hematology Analyzer Sysmex XS-800i
Bovine Serum Albumin (BSA) VWR 0332-100G
Complete Freund's Adjuvant, 10 mg/ml sigma 1002036152
Cover Slip CITOGLAS 10212432C
Dial Thickness Gauge Mitutoyo 7301
Eppendorf Microtubes, 1.5 mL Sigma Z606340
Foetal Bovine Serum (FBS) Premium PAN P30-1302
Gas Anesthesia System ZS Dichuang ZS-MV-IV
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) PPLYGEN C1309 This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining.
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-016-1A Sterile
Hematoxylin Staining Solution ZSGB-BIO ZLI-9609
Lipopolysaccharide (LPS) Sigma L3012
MEDIA AND SUPPLEMENTS
Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit Solarbio G1371
N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) Sigma 47729
Penicillin Streptomycin Solution, 100× Invitrogen 1514022
Percoll GE Healthcare 10245207 Density gradient medium
Permeabilization Buffer Mix 100 μL Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100
Phosphate Buffer Saline (PBS), 1× Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10×PBS, autoclaved
Phosphate Buffer Saline (PBS), 10× Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved
PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS
POWDER
Proteose Peptone Oxoid 1865317
Retrieval Buffer Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0
Retrieval Buffer A Stock for IHC Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5OH2O) in 200 mL dH2O
Retrieval Buffer B Stock for IHC Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H20) in 200 mL dH2O
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium Sigma R8758
RPMI-1640 Complete Medium RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin.
Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL BD 328421
Slide CITOGLAS 10127105P-G
SOLUTION
Stock Isotonic Percoll (SIP) Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10×PBS, stand still for 20 min
Wash Buffer in Air Pouch Assay Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS
Xylene Beijing Chemical Works

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Klein, C. Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes. Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).
  2. Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of Neutrophil Chemotaxis. Adhesion Protein Protocols. Coutts, A. S. Humana Press. Totowa, NJ. 23-35 (2007).
  3. Margraf, A., Ley, K., Zarbock, A. Neutrophil Recruitment: From Model Systems to Tissue-Specific Patterns. Trends in Immunology. 40, (7), 613-634 (2019).
  4. Bardoel, B. W., Kenny, E. F., Sollberger, G., Zychlinsky, A. The balancing act of neutrophils. Cell Host & Microbe. 15, (5), 526-536 (2014).
  5. Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49, (9), 1618-1631 (2010).
  6. Thieblemont, N., Wright, H. L., Edwards, S. W., Witko-Sarsat, V. Human neutrophils in auto-immunity. Seminars in Immunology. 28, (2), 159-173 (2016).
  7. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), e745 (2008).
  8. Filippi, M. D. Neutrophil transendothelial migration: updates and new perspectives. Blood. 133, (20), 2149-2158 (2019).
  9. Kouspou, M. M., Price, J. T. Analysis of cellular migration using a two-chamber methodology. Methods in Molecular Biology. 787, 303-317 (2011).
  10. Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis. PLoS One. 5, (12), e15309 (2010).
  11. Walheim, C. C., Zanin, J. P., de Bellard, M. E. Analysis of trunk neural crest cell migration using a modified Zigmond chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3330 (2012).
  12. Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil's Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99, (2), 1223-1248 (2019).
  13. Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3, (30), eaat4579 (2018).
  14. Tillack, K., Breiden, P., Martin, R., Sospedra, M. T lymphocyte priming by neutrophil extracellular traps links innate and adaptive immune responses. Journal of Immunology. 188, (7), 3150-3159 (2012).
  15. Puga, I., et al. B cell-helper neutrophils stimulate the diversification and production of immunoglobulin in the marginal zone of the spleen. Nature Immunology. 13, (2), 170-180 (2011).
  16. Strzepa, A., Pritchard, K. A., Dittel, B. N. Myeloperoxidase: A new player in autoimmunity. Cellular Immunology. 317, 1-8 (2017).
  17. Momohara, S., Kashiwazaki, S., Inoue, K., Saito, S., Nakagawa, T. Elastase from polymorphonuclear leukocyte in articular cartilage and synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis. Clinical Rheumatology. 16, (2), 133-140 (1997).
  18. Swamydas, M., Luo, Y., Dorf, M. E., Lionakis, M. S. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 110, (1), 3.20.1-3.20.15 (2015).
  19. Luo, Y., Dorf, M. E. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 22, (1), 3.20.1-3.20.6 (1997).
  20. Carlson, M., et al. Human neutrophil lipocalin is a unique marker of neutrophil inflammation in ulcerative colitis and proctitis. Gut. 50, (4), 501-506 (2002).
  21. Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6, (3), 173-182 (2006).
  22. Zhang, S., et al. Tanshinone IIA ameliorates chronic arthritis in mice by modulating neutrophil activities. Clinical and Experimental Immunology. 190, (1), 29-39 (2017).
  23. Forster, R., Sozzani, S. Emerging aspects of leukocyte migration. European Journal of Immunology. 43, (6), 1404-1406 (2013).
  24. Hu, L., et al. Neutrophil-Mediated Delivery of Dexamethasone Palmitate-Loaded Liposomes Decorated with a Sialic Acid Conjugate for Rheumatoid Arthritis Treatment. Pharmaceutical Research. 36, (7), 97 (2019).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics