大鼠复杂区域疼痛综合征I型慢性缺血后疼痛模型

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Summary

此处提供了一个协议,详细说明了建立慢性缺血后疼痛(CPIP)动物模型的步骤。这是一个公认的模型,模仿人类复杂的区域疼痛综合征I型。进一步评价机械和热超敏感性,以及在CPIP大鼠模型中观察到的辣椒素引起的角感行为。

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Hu, Q., Zheng, X., Chen, R., Liu, B., Tai, Y., Shao, X., Fang, J., Liu, B. Chronic Post-Ischemia Pain Model for Complex Regional Pain Syndrome Type-I in Rats. J. Vis. Exp. (155), e60562, doi:10.3791/60562 (2020).

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Abstract

复杂的区域疼痛综合征I型(CRPS-I)是一种神经系统疾病,在患者中引起剧烈疼痛,并且仍然是一个未解决的医疗状况。然而,CRPS-I的基本机制尚未透露。众所周知,缺血/再灌注是导致CRPS-I的主要因素之一。通过长期缺血和后肢再灌注,建立了大鼠慢性缺血后疼痛(CPIP)模型,以模仿CRPS-I。CPIP模型已成为研究CRPS-I机制的公认动物模型。该协议描述了建立CPIP大鼠模型所涉及的详细程序,包括麻醉,然后是后肢缺血/再灌注。通过测量后肢的机械和热超敏感性以及急性辣椒素注射的角质反应,进一步评价大鼠CPIP模型的特征。大鼠CPIP模型表现出几种CRPS-I样的表现,包括建立后早期后肢水肿和高血症,持续热和机械过敏,以及急性辣椒素注射增加的角质反应。这些特性使其成为进一步研究CRPS-I中涉及的机制的合适动物模型。

Introduction

复杂的区域疼痛综合征 (CRPS) 引起骨折、创伤、手术、缺血或神经损伤1、2、3引起的复杂和慢性疼痛症状。CRPS分为2个子类别:CRPS类型I和II型(CRPS-I和CRPS-II)4。流行病学研究表明,CRPS的流行率约为1:20005。CRPS-I,显示没有明显的神经损伤,可能导致慢性疼痛,并极大地影响患者的生活质量。目前可用的治疗方法显示治疗效果不足。因此,CRPS-I 仍然是一个需要解决的重要且具有挑战性的临床问题。

建立模仿CRPS-I的临床前动物模型对于探索CRPS-I背后的机制至关重要。为了解决这个问题,Coderre等人设计了一个大鼠模型,将长期缺血和再灌注到后肢,以重述CRPS-I6。据了解,缺血/再灌注损伤是CRPS-I7的主要原因之一。大鼠CPIP模型表现出许多CRPS-I样的症状,包括后肢水肿和高血症在模型建立后的早期阶段,其次是持续热和机械高灵敏度6。在此模型的帮助下,建议中央疼痛敏化、外周TRPA1通道激活和活性氧物种生成等对CRPS-I8、9、10作出贡献。我们最近成功地建立了CPIP大鼠模型,并进行了背根结核(DRGs)的RNA测序,内骨对受影响的后爪11进行内脏测序。我们发现了一些潜在的机制,可能参与调解CRPS-I11的疼痛过度敏感。我们进一步确定DRG神经元中的瞬态受体电位万能1(TRPV1)通道是CRPS-I12的机械和热超灵敏度的重要原因。

在这项研究中,我们描述了建立CPIP的老鼠模型所涉及的详细程序。通过测量机械和热超敏感性及其对急性辣椒素挑战的反应能力,我们进一步评估了大鼠CPIP模型。提出大鼠CPIP模型是进一步研究CRPS-I中相关机制的可靠动物模型。

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Protocol

动物规程经浙江医科大学动物伦理委员会批准。

1. 动物

  1. 从上海实验室动物中心获得雄性斯普拉格-道利(SD)大鼠(280~320克,8-10周龄)。在浙江中医药大学动物实验室动物中心饲养动物。请注意,繁殖条件应包括 12 h/ 2h 的光/暗周期,并保持温度稳定在 24°C。提供水和食物。请注意,本研究共使用了48只大鼠。有一点,在这个模型中,我们需要观察整个过程中的疼痛反应。如果应用止痛药,我们就无法成功建立疼痛模型。实验结束后,老鼠被牺牲了。

2. CPIP模型建立

  1. 用苯巴比妥钠(50毫克/千克,腹内注射[i.p.])麻醉所有大鼠(包括假鼠和CPIP模型组)。如有必要,使用高达 20 mg/kg/h 苯巴比妥 [i.p.] 维持麻醉。检查每只动物的反应,用钳子捏它的后爪或尾尖。确保大鼠在建立模型之前没有响应。在眼睛上放置兽医膏,以避免在手术过程中干燥。将麻醉大鼠放在37°C的加热垫上,进行以下操作。
  2. 缺血和后爪的再灌注
    1. 一旦大鼠被麻醉,用甘油润滑右后爪和脚踝。
    2. 将内径为 7/32 英寸(5.5 毫米)的 Nitrile 70 Durometer O 型环滑入 1.5 mL Eppendorf 管的较大侧(使用前切断卡帽)。小心地将后爪插入空心的 Eppendorf 管中,直到到达底部。
    3. 逐渐将O环从管子滑到靠近踝关节的右后肢,并放置3小时。
    4. 在缺血步骤后切断 O 型环 3 小时。仔细观察大鼠,直到它恢复足够的意识,以保持胸腔。请注意,接受麻醉的大鼠在完全恢复之前,不应将其放回其他大鼠的陪伴中。

3. 规范行为测试

  1. 将大鼠放在一个透明的Plexiglas室中,这个房间位于网状地板上。在任何行为测试之前,将大鼠活动0.5小时。
  2. 机械过敏症
    1. 在测试中使用 von Frey 灯丝(0.4、0.6、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、15.0 和 26.0 g 灯丝)。从中间灯丝 (4.0 g) 开始测试。垂直地将灯丝涂在后爪的中间平面上。稍微施加适当的力,将灯丝弯曲长达 5 s。突然收回后爪对刺激的反应被认为是一种尖利行为。在 -3、-2、-1 天每隔一天进行机械异位测试,直到第 13 天。
    2. 应用上下测试方法来测试阈值。应用迪克森方法计算50%爪提取阈值(PWT)13,14,15。
  3. 热超阿尔基西亚
    1. 使用哈格里夫斯的方法检查热超热性。直接将灯泡(50 W)发射的光束对准后爪,以测量爪子提取延迟 (PWL)。将 20 s 设置为截止阈值,以避免加热造成过度伤害。
    2. 每个后爪以 5 分钟间隔重复每个测试 3 倍。以这三个测试的平均数作为每只大鼠的PWL16。在 -3、-2、-1 天每隔一天进行热超节性测试,直到第 13 天。
  4. 辣椒素诱发急性角化行为
    1. 使用二甲基硫酸盐(DMSO)制备辣椒素原料溶液(200 mM),并在无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中进一步稀释至1:1000,用于后爪注射。PBS 中的最终 DMSO 浓度为 0.1%(仅在 PBS 中车辆包含 0.1% DMSO)。使用连接到 1 mL 注射器的 30 G 针头,以 50 μL 的体积将辣椒素或车辆注射到后爪(内平面内注射)。
    2. 记录注射后10分钟的电感行为(即舔、咬或退缩注射的爪子),然后像前面描述17、18、19那样进行量化。
  5. 动爪水肿评价:通过测量爪径的增加来评估后爪水肿。使用数字卡钳测量,并计算基基值与在不同时间点观察到的测试值之间的差异。在模型建立后,评估 15 分钟、24 小时、48 小时和 72 h 的爪子厚度变化。

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Representative Results

在脚踝上放置O环后,叶侧后爪皮肤出现青紫,指示组织缺氧(1A)。切割O环后,叶侧后爪开始充满血液,并表现出强健的肿胀,这显示了高血症的强烈迹象(1A)。爪子肿胀逐渐减少,并在缺血/再灌注程序后恢复正常的48小时(与Sidak的双向ANOVA,即位测试,1B)。所有这些迹象都符合以前的研究6,12。

然后,使用冯·弗雷头发测试测量机械过敏症。与假组相比,CPIP组的后爪在模型建立后1天表现出明显的机械性全侧。益西侧后爪的机械性异位肌一直持续到观察时间范围的13天(双向ANOVA与Sidak的后点测试,1C)。CPIP组的反向后爪也表现出类似于益边后爪的机械超节,持续13天(双向ANOVA与Sidak后测试,1D)。

然后,使用哈格里夫斯测试测量热超节。与假组大鼠相比,CPIP大鼠的双边后爪表现出显著减少的戒断延迟,以回应有害的热刺激,这是热增节症的标志(与假组大鼠相比(双向ANOVA与Sidak后特级测试,图1E,F)。这一观察结果与先前的研究11、12一致。益西侧后爪的热超节一直持续到观测时间范围结束,而反向后爪的热超节持续7天(与西达克的双向ANOVA,即点后测试,1E,F)。上述结果表明,CPIP大鼠产生强健和持久的机械和热超敏性,与先前的观测结果11,12一致。

CRPS患者在20日对辣椒素引起的疼痛表现出明显增加的反应。然后,研究CPIP大鼠模型是否可以重述这一现象。在CPIP大鼠的角性行为被观察到响应植物内辣椒素(TRPV1激动剂)注射到ipsi侧后爪。首先,对注射车辆时大鼠的感知反应进行了测试。假组对车辆喷射表现出轻微的轻微反应,而 CPIP 组表现出比假组高得多的响应(带有 Sidak 的单向 ANOVA,即点后测试,图 2)。此外,辣椒素注射导致在假组强健的角性反应(图2)。更重要的是,CPIP大鼠对辣椒素注射的反应明显高于假组(图2)。这些数据表明,CPIP大鼠对辣椒素表现出更强的抗性反应,这是一种模仿CRPS-I的人类患者的现象。

Figure 1
图1:CPIP大鼠模型显示双后肢的热和机械疼痛过度敏感。A) 在不同时间点(缺血期间,再灌注后10分钟,7天后)拍摄的典型图像。(B) CPIP 和假组的后爪厚度测量。(C,D) 50% 爪子提取阈值 (50% PWT, 机械超脂指数) 的益边 (C) 和反向 (D) 后爪的大鼠.(E,F)爪子戒断延迟(PWL,热超节指数)的益边(E)和反向(F)后爪大鼠(n = 8大鼠每组,\p <0.01)。结果表示为均值 = SEM(双向 ANOVA 后跟 Sidak 的特次测试)。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:CPIP大鼠在将辣椒素注射到叶西侧后爪中时,表现出与假大鼠相比更多的角性行为。大鼠在车辆后10分钟内(PBS,普天间0.1%DMSO)或辣椒素(50μL体积为10 nmol,普天间)注射(n = 每组8只大鼠,μp <0.01)后计算了大鼠舔、咬或退缩的累积时间。结果表示为均值 = SEM(单向方差分析后,Sidak 后特次测试)。请点击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

该协议描述了通过在大鼠后肢应用缺血/再灌注来建立大鼠CPIP模型的详细方法。它涉及评估后肢外观,水肿,机械/热过敏性,和急性角质行为,以回应辣椒素注射。

肢体缺血/再灌注是导致CRPS-I在人类患者12的常见因素。该协议描述了如何建立大鼠CPIP模型,这是一个常用的动物模型来概括人类CRPS-I6。在麻醉下,在大鼠的后肢诱导了缺血,在麻醉下用紧的O环在脚踝上涂了3小时。O 型环已移除,并发生重新灌注。模型建立后,CPIP模型大鼠在后肢出现早期高血症和水肿。该模型还显示神经病痛行为,包括持续的机械/热过敏。这些症状都模仿人类CRPS-I 21的典型特征。

CRPS患者表现出明显增加的反应,在受影响的四肢的辣椒素引起的疼痛20。然而,目前还不清楚CPIP模型动物是否表现出类似的反应。因此,在这项研究中,对CPIP大鼠的角性行为进行了检查,以响应将辣椒素注射到叶侧后爪中。结果发现,与假大鼠相比,CPIP模型大鼠对辣椒素注射的角性反应明显较高。据我们所知,这是CPIP模型大鼠首次报告这种现象。

在以前的研究中,TRPV1通道表达被证明在叶侧后爪组织和DRG神经元中向上调节,这些神经元对后爪12进行内侧分析。此外,还发现脊髓胶质细胞在CPIP模型大鼠中被激活,导致中央疼痛敏感和疼痛感知和传递9,12。因此,在CPIP模型大鼠中,对辣椒素注射的增角性行为可能同时涉及外周和中枢疼痛敏化。未来的研究是必要的,以测试辣椒素注射是否导致增强反应的逆后爪的CPIP模型大鼠,以及。在这里进行的测试中,我们没有观察到CPIP模型大鼠的自切除术。这与经过坐骨切片的老鼠形成对比,它们除了慢性疼痛过度敏感性22、23外,通常还发展为自体切除术。此外,CRPS-I患者或CPIP模式动物没有转诊疼痛反应报告。

模型中的关键步骤之一是在整个过程中保持麻醉。在这项研究中,麻醉是由苯巴比妥钠(50毫克/千克)的腹内注射引起的。这种剂量经常用于许多涉及大鼠麻醉的研究,包括与CPIP大鼠模型建立9,12,24的研究。此外,麻醉应通过20毫克/千克/小时(i.p.)苯巴比妥钠在必要时保持,以保证成功实施程序12,24。

在Coderre等人建立的初始CPIP模型中,当后爪尽可能地放入注射器的桶中时,O-ring实际上从3厘米3注射器的外侧滑落(切成两半)。在这里,在我们的研究中,我们对此方法做了一些小的修改。我们使用1.5 mL Eppendorf管(事先切断卡帽),而不是注射器,因为这种材料更容易接近,正好适合大鼠后爪的直径。O 型环可以很方便地放置在大鼠的脚踝部分,这种经过修改的方法无需受伤,便于建立模型。

目前,CPIP大鼠模型完全建立在雄鼠的基础上,包括我们目前的研究25。然而,应该指出,根据流行病学分析26、27,女性CRPS-I的发病率比男性患者更频繁。这进一步支持了发现,女性动物表现出更多的疼痛反应比雄性动物,当CPIP成立28。因此,今后有必要在雄性动物和雌性动物中建立CPIP模型。这对研究该模型的转化意义具有重要意义。

最后,这里介绍了建立大鼠CPIP模型的方法。该CPIP大鼠模型概括了人类CRPS-I的许多临床特征,其性质可使其成为研究CRPS-I的合适动物模型。

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Disclosures

作者声明在这项工作中没有利益冲突。

Acknowledgments

该项目由中国国家自然科学基金(81873365和81603676)、浙江省杰出青年自然科学基金(LR17H270001)和浙江中医药大学()资助。Q2019J01, 2018ZY37, 2018ZY19).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml Eppendorf tube Eppendorf 22431021
DMSO Sigma-Aldrich D1435
Capsaicin APEXBIO A3278
Digital caliper Meinaite NA
O-ring O-Rings West Nitrile 70 Durometer 7/32 in.
internal diameter
Plantar Test Apparatus UGO Basile, Italy 37370
von Frey filaments UGO Basile, Italy NC12775

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References

  1. Goh, E. L., Chidambaram, S., Ma, D. Complex regional pain syndrome: a recent update. Burns, Trauma. 5, (1), 2 (2017).
  2. Birklein, F., Ajit, S. K., Goebel, A., Rsgm, P., Sommer, C. Complex regional pain syndrome - phenotypic characteristics and potential biomarkers. Nature Reviews Neurology. 14, (5), (2018).
  3. Shim, H., Rose, J., Halle, S., Shekane, P. Complex regional pain syndrome: a narrative review for the practising clinician. British Journal of Anaesthesia. (2019).
  4. Urits, I., Shen, A. H., Jones, M. R., Viswanath, O., Kaye, A. D. Complex Regional Pain Syndrome, Current Concepts and Treatment Options. Current Pain, Headache Reports. 22, (2), 10 (2018).
  5. Helyes, Z., et al. Transfer of complex regional pain syndrome to mice via human autoantibodies is mediated by interleukin-1-induced mechanisms. Proceedings of National Academy Sciences of the United States of America. 116, (26), 13067-13076 (2019).
  6. Coderre, T. J., Xanthos, D. N., Francis, L., Bennett, G. J. Chronic post-ischemia pain (CPIP): a novel animal model of complex regional pain syndrome-Type I (CRPS-I; reflex sympathetic dystrophy) produced by prolonged hindpaw ischemia and reperfusion in the rat. Pain. 112, (1), 94-105 (2004).
  7. Coderre, T. J., Bennett, G. J. A hypothesis for the cause of complex regional pain syndrome-type I (reflex sympathetic dystrophy): pain due to deep-tissue microvascular pathology. Pain Medicine. 11, (8), 1224-1238 (2010).
  8. Klafke, J. Z., et al. Acute and chronic nociceptive phases observed in a rat hind paw ischemia/reperfusion model depend on different mechanisms. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 468, (2), 229-241 (2015).
  9. Tang, Y., et al. Interaction between astrocytic colony stimulating factor and its receptor on microglia mediates central sensitization and behavioral hypersensitivity in chronic post ischemic pain model. Brain Behavioral Immunology. 68, 248-260 (2018).
  10. Kim, J. H., Kim, Y. C., Nahm, F. S., Lee, P. B. The Therapeutic Effect of Vitamin C in an Animal Model of Complex Regional Pain Syndrome Produced by Prolonged Hindpaw Ischemia-Reperfusion in Rats. International Journal of Medical Sciences. 14, (1), 97-101 (2017).
  11. Yin, C., et al. Transcriptome profiling of dorsal root ganglia in a rat model of complex regional pain syndrome type-I reveals potential mechanisms involved in pain. Journal of Pain Research. 12, 1201-1216 (2019).
  12. Hu, Q., et al. TRPV1 Channel Contributes to the Behavioral Hypersensitivity in a Rat Model of Complex Regional Pain Syndrome Type 1. Frontiers in Pharmacology. 10, 453 (2019).
  13. Dixon, W. J. Efficient analysis of experimental observations. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 20, 441-462 (1980).
  14. Chai, W., et al. Electroacupuncture Alleviates Pain Responses and Inflammation in a Rat Model of Acute Gout Arthritis. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2018, 2598975 (2018).
  15. Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of Neuroscience Methods. 53, (1), 55-63 (1994).
  16. Fang, J. Q., et al. Parameter-specific analgesic effects of electroacupuncture mediated by degree of regulation TRPV1 and P2X3 in inflammatory pain in rats. Life Sciences. 200, 69-80 (2018).
  17. Tai, Y., et al. Involvement of Transient Receptor Potential Cation Channel Member A1 activation in the irritation and pain response elicited by skin-lightening reagent hydroquinone. Scientific Reports. 7, (1), 7532 (2017).
  18. Liu, B., et al. TRPM8 is the principal mediator of menthol-induced analgesia of acute and inflammatory pain. Pain. 154, (10), 2169-2177 (2013).
  19. Liu, B., et al. Oxidized Phospholipid OxPAPC Activates TRPA1 and Contributes to Chronic Inflammatory Pain in Mice. PLoS One. 11, (11), 0165200 (2016).
  20. Terkelsen, A. J., Gierthmuhlen, J., Finnerup, N. B., Hojlund, A. P., Jensen, T. S. Bilateral hypersensitivity to capsaicin, thermal, and mechanical stimuli in unilateral complex regional pain syndrome. Anesthesiology. 120, (5), 1225-1236 (2014).
  21. Drummond, P. D., Morellini, N., Finch, P. M., Birklein, F., Knudsen, L. F. Complex regional pain syndrome: intradermal injection of phenylephrine evokes pain and hyperalgesia in a subgroup of patients with upregulated alpha1-adrenoceptors on dermal nerves. Pain. 159, (11), 2296-2305 (2018).
  22. Minert, A., Gabay, E., Dominguez, C., Wiesenfeld-Hallin, Z., Devor, M. Spontaneous pain following spinal nerve injury in mice. Experimental Neurology. 206, (2), 220-230 (2007).
  23. Kingery, W. S., et al. Capsaicin sensitive afferents mediate the development of heat hyperalgesia and hindpaw edema after sciatic section in rats. Neuroscience Letters. 318, (1), 39-43 (2002).
  24. Xu, J., et al. Activation of cannabinoid receptor 2 attenuates mechanical allodynia and neuroinflammatory responses in a chronic post-ischemic pain model of complex regional pain syndrome type I in rats. European Journal of Neuroscience. 44, (12), 3046-3055 (2016).
  25. Coderre, T. J., Xanthos, D. N., Francis, L., Bennett, G. J. Chronic post-ischemia pain (CPIP): a novel animal model of complex regional pain syndrome-type I (CRPS-I; reflex sympathetic dystrophy) produced by prolonged hindpaw ischemia and reperfusion in the rat. Pain. 112, (1-2), 94-105 (2004).
  26. Weissmann, R., Uziel, Y. Pediatric complex regional pain syndrome: a review. Pediatric Rheumatology Online Journal. 14, (1), 29 (2016).
  27. Kim, H., Lee, C. H., Kim, S. H., Kim, Y. D. Epidemiology of complex regional pain syndrome in Korea: An electronic population health data study. PLoS One. 13, (6), 0198147 (2018).
  28. Tang, C., et al. Sex differences in complex regional pain syndrome type I (CRPS-I) in mice. Journal of Pain Research. 10, 1811-1819 (2017).

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