通过基因表达分析的改良方法从谷物种子获取高质量的转录数据

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Summary

提出了谷物转录分析的方法。基于微阵列的基因表达分析从谷物中分离高质量的总RNA开始,并随着cDNA的生成而继续。在cRNA标签和微阵列杂交后,提出了信号检测和质量控制的建议。

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Butardo Jr., V. M., Seiler, C., Sreeenivasulu, N., Kuhlmann, M. Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling. J. Vis. Exp. (159), e60602, doi:10.3791/60602 (2020).

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Abstract

基因表达的表征取决于RNA质量。在发芽、发育和成熟的谷类种子中,优质RNA的提取往往受到淀粉和糖含量高的阻碍。这些化合物可以降低提取的总RNA的产量和质量。总RNA数量和质量的恶化随后会对下游转录分析产生重大影响,而下游转录分析可能无法准确反映被检测样本基因表达图谱的空间和/或时间变化。在该协议中,我们描述了一种提取总RNA的优化方法,其数量和质量足以用于谷物的整个转录分析。所述方法适用于用于开发、发芽和成熟谷类种子的转录分析的几个下游应用。显示了使用微阵列平台的转录分析方法。该方法是专门为具有描述基因组序列的谷物的基因表达分析而设计的。介绍了从微阵列处理到最终质量控制的详细过程。这包括 cDNA 合成、cRNA 标签、微阵列混合、幻灯片扫描、特征提取和数据质量验证。该方法生成的数据可用于描述谷物在发芽过程中、谷物发育的不同阶段或不同生物或非生物应激条件下的转录。此处提供的结果为下游生物信息学分析提供了高质量的转录素数据,例如确定表达的差异基因(DEGs)、基因调控网络的特征以及进行转录光全体关联研究(TWAS)。

Introduction

转录素代表一组完整的核糖核酸(RNA)记录,由生物体的基因组在给定时间,特别是环境和生长条件下表达。每个细胞都有其各自的转录,反映其目前的生理和代谢状态。从类似组织或器官中提取的细胞集合用于典型的转录组研究,但单细胞和空间解析的转录组正在流行1。转录分析从特定时间点和在定义的生长条件下从选定组织提取总RNA开始。为此,我们建议使用新开发的方法从高淀粉或糖含量的样品中提取总RNA,如谷物种子2。不同样本的转录因子比较导致对不同丰度的RNA分子进行鉴定。这些RNA分子被认为是表达的差异基因(DEGs)。然后,从特定标记基因派生的笔录的丰度可用于估计发育状态或确定生物体对环境波动的反应。在所研究的发育时间点上,其笔录丰度没有可检测到变化的基因通常被用作参考或内务基因。

RNA通常通过各种方法进行检测和量化,例如北方印迹和定量逆转录酶聚合酶链反应(qRT-PCR),但目前高通量转录组方法严重依赖使用微阵列技术和RNA测序(RNA-Seq)的核酸杂交。RNA-Seq目前非常流行,因为它为高通量转录学应用提供了几个优势,如其他地方33、4。4虽然是一种较老的技术,但使用微阵列芯片的基因表达分析仍然被广泛应用,因为它是一种较为成熟的技术,在生物信息学方面只需要较少的背景。与RNA-Seq相比,微阵列实验产生的数据集更小,更易于分析。此外,它还更具成本效益,尤其是在处理大量样本时。在我们的实验室中,我们经常使用转录学分析,使用微阵列技术来确定中央调控中心的作用,这些,中心控制谷物5、6、7、8、96,的生长、发育和代谢所涉及的分子网络和途径58,97我们还经常用它来进行全基因组基因表达分析研究,以获得对谷类谷物对非生物胁迫的反应的机械理解10,以及进行转录血对数(TWAS)和链接映射研究,以确定负责谷物质量和营养的基因11,12。,12其他团体也利用微阵列技术在,大麦13、水稻14、15、16、高梁17和小麦18中提供开发特异性基因17表达图集。14,151618

本出版物的目的是提供一个简短的文本摘要和详细的视觉描述,我们目前在我们的实验室采用的方法,使用安捷伦微阵列平台对谷物进行转录分析。请注意,其他微阵列平台可用,但此方法将不包括在内。我们首先介绍了从开发或发芽谷类种子中提取RNA的详细说明。根据我们的经验,获得高质量、高量的转录组,适应下游转录分析往往是使用谷类种子组织的瓶颈。我们已经尝试了几个商业上可用的RNA提取试剂盒,但没有一个提供令人满意的结果。因此,我们开发了一种化学萃取协议,以获得一种粗RNA提取物,然后使用市售试剂盒进行柱式纯化。使用这种方法,我们定期和可重复地获得高质量的RNA2(图1),可用于不同的下游应用,以生成转录图谱。

Protocol

1. 总RNA提取和纯化

注:始终在烟罩下工作,因为这种方法涉及使用有害的挥发性有机溶剂。在开始实验之前,在50°C热块中预加热无核酸水的微熔管。这种无核酸水将用于从步骤1.8中的自旋柱中分离出总RNA。

  1. 另外,使用消毒的砂浆和在液氮中预冷却的虫子,将样品(每个样本至少三个生物复制体)研磨成细粉末。
    1. 使用浸入液氮的小金属铲将粉末状样品倒入 2.0 mL 无核酸化微熔管中,同时预浸于液氮中。立即将样品存放在超低温冷冻室(-80°C),直到分配用于批量RNA提取(STOP POINT)的一天。
      注:种子样品可以磨成细粉,有或不脱粒。对于大米,我们通常研磨样品而不脱壳,因为外壳含有二氧化硅,可以在研磨过程中帮助。
      注意:此步骤必须在严格低温条件下快速完成。自动化的一个选择是使用低温球磨机研磨样品,以尽量减少RNA降解和质量恶化。
  2. 使用大约 200 毫克的原始粉末样品获取粗RNA提取物。单独将每个样品添加到含有750μLRNA提取缓冲液(100 mM Tris、pH 8.0、150 mM LiCl、50 mM EDTA、1.5%SDS、1.5%2-汞酮乙醇)和500μL苯酚:氯仿:硫酰(25:24:1)的无核酸微熔管中。
    1. 使用高速设置的多管涡旋混合器,在室温下同时混合所有样品 5 分钟。立即将所有管子放在冰上两分钟。
      注意:始终在烟罩内工作,尤其是涉及苯酚、氯仿和其他有机溶剂的所有步骤。理想情况下,使用宽烟罩,可以容纳一台台式离心机、涡旋混合器、多管涡旋混合器和多管旋转混合器。
  3. 在14,000 x g的离心下将粗RNA提取物从碎片中分离10分钟。在此部分的相同设置中执行所有离心步骤。
    1. 将大约 800 μL 的上清液转移到含有 400 μL 1.2 M NaCl 和 700 μL 异丙醇的新型 2.0 mL 微熔管中。通过反转 5x 轻轻混合溶液。
    2. 通过在常规(-20°C)或超低温冷冻室(-80°C)孵育至少1小时(或过夜)沉淀RNA。
      停止或暂停点:只需将样品保持在常规 -20°C 冰柜中,暂停几个小时。对于过夜或较长的停止点,将样品存放在超低温冰柜 (-80 °C) 中。
  4. 在18,800 x g的离心下获得一个粗RNA颗粒,15分钟。丢弃上清液后,使用微型试剂盒(材料表)通过柱纯化纯化粗RNA颗粒。
    1. 将颗粒溶解在新鲜制备的 450 μL RLT 缓冲液中(在使用前,每 100 mL RLT 缓冲液中加入 100 μL 的 β-甲醇,每天新鲜制备)。通过在多管涡旋混合器中混合所有管在室温下至少 5 分钟,增强所有颗粒的溶解性。
  5. 通过紫色迷你旋转柱,用2 mL收集管来净化溶解的RNA颗粒。在室温下离心1分钟,在9,000 x g下,并丢弃紫色迷你旋转柱。
    1. 将 0.5 体积的绝对乙醇 (±225 μL) 添加到 2 mL 收集管中的清除电解质中。使用相同的塑料尖端混合溶液,向上和向下移液几次。
  6. 通过立即将溶液转移到带有 2 mL 收集管的粉红色迷你旋转柱,收集纯化 RNA。在 9,000 x g下离心 15 秒,将RNA收集到粉红色最小旋转柱的硅膜上。在9,000 x g的15 s下,以350μL的缓冲RW1离心,丢弃流和洗涤RNA。
  7. 通过将稀释后的DNase 1(50 μL冷冻DNase原料+ 350 μL的RDD使用DNase集)直接加入膜,并在室温下孵育至少15分钟(PAUSE POINT),去除污染基因组DNA。
    1. 通过加入 350 μL 的 RW1 并以 9,000 x g旋转 15 s. 重复两次,但这次用 500 μL 的缓冲 RPE 冲洗,从而洗掉 DNase 1。转移到一个新的2 mL收集管,并在9,000 x g旋转2分钟干燥。
  8. 将干燥的旋转柱转移到新的 1.5 mL 无核酸收集管。加入50μL的无核酸水(在50°C预暖),在50°C热块下孵育3分钟,开始纯化RNA提取物的洗脱过程。
    1. 孵育后,将RNA提取物总提取物从心放在9,000 x g上1分钟。立即将所有样品放在冰上。
  9. 使用各自的制造商协议,在纳米滴和生物分析仪中运行适当的稀释液(通常为1:10),确定总RNA提取物的数量和质量。RNA提取物至少应具有8.0的RIN值和50纳克/μL的浓度。图1显示了从大麦叶和种子中获得的RNA提取物的典型结果。
    停止点:将样品存放在-80°C中,直到使用。

2. cDNA合成,后经cRNA转录和标签

注:此步骤适用于同时处理 24 个样品。建议在一天内连续执行整个步骤,但会确定可选的停止点和暂停点。在开始以下步骤之前,请务必在 80°C、65 °C 和 37 °C 下预热三个微熔管热块。这些温度设置将更改,如以下步骤所述。例如,在准备 Spike 混合后(或者如果之前已准备好),37 °C 热块将设置为 40°C。根据制造商的说明,使用低输入快速放大器基因表达标签套件(参见材料表)准备单色尖峰混合、T7 启动器混合和 cDNA 主混音。这种制备取决于起始RNA提取物的量,通常总RNA为10至200纳克,聚脂酸酯为5纳。我们经常使用50 ng总RNA作为微阵列杂交2的起始材料,以及下面将介绍的方法。在为 24 个样本准备主混合物时,添加 2 个额外的反应以考虑移液变异。在此步骤中,始终使用无核酸微熔管和无核酸水。

  1. 由于产量高,通常稀释RNA提取物100倍,以适应50-100纳克的范围。基于步骤 1.9 中的 RNA 定量结果,通过在 1.5 mL 微熔管中加入 1 μL 纯化RNA提取物,使 1:100 稀释。使用纳米滴确定这种稀释的实际浓度。
    1. 在1.5mL微熔胶管中对每个总RNA样品进行第二次稀释,使总RNA的50纳克最终体积为1.5μL。
  2. 根据制造商的说明准备 Spike 混合。这一步也总结在Püffeld等人2019年2。为此,请使用 37 °C 热块。将单色尖刺的第一次和第二次稀释混合正控制储存在超低温冰柜 (-80 °C) 中,并且只经过八个重复的冻结/解冻周期。
    1. 每天准备第三和第四稀释。使用前,解冻并储存在冰上的第三和第四稀释尖刺混合物。
      注:在准备 Spike 混合时(或者如果以前已准备好),将 37 °C 热块的温度转换为 40 °C。
  3. 在使用前准备 T7 促销器混合物并储存在冰上。以下内容足以满足 24 个样本:
    20.8 μL T7促进剂底漆
    • 26.0 μL 无核酸水
    • 总体积 T7 启动器混合的 46.8 μL
  4. 将 1.8 μL 的 T7 促进剂底漆混合物(步骤 2.3)添加到每个微熔体管中,该管含有步骤 2.1 中的 1.5 μL 50 纳RNA 样品。通过移液几次,正确混合组件。通过在65°C热块中孵育10分钟,使RNA模板底漆混合变性。立即将微熔管放在冰上,为下一步做准备。
  5. 在变性模板底漆混合物(步骤 2.4)时,在 80°C 预热 5x 第一链缓冲液至少 4 分钟。 根据制造商的说明,从低输入快速放大器标签套件(参见材料表)快速准备 cDNA 合成主混合物(参见材料表)。以下内容足以应对 24 种反应:
    52.0 μL 预热 5x 第一链缓冲液(步骤 2.5)
    • 26.0 μL 0.1M DTT
    • 13.0 μL 的 10 mM dNTP 混合
    • 31.2 μL 的 RNase 块混合
    • 总体积 cDNA 合成主混合的 122.2 μL
    1. 解冻冰上的每个部件。通过温和的移液混合每个分量。使用前,将主混合保持在室温下。
      注意:使用后应立即将 RNase 块混合重新放入 -20°C 冰柜中。
  6. 取出冰上的RNA模板底漆混合物(步骤2.4),在室温下短暂离心,将所有内容物旋转到微熔管的底部。为每个管分配4.7 μL的cDNA主混合(步骤2.5),通过上下移液仔细混合。添加所有组件时的总体积应为 8.0 μL。
    1. 在40°C热块中合成2小时cDNA。在 2 h 的孵育过程中,将 65°C 热块的温度移至 70°C,为热失活做准备(步骤 2.7)。
      可选暂停点:将样品存放在 -80°C 过夜。实验可以在热失活后的第二天继续进行(步骤2.7)。
  7. 将每个管在 70°C 热块中孵育 15 分钟,以加热灭活 RNase 块混合。立即将管子转移到冰上,孵育至少5分钟。
  8. 当样品在冰上5分钟(步骤2.7),快速准备转录主混合。所有组件都可以在室温下组合,但可在冰上解冻部件。以下内容足以满足 24 个样本:
    19.5 μL无核酸水
    • 83.2 μL 的 5 倍转录缓冲液
    • 15.6 μL 0.1M DTT
    • 26.0 μL 的 NTP 混合
    • 5.5 μL T7 RNA聚合酶混合物
    • 6.2 μL 的氰氨酸 3-CTP (Cy3)
    • 总体积转录主混合的 156.0 μL
    注意:T7 RNA聚合酶混合物应保存在-20°C冰柜中,并在使用后立即放回。此外,Cy3对光敏感。因此,混合(步骤 2.9)和点胶(步骤 2.10)应在低光照条件下进行。为此,我们通常会关闭实验室工作台正上方的任何光线。
  9. 由于管子受到突然加热和冷却(步骤 2.7),使用微离心机短暂旋转每个样品的内容,以收集每个微熔管底部的所有液体。通过轻轻上下移液,加入6 μL的转录主混合(步骤2.8)。此反应的总量在此阶段应为 16 μL。在40°C下孵育管2小时,以产生Cy3标记的cRNA。
    可选停止点:转录后,管子可以储存在-80°C。
  10. 在生成 cRNA(步骤 2.9)时,将热块的温度设置为 55°C。在热块中加入至少一个无核酸水的微熔管。这种无核酸水将用于纯化cRNA的洗脱。
  11. 在 cRNA 转录和标记后,使用 RNeasy Mini Kit 进行纯化标记的 cRNA,详见步骤 3 中。

3. cRNA 纯化

  1. 使用 RNeasy 迷你套件净化标记的 cRNA(参见材料表)。根据制造商的说明准备缓冲区。例如,缓冲 RPE 以集中形式在套件中提供。使用前,加入4卷分子生物学等级绝对乙醇(96-100%)。
  2. 在每个样品中加入84μL的无核酸水,将总体积调整到100μL。然后,在每个管中加入350μL的缓冲RLT和250μL的绝对乙醇。通过移液彻底混合。
  3. 将每种混合物的 700 μL 转移到带有 2 mL 收集管的迷你旋转柱上。在4°C时以7,534 x g的离心30s将标记的cRNA收集到膜上。丢弃流通液体。
  4. 在 500 μL 的缓冲 RPE 中清洗每个样品。与上一步一样,离心并丢弃流速。重复此步骤一次,然后转到下一步。
  5. 将迷你旋转柱传输到新的收集管中。如步骤 3.3 中一样,通过离心干燥样品。
  6. 将迷你旋转柱转移到套件随附的无核酸 1.5 mL 微熔管中。通过直接将30μL的无核酸酶(在55°C预热)直接加入膜过滤器,将每个标记的cRNA样品贴上标签。通过在55°C热块中孵育60s,增强洗脱。
  7. 在室温下以7,535 x g的30 s离心收集标记的cRNA。丢弃旋转柱并关闭每个微熔管。立即将每个管放在冰上。
    可选停止点:样品在洗脱后可储存在-80°C。
  8. 使用微阵列功能用纳米滴量化cRNA。将样品设置为RNA-40。获取以下值并在电子表格中记录:氰素3染料浓度(pmol/μL)、RNA吸收率(260 nm/280 nm)和cRNA浓度(ng/μL)。
    停止点:读取后立即将 cRNA 样品储存在 -80°C。
  9. 计算 cRNA 产量和特定活动,详见 Püffeld 等人 20192.

4. 微阵列混合和扫描

注:此步骤只需 3-4 小时,因此 24 个样品的杂交可以在午餐后开始。一个操作员可以舒适地运行多达 4 张幻灯片(32 个示例)。第二天早上分配给扫描和扫描微阵列幻灯片。然后,可以在第二天的下午执行其他跑步。重复此步骤,直到对所有样本进行混合和扫描。强烈建议使用无色无粉乳胶手套处理和处理幻灯片,以确保样品不会受到可能干扰微阵列分析的彩色颜料的污染。除了商业上可用的微阵列外,以下自定义阵列由我们集团设计,可从安捷伦订购:大麦(霍迪姆莫勒尔)订购代码028827,大米054269(OryzasativaOryzasativa subs.Japonica),054270(奥里萨萨蒂瓦子子,印度)和小麦048923(聚三聚三指)。 Japonica

  1. 使用基因表达混合工具包执行微阵列杂交(参见材料表)。根据制造商的规格2准备10倍的拦截剂。将 10x 阻滞剂报价到 200 μL 份中,并储存在 -20 °C,直到使用。每个等号足以进行多达 40 次杂交,并且稳定长达 2 个月。
  2. 在分配微阵列杂交的当天,在冰上解冻一个200μL的10倍阻塞剂。此外,将杂交炉预热至65°C,并将热块预热至60°C,用于cRNA破碎期间。
  3. 按照制造商2所述,为每个示例准备碎片混合。在我们的实验室中,我们经常使用 600 ng 线性放大的 Cy3 标记的 cRNA 在 8 包微阵列中进行杂交。在这种情况下,下面的列表总结了每个示例碎片混合的组件:
    600 ng 线性放大 cRNA,氰化物 3 标记
    • 5 μL 的 10x 阻滞剂
    使用无核酸水将体积调整至 24 μL
    • 1 μL 的 25x 碎片缓冲器
    • 总体积碎片混合的 25 μL
    1. 使用涡旋混合器轻轻混合样品。使用微离心机短暂旋转所有样品。
  4. 孵化60°C热块中的所有样品整整30分钟。立即冷却冰上每根管子一分钟,然后迅速进入下一步。
  5. 要完全停止碎片反应,向每个管添加 2 倍 GEx 杂交缓冲液 HI-RPM。通过上下移液轻轻混合,非常小心,在混合过程中不要引入任何气泡。我们经常使用25μL的混合缓冲器来阻止8包微阵列格式的碎片反应。
  6. 在环境室温下,在 15,750 x g下,将所有管离心 1 分钟。快速将所有管放在冰上,并尽可能快地装载每个样品。
  7. 在离开实验室进行 17 h 夜间孵育之前,请准备视频中详述的杂交组件2。
    1. 关键步骤:转移每个混合组合,并在每个垫片井的中心缓慢分配,观察在点胶过程中不要引入任何气泡。对于 8 包微阵列格式,我们经常使用 44 μL 的混合混合组合。还将 44 μL 的 1x 杂交缓冲液放置在任何未使用的井中。
    2. 立即将方向正确的微阵列滑块放在垫片滑块顶部。这需要非常小心,以免溢出任何液体。紧紧关闭混合组件并旋转以检查是否引入永久气泡。所有气泡都应在垫片滑道内移动。
  8. 将混合室组件放入混合式烤箱旋转器中。如果使用 2x GEx 混合缓冲器,则将旋转速度设置为 10 rpm,并在 65 °C 下混合,正好 17 小时。
  9. 使用基因表达洗涤缓冲套件清洗混合微阵列(参见材料表)。根据制造商的说明2准备基因表达洗涤缓冲区1和2。在两个缓冲器中加入 2 mL 的 10% Triton X-102(纯可选但强烈建议降低微阵列洗涤伪影的发生率)2
  10. 准备三个洗涤室组件,如上一出版物2中详细说明的那样。下面列出了每个洗涤室的详细信息(表 1)。
  11. 在 1 L 试剂瓶中提供 500 mL 的洗涤缓冲液 1,并在环境室温下离开。准备一个额外的1升试剂瓶和标签与"洗涤缓冲器1重复使用",以保存洗涤缓冲液从第一个腔室。此外,在试剂瓶中分值500 mL的洗涤缓冲液2,并在37°C水浴中孵育过夜。
    注:在未准备步骤 4.9 到 4.11 的情况下,请勿离开实验室。第二天洗涤步骤是必须的。
  12. 第二天,按照表2中详细说明的准备洗涤缓冲器。将每道菜填充到相应缓冲区的四分之三。每个洗涤缓冲器适用于多达 4-5 张幻灯片。
  13. 经过整整17小时的杂交后,获得一个杂交室,并在实验室的长凳上拆解无绒纸,如上一出版物2中详述的那样。
    1. 关键步骤:将微阵列三明治转移到第 1 道菜。确保微阵列条码朝上倾斜位置,并避免将整个幻灯片浸入缓冲区中。从两端处理每个微阵列幻灯片,避免接触幻灯片的活动侧。
    2. 使用钳子2分隔两个玻璃幻灯片。让垫片轻轻滑入 Dish 1 的底部,同时确保将微阵列滑块牢固地固定在下一步。
  14. 关键步骤:缓慢地抬起微阵列侧向滑动,并立即传输到 Dish 2 中的微阵列机架中,如上一出版物2中所述。微阵列幻灯片对空气的暴露程度极低,这一点至关重要。
    1. 重复步骤 4.13 和 4.14,直到机架中包含八张幻灯片。沿机架均匀分布微阵列幻灯片。此步骤可以由一个操作员在无人协助的情况下完成,最多只能进行 4 张幻灯片。将机架支架连接,并将整个 Dish 2 设置转移到第一个磁性搅拌器上。轻轻搅拌 1 分钟。
  15. 搅拌 1 分钟(步骤 4.14),从迷你 37 °C 培养箱转移第 3 道菜,放在第二个磁性搅拌器顶部。轻轻地将洗涤缓冲液 2(从 37 °C 水浴)放在第 3 道菜上。浇注时避免气泡形成。
    1. 搅拌1分钟后(步骤4.14),轻轻缓慢地将滑架从第 2 盘提起,然后转移到第 3 盘。拆下机架支架,搅拌正好 1 分钟。
  16. 从第 3 盘缓慢轻轻抬起滑架。一定要避免形成缓冲液滴2。轻轻触摸无绒纸,使每个幻灯片的两侧干燥。将每个污点干燥的幻灯片放在幻灯片框中,重复步骤 4.16,直到所有微阵列幻灯片都放在幻灯片框中。干燥约 15 分钟。
    可选停止点
  17. 将每个微阵列幻灯片放在幻灯片支架中,确保条形码朝上。
    注:微阵列室内的臭氧水平应为50ppb(100微克/米3)或更少。这纯粹是可选的,但强烈建议:使用臭氧屏障滑动盖,以避免氰化物的臭氧降解。
  18. 将组装的滑架放入扫描旋转木马中。根据条形码编号按顺序加载样品。使用微阵列扫描仪立即扫描幻灯片(参见材料表),如上一出版物2中详细说明。
  19. 运行后,将数据置于特征提取和 QC 验证中,如上一出版物2中详细说明的那样。

Representative Results

该方法经过优化,用于提取含有大量污染淀粉或糖的谷物种子样品。它旨在每天从24个种子样本中提取总RNA。应在一天内连续进行,但在整个协议中标识可选的停止点和暂停点。或者,读取器可以使用他们首选的RNA萃取试剂盒或手动化学萃取方法。然而,根据我们以往的经验,由于大量的淀粉、蛋白质、糖和/或脂质污染,市售的植物RNA提取试剂盒不适合种子。在所述方法中,使用商业RNA萃取试剂盒进行粗RNA的化学萃取,然后进行柱式纯化。这通常为RNA提供更高的质量和产量。图 1显示了使用此处描述的方法测试 RNA 提取质量的生物分析器运行结果。结果为大麦叶(样本1和2代表低淀粉含量样品)和大麦种子(样本3和4代表高淀粉含量样品)。所有样品的RNA完整性 (RIN) 值为 10。

图 1显示了纯化 RNA 提取物的代表性凝胶,其中使用生物分析仪测试了质量。样品 1 和 2 是低淀粉含量样品(如大麦叶)的典型结果,其中叶绿体中额外的 rRNA 波段显而易见。样品3和4是大麦种子等淀粉含量高样品的代表性结果,显示18S和28S rRNA。请注意,由于叶绿素rRNA,绿色植物组织(如叶样本)不能计算自动RIN值。然而,完整性和高质量可以通过没有任何降解产物,通常显示为低分子涂片,在视觉上确定。使用本文中描述的协议,高淀粉种子样品(如大麦种子)的 RIN 值通常为 10。

此外,我们还在这里介绍了两个精英大麦近亲繁殖线(索菲亚和维多利亚)用于分析麦芽质量19的时间课程实验的代表性数据。在麦芽过程中,淀粉转化为糖。因此,样本代表淀粉和糖含量不同比例的组织。由于工业麦芽工艺与发芽过程相似,分析了两条大麦系的转录,其麦芽质量不同。RNA是在2、24、48、72、120、144和196小时从发芽种子中提取的。按照上述方式对定制的大麦微阵列芯片进行RNA制备和杂交。图 2指示从质量控制 (QC) 报告(QC)报告 (图 3) 和检测到信号的直方图中给出的微阵列混合化读取的规范化网格。网格给出了来自芯片每个角的派生信号的示例,包括用于校准的背景和尖峰读取点。直方图指示具有相应信号强度的可检测点的偏差。成功的杂交提供了一个宽高斯形曲线,只有轻微的异常值,如图所示。杂交失败可能导致向一侧("绿色怪物")的强烈转变。

最后,图 3的列 4 显示了可接受值的代表性结果。为了表明所执行实验的可靠性,使用 GeneSpring 软件进一步评估了结果。收集的数据作为主要组件分析 (PCA) 呈现。PCA 将所选点(基因)的值集成为矢量。使用的评估点数可能从数百个到整个芯片不等,并且取决于所使用的软件。每个芯片(样本)产生一个值(矢量),该值由分析点的集成信号强度产生。因此,图形 (PCA) 中的相对位置指示样本彼此的相似性。样本越接近,它们就越相似。技术复制应该比生物复制更接近,样本的生物复制应该比来自不同时间点、组织或条件的样本更紧密地聚集在一起。

Figure 1
图1:使用生物分析仪检查RNA质量后获得的电泳文件运行摘要。样品1和2是大麦叶组织,由叶绿体的附加核糖带指示。样品3和4是大麦种子组织与18S和28SrRNA带显示。RIN 因子并不总是计算绿色组织,如叶,但根据凝胶,RNA的质量非常好。样本 3 和 4 的 RIN 值为 10。请点击此处查看此图形的较大版本。

Figure 2
图2:成功的大麦微阵列杂交的QC报告。A = 表示从芯片各个角落在网格上检测到的信号。直方图显示背景减法后按信号强度(荧光)分类为对数的信号数。请点击此处查看此图形的较大版本。

Figure 3
图 3:混合和扫描后的质量控制 (QC) 摘要。混合幻灯片的值在第 2 列(值)中给出,可接受值的范围显示在列 4 中。请点击此处查看此图形的较大版本。

洗涤室组件 内容和标签 目的
菜 1 空,留在实验室的长凳上,直到第二天 第二天用"洗涤缓冲区 1"填充,用于拆卸微阵列幻灯片
菜 2 加入一个微阵列滑架和一个小磁性搅拌棒;标签与"沃什缓冲区1",留在实验室工作台,直到第二天 用于在第二天使用 Wash 缓冲区 1 清洗微阵列幻灯片
菜 3 加入一个小磁性搅拌棒,标签上贴有"Wash 缓冲器2",放在37°C迷你培养箱中。 用于在第二天用洗涤缓冲器 2 在 37 °C 迷你培养箱内清洗微阵列幻灯片

表1:洗涤室组件的制备。

步骤 洗涤缓冲器 温度 时间
拆卸 1 1 环境 尽可能快
(步骤 4.13)
首次清洗 2 1 环境 1 分钟
(步骤 4.14)
第二次洗涤 3 2 37 °C 1 分钟
(步骤 4.15)

表2:洗涤室组件的孵化温度和时间。

Discussion

所述方法为高产和高质量的RNA提取物提供高可重复的结果(图1)。根据我们的经验,我们建议对一种基因型、阶段或条件进行三种生物复制进行分析。为了能够检测统计上有意义的差异,必须考虑 mRNA 的一般丰度。但是请注意,RNA 提取步骤的三联提取需要起始量为 200 mg 组织样本。因此,对于样品数量有限的实验,如转基因植物材料,这种方法可能不合适。

在微阵列混合化期间,以下步骤最为关键:(1) 将样品加载到垫片幻灯片(步骤 4.7)和 (2) 混合后清洗阵列(步骤 4.13 和 4.14)。样品装载需要非常小心,以避免气泡形成和液体溢出。将微阵列幻灯片放在包含已加载样品的垫片滑轨上时,需要谨慎:DNA 侧(带斑点探头)应朝下,以便进行混合。对于洗涤微阵列,第二个洗涤步骤尤为重要:在这里,需要非常缓慢地执行从洗涤缓冲器 2 中移除幻灯片(10 秒),以避免幻灯片上的缓冲伪影,这可能会干扰数据采集和分析。

为了从符合下游生物信息学分析条件的杂交实验中获得结果,应遵循几个重要的标准。QC 报告是在上述协议的性能之后生成的,它很好地介绍了哪些内容需要改进,哪些数据处于可用状态(图 3)。收到的第一个信息是可视化网格(图2)。在这里,您可以直接看到荧光读出的所有区域是否正确对齐。如果存在视觉可检测的偏移,这将影响所有其他值(背景、信号强度等),并且无法使用此芯片的读取。在概览(所有异常值的空间分布)中,人们可以轻松地发现任何影响结果的污染(例如灰尘或头发)。通过轻柔地吹扫和重新扫描芯片,可以去除污垢。如上所述的信号图直方图应产生宽高斯形曲线,只有轻微的异常值(图2)。根据所分析的组织(图1),此曲线可能看起来不同,并且可能出现两个峰值,或者一个带肩的主导峰。这不会影响数据的质量。只有强偏移峰值或边缘上的高信号才会显示问题,例如"绿色怪物"(荧光强度过高),这些信号无法通过洗涤去除,应报告给芯片制造商。此外,"中值信号的空间分布图"应围绕公共值而变化。这应在 40 和 100 之间,具体取决于所分析的芯片的一般强度读出。另一个重要的质量控制是评估数据峰值:信号峰值的日志应产生线性和常规线。最后,"评估指标"表提供了良好和可靠的结果视图。在这里,制造商提供了一系列值,可以归类为优秀、良好和评估(图 3)。根据我们的经验,某些值不能总是应用于所有芯片。对于大米定制芯片,"非控制值"经常超过范围,但不会对进一步的数据处理产生重大影响。此外,"NegControl"的范围可以扩大,基于组织,有机体和一般输出的芯片到<80。根据我们的经验,价值 E1 med CV 的评估范围可能会扩展到 <9,而不是 <8。在此之后,可以正确评估所有芯片读出数据。一般来说,人们应该始终记住,独立的生物复制总是给出最可靠的结果。

与其他方法相比,此技术的优点在于它代表了一种经济高效的高通量的转录分析方法。此外,下游数据分析管道更容易建立。尽管有优点,但这项技术存在某些局限性,例如可以分析的基因数量。微阵列只能促进对阵列上先前发现的基因探测器的分析。因此,该技术仅适用于具有测序基因组和完全带正指示基因的植物物种。我们设想,基于微阵列的转录组学将继续非常有用,不仅对于基因表达分析,而且对其他下游生物信息学管道(如基因调控网络分析和转录组关联研究)也非常有用和相关。

Disclosures

作者没有相互竞争的财务利益。

Acknowledgments

这项工作得到了CGIAR专题领域全球稻农粮食系统CRP、RICE、非洲和南亚耐应力水稻(STRASA)第三阶段以及IZN(德国Halle(萨勒)作物植物研究跨学科中心的支持。我们感谢曼迪·普夫费尔德的出色技术援助,感谢伊莎贝尔·玛丽亚·莫拉-拉米雷斯博士与小麦片分享信息和经验。我们感谢朗达·迈耶博士(RG赫特罗西斯,IPK盖特斯莱本,德国)的评论和批判性地阅读手稿。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ß-mercaptoethanol Roth 4227.3 Add 300 ul to 20 mL RNA Extraction Buffer immediately prior to use
Bioanalyzer 2100 Agilent Technologies To determine quality and quantity of RNA extract
Crushed ice maker Various brands To keep samples on ice during sample processing
Dewar flask Various brands Used as liquid nitrogen container
Ethanol, absolute Roth 9065.1
Gene Expression Hybridization Kit Agilent Technologies 5188-5242 Kit components:
2X Hi-RPM Hybridization Buffer
25X Fragmentation Buffer
10X Gene Expression Blocking Agent
Gene Expression Wash buffer Kit Agilent Technologies 5188-5325 Kit components:
Gene Expression Wash Buffer 1
Gene Expression Wash Buffer 2
Triton X-102
Heat block Various brands It is recommended to have at least one heat block for 1.5 ml tubes and another one for 2.0 ml tubes
Hybridization oven Agilent G2545A Stainless-steel oven designed for microarray hybridization From Sheldon Manufacturing, used to hybridize the sample in microarray overnight.
Hybridization gasket slide kit Agilent G2534-60014
iQAir air cleaner To ensure that the experiment is conducted in low-ozone area
Isopropanol Roth 9866.5
Lint-free paper, Kimwipes Kimberly-Clark Professional KC34155
Low Input Quick Amp Labeling Kit Agilent Technologies 5190-2305 Kit components:
T7 Primer
5x First Strand Buffer
0.1M DTT
10 mM dNTP Mix
AffinityScript RNAse Block Mix
5x Transcription Buffer
NTP Mix
T7 RNA Polymerase Blend
Nuclease-free water
Cyanine 3-CTP
Metal spatula, small Ensure that the small metal spatula can fit in the microfuge tubes to ensure easy scooping of samples.
Microarray scanner Agilent Technologies Agilent SureScan or Agilent C microarray scanner are recommended
Microfuge tubes, nuclease-free Various brands 2.0 mL and 1.5 mL volume
Microcentrifuge Eppendorf 5810 R It is recommended to have at least one ambient and cold temperature microfuge with rotors that can hold 24 each of 1.5 ml and 2.0 ml microfuge tubes
Mini incubator Labnet I5110-230V Any small incubator will do.
Mortar and pestle Any small ceramic or marble mortar and pestle that can withstand cryogenic grinding using liquid nitrogen.
NaCl Sigma-Aldrich S7653-1KG
Nanodrop 1000 Peqlab / Thermofisher
Nuclease-free water Biozym 351900302
One-Color RNA Spike-In Kit Agilent 5188-5282 Kit components:
One color RNA Spike-Mix
Dilution Buffer
Ozone barrier slide cover kit Agilent G2505-60550 Optional but highly recommended
PCR tube, 0.2 mL, RNase-free Stratagene Z376426
Phenol:chloroform:isoamyl mixture (25:24:1) Roth A156.2
Pipette tips, nuclease free, filter tips Various brands To accommodate 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes
Pipettor set Various brands For 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes
RNA Extraction Buffer 10 mM Tri-HCl pH 8.0
150 mM LiCl
50 mM EDTA
1.5% EDTA
15 ul/mL β-mercaptoethanol
We routinely use Roth or Sigma chemicals; Add β-mercaptoethanol fresh daily
RNase-free DNase set Qiagen 79254
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 Kit components:
RNeasy mini spin column (pink)
1.5 ml collection tubes
2 ml collection tubes
Buffer RLT
Buffer RW
Buffer RPE
Nuclease-free water
RNeasy Plant Mini Kit Qiagen 74904 Kit components:
RNeasy mini spin column (pink)
QIAshredder spin column (purple)
1.5 ml collection tubes
2 ml collection tubes
Buffer RLT
Buffer RLC
Buffer RW1
Buffer RPE
Nuclease-free water
Slide holders for DNA microarray scanner Agilent G2505-60525
Slide staining dish with removable rack DWK Life Sciences 900200 Fisher Scientific 08-812 We recommend DWK Life Sciences Wheaton™ Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack (Complete with dish, cover, and glass slide rack)
Sodium chloride Roth P029.1
Ultralow temperature freezer Various brand Capable of storing sample at -80 °C
Vortex mixer Various brands At least one for single tube vortex-mixer and another one for that can vortex-mix multiple tubes

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References

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