Ottenere dati trascrittomi di alta qualità dai semi di cereali con un metodo modificato per la profilazione dell'espressione genica

Questo metodo di ibridazione del microarray è utile per confrontare un gran numero di campioni di un organismo con un genoma noto. Rispetto a un approccio di sequenziamento ad alta velocità effettiva, la quantità di dati generati da questo metodo è molto più facile da gestire e, inoltre, può essere analizzata in modo più conveniente. A dimostrare la procedura sarà la dott.ssa Christiane Seiler, scienziata post-dottorato che lavora nel gruppo di ricerca di Rosis presso l’IPK di Gatersleben.

Prima di eseguire l’ibridazione dei microarray utilizzando il kit di ibridazione dell’espressione genica, preparare l’agente bloccante 10X in base alle specifiche del produttore e aliquotare l’agente bloccante risultante in volumi di 200 microliter. Quindi, conservare l’agente di blocco a meno 20 gradi Celsius fino all’uso. Il giorno dell’ibridazione del microarray, scongelare un’aliquota di 200 microliter dell’agente bloccante 10X sul ghiaccio e prewarm il forno di ibridazione a 65 gradi Celsius e un blocco termico a 60 gradi Celsius.

Preparare la miscela di frammentazione per ciascun campione come descritto dal produttore e mescolare delicatamente i campioni su un vortice. Dopo il vortice, far girare brevemente i campioni in un microcentrifugo prima di incubare esattamente per 30 minuti nel blocco termico di 60 gradi Celsius. Al termine dell’incubazione, raffreddare immediatamente ogni tubo sul ghiaccio per un minuto prima di fermare la frammentazione con 25 microlitri di tampone di ibridazione dell’espressione genica 2X, giri elevati al minuto per tubo.

Mescolare con pipettazione delicata, facendo molta attenzione a non introdurre bolle e centrifugare i tubi a temperatura ambiente. Alla fine dello spin posizionare immediatamente tutti i tubi sul ghiaccio e caricare ogni campione nello scivolo del microarray il più rapidamente possibile. Successivamente, erogare lentamente 44 microlitri di ogni mix di ibridazione al centro di ogni guarnizione, facendo attenzione a evitare l’introduzione di bolle e aggiungere 44 microlitri di tampone di ibridazione in eventuali pozzi inutilizzati.

Posizionare immediatamente lo scivolo microarray con l’orientamento corretto sopra lo scivolo della guarnizione, facendo attenzione a non versare alcun liquido e chiudere saldamente l’assieme di ibridazione. Ruotare l’assieme per confermare la mancanza di bolle d’aria stazionarie e posizionare l’assemblaggio della camera di ibridazione nel rotatore del forno di ibridazione. Impostare la velocità di rotazione su 10 giri al minuto, quindi avviare l’ibridazione a 65 gradi Celsius per esattamente 17 ore.

Mentre i campioni si ibridano, preparare tre gruppi di lavapiatti nei tamponi di lavaggio appropriati come indicato nelle tabelle. Dopo esattamente 17 ore di ibridazione, smontare una camera di ibridazione su un banco da laboratorio foderato con carta priva di pelucchi e trasferire un sandwich di microarray su un piatto contenente tampone di lavaggio uno con il codice a barre microarray rivolto verso l’alto in posizione inclinata senza immergere l’intero scivolo nel buffer. Utilizzando le pinze, separare i due vetrini e lasciare che la guarnizione scivoli delicatamente nella parte inferiore del piatto mantenendo una presa ferma sullo scivolo del microarray.

Sollevare lentamente lo scivolo microarray lateralmente per un trasferimento immediato nel rack microarray nel piatto due con una minima esposizione all’aria. Quando tutte e otto le diapositive sono state posizionate uniformemente lungo il rack, fissare il portapacchi e trasferire l’intera configurazione del piatto due all’agitatore magnetico. Mescolare delicatamente la configurazione per esattamente un minuto.

Mentre i campioni vengono mescolati, trasferire il piatto tre dall’incubatore di 37 gradi Celsius su un secondo agitatore magnetico. Quindi aggiungere delicatamente 37 gradi Celsius tampone di lavaggio due al piatto tre senza formare bolle. Al termine dell’incubazione mescolando, trasferire delicatamente e lentamente il portapacchi per pararegliare tre e rimuovere il supporto del rack.

Dopo aver mescolato esattamente per un minuto, rimuovere lentamente e delicatamente il porta scorrevole dal piatto e utilizzare carta priva di pelucchi per asciugare accuratamente entrambi i lati di ogni diapositiva, posizionando ogni diapositiva in una scatola scorrevole mentre viene asciugato. Dopo aver permesso alle diapositive di asciugarsi per 15 minuti, trasferire ogni microarray scivolare in un porta scorrevole con il codice a barre rivolto verso l’alto e caricare i supporti di scorrimento assemblati in un carosello di scansione e sequenza in base al numero del codice a barre. Quindi, scansiona immediatamente le diapositive.

In questa figura, viene mostrato un risultato rappresentativo di una corsa per testare la qualità dell’estrazione dell’RNA. Nelle analisi tipiche di campioni a basso contenuto di amido, come le foglie d’orzo, sono evidenti ulteriori bande di RNA ribosomiale dai cloroplasti. Campioni ad alto contenuto di amido, come i semi d’orzo, mostrano RNA ribosomiale 18 e 28S.

Si noti che nessun valore automatizzato del numero di integrità dell’RNA può essere calcolato per i tessuti vegetali verdi, come i campioni fogliari, a causa dell’RNA ribosomiale cloroplasto. In questa analisi rappresentativa, sono stati eseguiti una preparazione dell’RNA e l’ibridazione su un chip microarray d’orzo personalizzato come dimostrato. La griglia mostra un esempio di segnali derivati da ogni angolo del chip, incluso lo sfondo e il picco nei punti di lettura utilizzati per la calibrazione.

L’istogramma indica la deviazione dei punti rilevabili con le rispettive intensità del segnale. Come osservato, un’ibridazione di successo dà un’ampia curva a forma gaussiana con solo valori anomali minori. Di seguito è riportato il rapporto sul controllo qualità per i segnali rilevati.

I valori per la diapositiva ibridata sono indicati nella colonna due e l’intervallo di valori accettabili è mostrato nella colonna quattro. Questo metodo può essere utilizzato per affrontare qualsiasi insieme sperimentale per qualsiasi organismo in cui siano disponibili informazioni sostanziali sul genoma. L’uso di questa tecnica nel nostro laboratorio ci ha permesso di confrontare e analizzare i cambiamenti trascrittomici nel riso e nell’orzo che si verificano dopo l’induzione dello stress da crescita.