تقييم التئام الجروح الحادة باستخدام دورسال تحت الجلد بوليفينيل الكحول الإسفنج زرع واستئصال الذيل نماذج الجرح الجلد.

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

هنا، يتم وصف نموذجين التئام الجروح المورين، واحد يهدف إلى تقييم الاستجابات التئام الجروح الخلوية والسيتوكين والآخر لتحديد معدل إغلاق الجروح. ويمكن استخدام هذه الأساليب مع نماذج الأمراض المعقدة مثل مرض السكري لتحديد آليات جوانب مختلفة من الشفاء الجروح الفقراء.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Crane, M. J., Henry Jr, W. L., Tran, H. L., Albina, J. E., Jamieson, A. M. Assessment of Acute Wound Healing using the Dorsal Subcutaneous Polyvinyl Alcohol Sponge Implantation and Excisional Tail Skin Wound Models.. J. Vis. Exp. (157), e60653, doi:10.3791/60653 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

التئام الجروح هي عملية معقدة تتطلب التقدم المنظم للالتهاب ، وتشكيل أنسجة التحبيب ، والتليف ، والقرار. نماذج المورين توفر قيمة المكنانية البصيرة في هذه العمليات; ومع ذلك، لا يوجد نموذج واحد يعالج تماما جميع جوانب استجابة التئام الجروح. بدلا من ذلك، فمن المثالي لاستخدام نماذج متعددة لمعالجة الجوانب المختلفة للتئام الجروح. هنا، يتم وصف طريقتين مختلفتين التي تعالج جوانب متنوعة من استجابة التئام الجروح. في النموذج الأول ، يتم زرع الإسفنج الكحولي اتّلادي الفينيل تحت الجلد على طول دورسوم الماوس. بعد استرجاع الإسفنج ، يمكن عزل الخلايا عن طريق التعطيل الميكانيكي ، ويمكن استخراج السوائل عن طريق الطرد المركزي ، مما يسمح بتوصيف مفصل للاستجابات الخلوية والسيتوكين في بيئة الجرح الحاد. ومن القيود المفروضة على هذا النموذج عدم القدرة على تقييم معدل إغلاق الجروح. لهذا, يتم استخدام نموذج الختان الجلد الذيل. في هذا النموذج، يتم استئصال قطعة مستطيلة من جلد الذيل مقاس 10 مم × 3 مم على طول السطح الظهري، بالقرب من قاعدة الذيل. يمكن تصوير هذا النموذج بسهولة لتحليل المخطط لتحديد معدلات الشفاء ويمكن استئصاله للتحليل النسيجي. يمكن استخدام كلتا الطريقتين الموصوفتين في سلالات الفئران المعدلة وراثياً، أو بالتزامن مع نماذج من الظروف المرضية، مثل مرض السكري أو الشيخوخة أو العدوى الثانوية، من أجل توضيح آليات التئام الجروح.

Introduction

هناك العديد من أنظمة نموذج المورين المتاحة لفحص عمليات التئام الجروح، كل تمتلك مزايا محددة وقيود,2. الأساليب التالية تقدم نموذجين للجرح المورين ، كل منهما يتناول جانبًا معينًا من استجابة التئام الجروح ، والتي يمكن استخدامها لتحديد سبب وتأثير الاضطرابات في الاستجابة للإصابة. تحدث عملية التئام الجروح في مراحل متميزة. المرحلة الأولى هي التهابية ، تتميز بالتدفق السريع للصفائح الدموية ، العدلات ، والخلايا الأحادية / الضامة ، وكذلك إنتاج السيتوكينات والكيموكينيات البرولية. بعد حل الالتهاب ، تنتقل البيئة إلى حالة أكثر دقة مع تحريض السيتوكينات الليفية وproangiogenic وعوامل النمو. يتم إيداع أنسجة الحبيبات وتشكيل الأوعية الجديدة مع هجرة الخلايا الليفية العضلية والخلايا الليفية والخلايا الظهارية والخلايا النُظفية. في المراحل النهائية ، يتم إعادة تشكيل المصفوفة المؤقتة خارج الخلية ، وينطلق تشكيل الندبة وإغلاق الجرح2،3،4،5،6،7،8.

لا يوجد نموذج واحد من المورين يوفر نظامًا لدراسة جميع مراحل التئام الجروح2. هنا ، يتم وصف نموذجين للجرح الجراحي: واحد يوضح استجابات التئام الجروح الخلوية الحادة والسيتوكين ، والآخر يسمح بتقييم إغلاق الجروح وكذلك التحليلات النسيجية. ويمكن استخدام هاتين الطريقتين بطريقة تكميلية لتقييم آثار اضطراب أو مراضة مشتركة على جوانب مختلفة من استجابة التئام الجروح. الزرع تحت الجلد الظهري لإسفنجة الكحول متعدد الفينيل (PVA) هو نظام تم استخدامه في نماذج القوارض لعقود لتوضيح العديد من جوانب استجابات الأنسجة الخلوية والتحبيب9،10،11,،12،13،14،15،16،17،18،1919،20 ،21،22،23،24. يسمح هذا النهج باسترجاع سوائل الجروح الغنية بالسيتوكين والتسلل الخلوي. في هذا النموذج، يتم وضع 1 سم × 1 سم × 0.5 سم قطعة من الإسفنج PVA في جيوب تحت الجلد من خلال شق 2 سم المحرز في خط الوسط الظهرالخلفي. يتم إغلاق الشق مع مقاطع جراحية، ويمكن استرداد الإسفنج في نقاط زمنية لاحقة لعزل الخلايا والسوائل. يعكس الوسط الخلوي والسيتوكيني من الإسفنج المعزول المراحل الطبيعية لشفاء الجروح الحادة حتى حوالي 14 يومًا بعد الزرع. في وقت لاحق نقاط النموذج هو أكثر فائدة لدراسة تكوين الأنسجة التحبيب واستجابة الجسم الغريب1. مع هذا النظام، فمن الممكن لعزل > 106 خلايا، والذي يوفر ميزة متميزة للمقالات البهينوتيك والوظيفية وعزل الحمض النووي الريبي، على عزل الخلايا من غيرها من الأساليب القائمة على خزعة,22،,23،,25، 26,26.

يتم تحديد معدل إغلاق الجرح باستخدام نموذج استئصال الجلد الذيل. في هذا النموذج، كما وصفها في البداية من قبل Falanga وآخرون، وأبلغ عنها من قبل الآخرين27،28،29،30، تتم إزالة 1 سم × 0.3 سم قسم سمك كامل من الجلد الذيل بالقرب من قاعدة الذيل. يتم تصور منطقة الجرح بسهولة ويمكن قياسها مع مرور الوقت. بدلا ً من ذلك، يمكن عزل أنسجة الذيل للتحليل النسيجي. يمكن استخدام هذا النهج كبديل أو بالتزامن مع طريقة خزعة لكمة الظهر الراسخة. التمييز الأساسي بين هذين النموذجين هو معدل إغلاق الجروح ، ووجود أو عدم وجود الفراء ، وبنية الجلد2،31،32. الجروح الجلد الذيل توفر فترة زمنية أطول لتقييم إغلاق الجرح، كما يستغرق ما يقرب من 21 يوما لإغلاق كامل أن يحدث. هذا يعارض خزعات لكمة الظهرية unsinted ، والتي تلتئم بشكل أسرع بكثير (~ 7-10 أيام) ، في المقام الأول عن طريق الانكماش بسبب عمل carnosus panniculus. تلتئم خزعات اللكمة الظهرية المنجلية ببطء أكبر وتقلل من آثار شفاء العقد ، ولكن تعتمد على وجود جسم غريب لتقييد الآليات القائمة على العقد1،2،27،30،31،33.33

نماذج الجرح الموصوفة مفيدة لفهم عمليات التئام الجروح العادية في حالة عدم وجود اضطراب. في حين أن شفاء جلد القوارض يختلف بطرق هامة جدا من الجلد البشري، بما في ذلك بنية فضفاضة، والاعتماد على الشفاء العقدي، وغيرها من الاختلافات التشريحية، ونظام مورين يقدم مزايا معينة لدراسات ميكانيكية وفحص. وفي مقدمتها توافر سلالات أصيلة ومسوخ وراثية، وقابلية وراثية، وانخفاض التكلفة. يمكن ترجمة البصيرة الميكانيكية المكتسبة من دراسات المورين إلى نماذج الحيوانات المعقدة التي تحاكي عن كثب شفاء الجلد البشري ، مثل نظام porcine2،31.

بالإضافة إلى فحص استجابات التئام الجروح في الحالة الثابتة ، يمكن الجمع بين هذه النماذج مع ظروف المرض لفهم أساس عيوب التئام الجروح في المستوى الخلوي والسيتوكين وإجمالي الأنسجة. في هذا الإعداد الخاص يمكن استخدام النموذجين بالتنسيق لتقييم آثار حالة مرضية معينة ، مثل الالتهاب الرئوي بعد الجراحة ، على كل من استجابة التئام الجروح الخلوية الحادة ومعدل إغلاق الجروح30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد وافقت لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للرعاية والاستخدام على الحيوانات بجامعة براون على جميع الدراسات الحيوانية الموصوفة هنا، وأجريت وفقا ً لدليل رعاية واستخدام الحيوانات التابع للمعاهد الوطنية للصحة.  ملاحظة: في الفيديو، تم حذف الستائر الجراحية لأغراض العرض التوضيحي.

1. زرع تحت الجلد من الإسفنج PVA

  1. استخدم المقص لقطع صفائح الإسفنج PVA إلى 8 مم × 8 مم × 4 مم. Rehydrate قطع من الإسفنج PVA عن طريق غمرها في 1x PBS العقيمة في كوب.
  2. الأوتوكلاف الإسفنج في 1x PBS لتعقيم، وتبرد تماما. تخزين الإسفنج الأوتوكلاف في 1x PBS العقيمة في 4 درجة مئوية.
  3. قبل إجراء عملية زرع جراحية، aliquots العدد اللازم من الإسفنج في طبق الثقافة المعقمة في ظل ظروف معقمة في غطاء تدفق لاميد. تخزين الإسفنج اضافية في 1x PBS العقيمة في 4 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل. تأكد من أن الإسفنج تتضخم إلى 1 سم × 1 سم × 0.5 سم بعد الإماهة. تظهر صورة لإسفنج PVA المجفف في الشكل 1A.
    ملاحظة: للحفاظ على عقم الموقع الجراحي، يتطلب إجراء زرع الإسفنج PVA فرد واحد للتعامل مع الماوس وإعداد الموقع الجراحي، وشخص ثان لإجراء الزرع.
  4. إجراء حقن للفأر C57BL/6J الذي يبلغ من العمر 8-12 أسبوعًا عن طريق الحقن داخل البيريكونيل لـ 80 ملغم/كغم من الكيتامين. إدارة 40 ملغ / كجم من xylazine داخل perperitoneally للمسكن.  تأكيد عمق التخدير عن طريق فقدان منعكس دواسة. إعداد الموقع الجراحي عن طريق إزالة الشعر على طول دورسوم مع كليبرز. باستخدام الشاش المعقم، وتطبيق محلول اليود povidone إلى منطقة التعقيم 2x، تليها الإيثانول 70٪.
  5. ضع الماوس على الستائر الجراحية العقيمة. ضع وسادة ساخنة تحت الستائر الجراحية للحفاظ على درجة حرارة الماوس الأساسية.
  6. ارتداء قفازات جراحية معقمة لإجراء الجراحة. سحب الجلد الظهري بعيدا عن الأنسجة الكامنة مع ملقط، واستخدام مقص الجراحية العقيمة، وجعل شق 2 سم على طول خط الوسط الظهري ما يقرب من 2 سم إلى قاعدة الذيل. في حين عقد شق مفتوحة مع ملقط معقمة، واستخدام معقم المنحني، مقص الجراحية حادة الرؤوس لتشكيل جيب تحت الجلد على طول دورسوم في واحدة من المواقف المشار إليها في الشكل 1B.
  7. الاستمرار في استخدام ملقط لرفع الجلد بعيدا عن الأنسجة الكامنة. باستخدام مقص جراحي معقم، اضغط بلطف على إسفنجة PVA واحدة في طبق الثقافة لإزالة PBS الزائدة. التقط إسفنجة PVA بزاوية واحدة باستخدام مقص جراحي معقم، وبالزاوية التي يحملها المقص، ضع الإسفنج في الجيب تحت الجلد الذي تشكل في الخطوة 1.4.
  8. كرر هذه العملية 5x ، ووضع ما مجموعه ستة الإسفنج في جيوب تحت الجلد كما هو مبين في الشكل 1B.
  9. قرصة الجلد الظهري القاطعة جنبا إلى جنب مع ملقط معقمة وإغلاق الشق مع اثنين من مقاطع الجرح الفولاذ المقاوم للصدأ.
  10. استخدام مجموعة جديدة من الأدوات الجراحية العقيمة لكل فأرة. بدلا من ذلك، استخدم معقم ة للقز لتعقيم الأدوات بين الفئران.

2. عزل السوائل من الإسفنج PVA

  1. لتقييم الوسط السيتوكين الجرح الحاد، وعزل الإسفنج بين 1-14 أيام بعد الزرع.
  2. قم بإعداد أنبوب تجميع السوائل عن طريق تعشيش برميل حقنة 5 مل في أنبوب ثقافة 16 مل.
  3. القتل الرحيم فأر مع الإسفنج PVA المزروعة عن طريق اختناق CO2 تليها خلع عنق الرحم.
  4. إزالة المواد الغذائية الجراحية وفتح شق مع ملقط مسننة. استخدام مقص لتمديد شق على طول خط الوسط الظهري.
  5. باستخدام ملقط، استخراج اسفنجة واحدة من جيبها تحت الجلد ونقلها إلى برميل حقنة أعدت، مع الحرص على تقليل الضغط على الاسفنج. فصل أي النسيج الضام الذي لا يزال ملتصقا بسطح الإسفنج. استخدام مقص لتشريح الاسفنج من الأنسجة المحيطة بها إذا لزم الأمر. كرر عملية إزالة الإسفنج مع الإسفنج المتبقية. ضع الأنبوب الذي يحتوي على الإسفنج على الجليد.
  6. لعزل سائل الجرح، قم بالطرد المركزي لأنبوب الاستزراع الذي يحتوي على حقنة 5 مل مع الإسفنج عند 700 × ز لمدة 10 دقيقة.
  7. بعد الطرد المركزي، تخلص من الحقنة والإسفنج. سيكون السائل الجرح قد جمعت في أنبوب الثقافة 16 مل. تظهر صورة تمثيلية للسائل الذي تم جمعه من جرح يوم 7 في الشكل 1D. نقل سائل الجرح إلى أنبوب نظيف للتخزين على المدى الطويل عند -80 درجة مئوية.

3. عزل الخلايا من الإسفنج PVA

  1. لتقييم الوسط الخلوي شفاء الجروح الحاد، اجمع الإسفنج بين 1-14 يومًا بعد زرع الإسفنج. يتم عرض الإسفنج التي تم الحصول عليها من الجرح بعد 7 أيام من الزرع في الشكل 1E.
  2. إعداد جمع المتوسطة التي تحتوي على 1x HBSS (+الكالسيوم / + المغنيسيوم / - الفينول الأحمر) مع استكمال1٪ FBS، 1٪ HEPES، و 1٪ البنسلين-العقديات.
  3. Aliquot 5 مل من مجموعة HBSS المتوسطة في أنبوب مخروطي 15 مل.
  4. استخراج الإسفنج PVA من الفئران القتل الرحيم كما هو موضح في 2.2-2.4. ضع الإسفنج في الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على 5 مل من وسيط جمع HBSS.
  5. نقل الإسفنج والوسائط جمع HBSS إلى حقيبة خلاط 80 مل عن طريق صب. شنق كيس خلاط من فتحة خلاط مجداف، وضعه بحيث المجاذيف ضرب الإسفنج ووسائل الإعلام. ضبط إعدادات خلاط مجداف لتشغيل على ارتفاع لمدة 60 ق. اضغط ابدأ.
  6. نقل وسائل الإعلام من حقيبة خلاط مرة أخرى إلى أنبوب مخروطي 15 مل مع ماصة، وترك الإسفنج وراء في الحقيبة. ضغط الإسفنج للافراج عن وسائل الإعلام بدقة. ضبط إعدادات خلاط مجداف لتشغيل لمدة 30 ق على ارتفاع. إضافة 5 مل من وسائل الإعلام إلى كيس خلاط وتكرار عملية المعدة 2x لما مجموعه ثلاث اسفنجة الغسل.
  7. طرد مركزي الأنبوب المخروطي في 250 × ز لمدة 5 دقيقة. سوف تكون بيليه أحمر من الخلايا وخلايا الدم الحمراء مرئية في الجزء السفلي من الأنبوب المخروطي بعد الطرد المركزي.
  8. تجاهل supernatant وإجراء تحليل خلايا الدم الحمراء: إضافة 900 ميكرولتر من dH2O إلى بيليه الخلية وماصة لخلط. تحييد مع 100 ميكرولتر من 10x PBS. إضافة 4 مل من 1x PBS إلى الأنبوب لتحييد تماما من الانزل، ثم الطرد المركزي في 250 × ز لمدة 5 دقيقة.
    ملاحظة: يجب أن تكون خطوة التليسقصيرة قصيرة; ترك الماء في اتصال مع الخلايا لأكثر من 3-5 s يمكن أن يؤدي إلى حل الخلايا غير الحمراء.
  9. بعد الطرد المركزي ، ستكون كريات الخلية البيضاء التي تحتوي على خلايا جرح خالية من خلايا الدم الحمراء موجودة في الجزء السفلي من الأنبوب المخروطي. تجاهل supernatant وإعادة تعليق بيليه الخلية في الوسط المطلوب لتحليلات المصب.

4. اختياري تدفق تحليل قياس الخلايا من الكريات البيض الفطرية معزولة عن الجروح الإسفنج PVA

  1. إعادة تعليق 0.5-1 × 106 خلايا الجرح في 25 ميكرولتر من محلول 2x من منع الأجسام المضادة التي تحتوي على 10 ميكروغرام / مل المضادة CD16/CD32 FcRаII / III الأجسام المضادة المخففة في 1x PBS + 1٪ BSA.
    ملاحظة: يجب تَثَيُّر جميع الأجسام المضادة لتحديد التركيزات المثلى لتحليل قياس الخلايا.
  2. احتضان الخلايا مع منع الأجسام المضادة لمدة 10 دقيقة على الجليد.
  3. جعل مزيج رئيسي 2x من الأجسام المضادة التي تحتوي على 2.5 ملغ / مل من PerCP-eFluor710-Ly6G, 5 ملغ/ مل من FITC-Ly6C, APC-Fire750-CD45.2, APC-R700-Siglec-F, و 10 ملغ/مل من eFluor660-F4-80 المخفف في 1x PBS + 1% BSA. إضافة مباشرة 25 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة إلى الخلايا احتضان في منع الأجسام المضادة.
  4. احتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة على الجليد، محمية من الضوء.
  5. غسل الخلايا 2x مع 1x PBS.
  6. جعل مزيج رئيسي من الأمين التفاعلي قابلة للإصلاح قابلة للإصلاح صبغ-eFluor506 المخفف 1:1,000 في 1x PBS. إعادة تعليق بيليه الخلية في 50 ميكرولتر من محلول صبغ الجدوى.
    ملاحظة: يجب استبعاد المصل من خطوة قابلية البقاء القابلة للإصلاح، لأنه سيمنع ربط الصبغة بالبروتينات الذاتية. احتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة على الجليد، محمية من الضوء.
  7. غسل الخلايا 2x مع 1x PBS. إعادة تعليق بيليه الخلية في 50 ميكرولتر من 1٪ من الشلل العام.
  8. احتضان الخلايا مع 1٪ من البارماديهايد لمدة 15 دقيقة على الجليد، محمية من الضوء.
  9. غسل الخلايا 1x مع 1x PBS وإعادة تعليق بيليه في 1x PBS لتدفق تحليل قياس الخلايا.

5. استئصال الجلد الذيل

  1. إجراء حقن للفأر C57BL/6J الذي يبلغ من العمر 8-12 أسبوعًا عن طريق الحقن داخل البيريكونيل 80 ملغم/كغم من الكيتامين. إدارة 40 ملغ / كجم من xylazine داخل perperitoneally للمسكن. تأكيد عمق التخدير عن طريق فقدان منعكس دواسة.
  2. إعداد الموقع الجراحي على ذيل الماوس مثير للكشف عن طريق استخدام الشاش المعقم لتطبيق محلول اليود povidone 2x ، يليه تطبيق واحد من الإيثانول 70٪.
  3. حدد مقطعًا 10 مم × 3 مم على السطح الظهري للذيل ، 10 مم من قاعدة الذيل(الشكل 1C)باستخدام علامة دائمة لتتبعها من قالب مسبق الصنع.
  4. ضع الماوس المُسبّس على الستائر الجراحية المعقمة.
  5. ارتداء قفازات جراحية معقمة لإجراء العمليات الجراحية. مع شفرة مشرط معقمة، وجعل شق سمك كامل على طول الحواف اليمنى والسفلية واليسرى من منطقة الجرح.
  6. باستخدام ملقط معقمة، قشر الجلد المكوس بعيدا عن الذيل، واستخدام مقص الجراحية العقيمة لقطع بعيدا الحافة العليا من منطقة الجرح.
  7. تطبيق الضغط مع شاش معقم لوقف النزيف.
  8. تطبيق رذاذ حاجز الفيلم على سرير الجرح.
  9. تصوير الجروح من مسافة ثابتة على فترات زمنية منتظمة. تحليل الصور عن طريق التحليل المخطط لتحديد قياسات منطقة الجرح. بدلا من ذلك، استخدم الفرجار للحصول على قياسات طول الجرح والعرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

استجابة التهابية الجهازية بعد زرع الإسفنج PVA
ولدت جراحة زرع الإسفنج PVA استجابة التهابية الجهازية ، كما يتضح من تحريض IL-6 في البلازما بعد يوم واحد من الإصابة(الشكل 2A). السايتوكينات البرولية الأخرى بما في ذلك TNF-α و IL-1α، فضلا عن مجموعة من chemokines بما في ذلك CCL2 و CXCL1 تم تحريضها بشكل منهجي في الأيام ال7 الأولى بعد PVA زرع الإسفنج، وقد وصفت في مكان آخر26،,30.

عزل الخلايا والسوائل من الجروح الإسفنجية PVA
الميزة الأساسية لنموذج الجروح الإسفنجية PVA هي القدرة على استعادة ما يكفي من الخلايا للتحليلات الفينوية والوظيفية لاستجابة التئام الجروح الخلوية الحادة. عدد الخلايا التي يمكن استردادها من الجروح الإسفنجية PVA يزيد مع مرور الوقت، من حوالي 2 × 106 خلايا لكل ستة الإسفنج في يوم الجرح 1 × 106 إلى 8 × 106 خلايا في يوم الجرح 7(الشكل 2B). يستمر عدد الخلايا في الزيادة إلى ما بعد اليوم 7. لا ينصح بمواصلة هذا النموذج بعد ~ 14 يوما لأن الإسفنج تصبح مغلفة بالكامل من قبل الكولاجين والنظام ينتقل من نمذجة استجابة التئام الجروح الحادة إلى نمذجة الجسم الغريب الحبيبية1،22،23،25،26. كانت العدلات وأحاديات الخلايا والضامة الخلوية الأساسية في الجروح الإسفنجية PVA. سادت نيوتروفيل الوسط الخلوي الجرح بعد يوم واحد من الجرح، كما تم تقييمها من قبل تحليل التدفق الخلوي(الشكل 2C). الخلايا الأحادية والقماق المشتقة من الخلايا الأحادية تراكمت في غضون 3 أيام بعد زرع الإسفنج ، وزادت مجموعات الخلايا الثلاث في العدد بمرور الوقت(الشكل 2C). ويرد في الشكل 2Dاستراتيجية قياس التدفق الخلوي لتحديد العدلات، أحادية، والماكروفياج السكان . بعد استبعاد مزدوجات الخلية باستخدام معلمات FSC-H و SSC-H(الشكل 2D، i و ii)، تم استبعاد الخلايا غير القابلة للحياة باستخدام صبغة قابلية إصلاحية قابلة للإصلاح القابلة للتطبيق الأمينية (موضحة هنا) أو صبغة حمضية نووية (على سبيل المثال ، سيتوكس أو يوديد البوليديوم)(الشكل 2D، iii). ثم استُبعد الحطام الخلوي المتبقي الذي لم تتم إزالته بخطوات الجاتينغ السابقة باستخدام معلمات FSC-A و SSC-A(الشكل 2D، iv). الخلايا الهيماتوبويتيك تتألف من غالبية خلايا الجرح الإسفنج PVA وتم تحديدها من قبل التعبير CD45(الشكل 2D, v). تم تحديد العدلات باسم Ly6G+Siglec-F- (الشكل 2D، vi). Siglec-F+ الخلايا كانت في المقام الأول اليوزينوفيل(الشكل 2D، vii). Gating على Ly6GSiglec-F تم تحديد الخلايا, monocytes / الضامة كما F4/80+ الخلايا(الشكل 2D, viii). F4/80+ يمكن كسر الخلايا من قبل التعبير Ly6C للتمييز Ly6Cمرحبا أحادية الالتهاب(الشكل 2D، ix)وLy6Cمنخفضة الضامة المشتقة أحادية الخلايا(الشكل 2D، x)26.

القدرة على قياس السيتوكينات وغيرها من العوامل القابلة للذوبان الجرح هو ميزة أخرى لنموذج الجرح الإسفنج PVA. فمن الممكن لاستخراج ما يصل إلى 100 ميكرولتر من السوائل لكل إسفنجة. السوائل المستخرجة هي مناسبة لمجموعة متنوعة من المقالات المصب. تم الإبلاغ عن الكشف عن السيتوكينات وchemokines في سوائل الجرح المبكر والمتأخر من قبل ELISA أو المناعية متعددة الأبعاد المستندة إلى البزاد ة في مكان آخر26,30. من الممكن الحصول على كل من الخلايا والسوائل من نفس الجرح. للقيام بذلك، فمن المستحسن لعزل ثلاثة الإسفنج من جانب واحد من خط الوسط الظهري لعزل الخلية و 3 الإسفنج من الجانب الآخر من خط الوسط الظهري لاستخراج السوائل.

تقييم إغلاق الجرح باستخدام نموذج استئصال الجلد الذيل
يوفر نموذج جلد الذيل الختان بديلًا لطريقة خزعة الجلد الظهري لدراسة إغلاق الجرح البطيء في الجلد الراسخ الذي يفتقر إلى الفراء الكثيف. وتظهر صور مثال من الجروح الجلد الذيل في 1، 7، و 15 يوما بعد الختان في الشكل 3A. ويمكن قياس كمية إغلاق الجرح عن طريق قياس مساحة سرير الجرح بمرور الوقت. كان اليوم 7 ويوم 15 جرح سرير مناطق تقريبا 70% و35%, على التوالي, من اليوم 1 جرح منطقة(شكل 3B). واستلزم إغلاق الجرح الكامل ما يقرب من 28 يوما. يمكن أيضًا ملاحظة جرح جلد الذيل في المقطع العرضي عن طريق التحليل النسيجي. الشكل 3C والشكل 3D تظهر الصور التمثيلية لH & E وماسون تريكروم الملطخة الذيل المقاطع العرضية ، على التوالي. ويشار إلى الهوامش الجانبية للجلد المكوس من قبل رؤوس الأسهم على السطح الظهري للذيل.

Figure 1
الشكل 1: التخطيطي لنماذج شفاء الجروح المورينية. (A)الجانب (يسار) وأعلى (يمين) عرض الإسفنج PVA المجففة قياس 8 ملم × 8 ملم × 0.4 ملم. (C)التخطيطي الذي يوضح حجم ووضع جرح الجلد الختان (10 ملم × 3 مم مستطيل أحمر) على السطح الظهري للذيل. (د)سائل الجرح المعزول عن ثلاثة إسفنجتم تم إسترجاعه من الفضاء تحت الجلد بعد 7 أيام من الزرع. (E)ظهور الإسفنج المسترجعة من الجرح بعد 7 أيام من الزرع. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: الاستجابة النظامية والخلوية لزرع الإسفنج PVA. (أ)دورة زمنية لمستويات IL-6 في البلازما يوضح أن زرع الإسفنج PVA أدى إلى استجابة التهابية الجهازية. تم قياس تركيز IL-6 باستخدام قياس مناعة متعددة تستند إلى البزات. (ب)زاد عدد الخلايا المعزولة عن الجروح الإسفنج PVA مع مرور الوقت. (C)دورة زمنية يوضح تراكم العدلات، monocytes، والضامة المشتقة من أحادية الخلايا في الجروح الإسفنجPVA مع مرور الوقت. (D)استراتيجية ججات ممثلة للخلايا المعزولة عن الجروح الإسفنجية PVA يوضح كيفية تحديد المجموعات الفرعية الكريات البيض عن طريق تحليل التدفق الخلوي. يتم تعريف البوابات على النحو التالي:(i و ii)استبعاد مزدوج ،(iii)استبعاد الخلايا الميتة باستخدام صبغة قابلية إصلاحية قابلة للإصلاح من الأمين التفاعلي ،(4)استبعاد الحطام من قبل FSC-A و SSC-A،(v)CD45+ الخلايا الهيماتوبويتيك،(vi)Ly6G+ العدلات،(7)Siglec-F+ اليوزينوفيل،(8)Ly6G-Siglec-F- F4/80+ monocytes / الضامة،(ix)F4/80+ Ly6Cمرحبا monocytes، و(x)F4/80+Ly6C الضامةالمنخفضة. تم وضع غيتس وفقا لضوابط fluorescence -ناقص واحد (FMO). البيانات المعروضة في A-C هي المتوسط ± SEM ، n = 6-10 فئران لكل مجموعة في (A) ، ن = 8-9 فئران في (B) ، و n = 6-8 فئران في (C). يتم الجمع بين جميع البيانات من 2-3 تجارب مستقلة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تقييم الشفاء من الجروح الجلدية الذيل الختان. (أ)صور تمثيلية لجروح جلد الذيل الختان التقطت 1 و 7 و 15 يوما بعد الإصابة. (ب)معدل إغلاق جروح الجلد الذيل الختان. تم تصوير الجروح كل يومين. تم استخدام برنامج معالجة الصور لتتبع هوامش سرير الجرح وحساب مساحة الجرح في النقاط الزمنية المشار إليها. يتم تقديم منطقة الجرح كجزء صغير من منطقة الجرح التي تم قياسها في اليوم 1. صور تمثيلية للمقاطع المتقاطعة التي تم تضمينها من البارافين، مقطعة، وملطخة بـ(C)H & E أو(D)تراكروم ماسون. كان الجرح يقع على السطح الرذيل للمقطع العرضي للذيل. يشار إلى هوامش الجرح الجانبية بواسطة رؤوس الأسهم. البيانات الموضحة في(B)هي متوسط ± SEM ، n = 8 فئران لكل مجموعة. يتم الجمع بين البيانات من تجربتين مستقلتين. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تصف هذه المقالة نموذجين للجرح المورين قابل للمسار يسمحان بتقييم استجابة التئام الجروح الحادة. تتضمن الطريقة الأولى الزرع الجراحي لإسفنج PVA في الفضاء تحت الجلد الظهري. هذا النهج يوفر ميزة متميزة على نماذج الجروح القائمة على خزعة لدراسة استجابة التئام الجروح الخلوية بسبب العدد الكبير من الخلايا وكمية سوائل الجرح التي تم الحصول عليها من الإسفنج المعزول. من أجل التنفيذ الناجح لهذا الإجراء ، فإن الحفاظ على حقل جراحي معقم عن طريق تنظيف الجلد حول الشق بشكل شامل أمر حتمي ، لأن نقل البكتيريا إلى الجرح سيغير بشكل كبير مسار الشفاء. باستخدام طريقة عزل الخلية الموضحة هنا، من الممكن عزل ما لا يقل عن 1-10 × 106 خلايا من الإسفنج PVA، اعتمادا على وقت استخراج الإسفنج. غالبية الخلايا المعزولة عن الجروح الإسفنجية PVA قابلة للحياة(الشكل 2D). ومع ذلك ، لأنه من الممكن للخلايا الميتة أن تشكل ما يصل إلى ~ 20 ٪ من خلايا الجرح المعزولة بعد التعطيل الميكانيكي ، فمن المستحسن بشدة استخدام بقعة قابلية البقاء عند المضي قدما في التحليلات القائمة على التدفق القائم على قياس الخلايا. الخلايا المعزولة عن الجروح الإسفنجية PVA هي في المقام الأول من أصل الهيماتوبويتيك كما تحددها CD45 الإيجابية(الشكل 2D). التراكم السريع للالعدلات تليها monocytes والضامة يتفق مع المراحل الحادة لإصلاح الجرح3،4،34،35،36،37،38. الخلايا المعزولة مناسبة لتحليلات المصب بما في ذلك المناعة، وفرز الخلايا، وزراعة، واستخراج الحمض النووي الريبي، ومجموعة متنوعة من المقالات الوظيفية.

يسمح نموذج الجرح الإسفنج PVA أيضًا بعزل السوائل ، وهو مثالي لتقييم استجابات السيتوكين وعوامل النمو في بيئة الجروح الحادة. سوائل الإسفنج PVA هي مناسبة للاختبار من قبل ELISA، وإزالة المناعة متعددة المتعددة المستندة إلى النحل، وكمية البروتين، من بين أمور أخرى. وقد أظهرت الدراسات السابقة من خلال قياس السيتوكين وعوامل النمو أن بيئة الجرح المبكر هي التهابية في الطبيعة ، مع الاستقراء السريع لIL-6 و TNF-α و IL-1α من الأيام 1-3. ثم ينتقل بيئة الجرح إلى حالة التعويضية مع التعريفي في وقت لاحق من العوامل النمو الموالية للأنجيوجينيك والليفية، بما في ذلك VEGF و TGF-α22،23،25،26،30.

في حين أن نموذج زرع الإسفنج PVA مفيد لدراسة استجابات الجروح الحادة الخلوية والسيتوكين ، فإن أحد قيوده هو عدم القدرة على قياس معدل أو درجة الشفاء. قد تكون هناك حاجة إلى قياس هذا الجانب من التئام الجروح عند تقييم آثار حالة مرضية على جوانب مختلفة من استجابة التئام الجروح30. بالنسبة لهذا المقياس، يفضل استخدام الأساليب القائمة على الخزعة. هنا، يتم تقديم نموذج الختان الجلد الذيل. في هذا النموذج ، يتم استئصال قسم سمك كامل من الجلد الذيل من السطح الظهري للذيل. مرة أخرى ، الحفاظ على حقل جراحي معقم مهم لتجنب تلقيح سرير الجرح. ويوصى أيضا باستخدام فيلم حاجز رذاذ أو غيرها من تغطية الجرح لتجنب عدوى الجرح في وقت لاحق. الفئران الذكور الأكبر سنا أو سلالات عدوانية تتطلب السكن منفردا لتجنب تعطيل الجرح. ميزة خاصة من الذيل كموقع لدراسة التئام الجروح هو أنه يعتمد أكثر على إعادة الظهارية للإغلاق، كما وصفها آخرون27،32،33. بالإضافة إلى قياس منطقة سرير الجرح وإجراء التحليلات النسيجية ، أبلغ آخرون عن استخدامه في تقييم فعالية التدخلات الموضعية في تعديل عمليات الشفاء33.

كل نموذج من نماذج الجرح الموصوفة في هذه الأساليب توفر مزايا متميزة لفهم عمليات إصلاح الجروح في حالة ثابتة وفي وجود المراضات المصاحبة. نظرًا للتوافر الواسع للسلالات المعدلة وراثيًا من الفئران الأصيلة ، فمن الممكن أيضًا التلاعب باستجابات التئام الجروح للإجابة على الأسئلة الميكانيكية حول العملية. وعلاوة على ذلك، يمكن تنفيذ هذه الأنظمة في نماذج المورين من الشروط المرتبطة البلسم الجروح الفقراء بما في ذلك مرض السكري، والشيخوخة، والعدوى الثانوية، وغيرها30،36،39،40. قد توفر الرؤى الميكانيكية المكتسبة من دراسات المورين أساسًا لدراسة التئام الجروح في النماذج الحيوانية ذات الترتيب الأعلى. معا، وPVA زرع الإسفنج والنماذج الختان ة الجروح الجلد الذيل توفر أنظمة قابلة للاستشفاء وتنوعا لتوضيح عمليات التئام الجروح في ظل حالة ثابتة والظروف المرضية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

يود المؤلفان أن يشكرا كيفن كارلسون من مرفق قياس وفرز التدفق في جامعة براون للتشاور والمساعدة في تجارب قياس الخلايا المتدفقة. تم إنشاء الصور في الشكل 1B و C مع BioRender. وشكر كايلا لي وغريغوري سيربا على مساعدتهما في التصوير الفوتوغرافي. تم دعم هذا العمل من خلال منح من التالي: وكالة مشاريع البحوث المتقدمة الدفاعية (DARPA) YFAA15 D15AP00100، عميد مجالات جائزة العلوم الجديدة الناشئة (جامعة براون)، المعهد الوطني لرئة القلب والدم (NHLBI) 1R01HL126887-01A1، المعهد الوطني للعلوم البيئية T32-ES7272 (التدريب في علم الأمراض البيئية)، وجائزة بذور البحوث في جامعة براون.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific BP3991
15 mL centrifuge tubes, Olympus Genesee 28-103
1x HBSS (+Calcium, +Magnesium, –Phenol Red) ThermoFisher Scientific 14025076
5ml Syringe BD 309646
Anti-mouse CD45.2-APC Fire750 BioLegend 109852 Clone 104
Anti-mouse F4/80-eFluor660 ThermoFisher Scientific 50-4801-82 Clone BM8
Anti-mouse Ly6C-FITC BD Biosciences 553104 Clone AL-21
Anti-mouse Ly6G-PerCP-eFluor710 ThermoFisher Scientific 46-9668-82 Clone 1A8-Ly6g
Anti-mouse Siglec-F-APC-R700 BD Biosciences 565183 Clone E50-2440
Autoclip Stainless Steel Wound Clip Applier Braintree Scientific NC9021392
Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9mm Braintree Scientific NC9334081
Blender Bag, 80mL Fisher Scientific 14258201
Culture Tube, 16mL, 17x100 Genesee Scientific 21-130
Fetal Bovine Serum - Standard ThermoFisher Scientific 10437028
Fixable Viability Dye eFluor506 ThermoFisher Scientific 65-0866-14
Hepes Solution, 1M Genesee Scientific 25-534
ImageJ Software NIH
Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15070-063
Polyvinyl alcohol sponge - large pore size Ivalon/PVA Unlimited www.sponge-pva.com
Povidone-iodine solution, 10% Fisher Scientific 3955-16
Spray barrier film, Cavilon 3M 3346E
Stomacher 80 Biomaster, 110V Seward 0080/000/AJ

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gottrup, F., Agren, M. S., Karlsmark, T. Models for use in wound healing research: a survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 8, (2), 83-96 (2000).
  2. Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. A Modeling Conundrum: Murine for Cutaneous Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138, (4), 736-740 (2018).
  3. Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: Mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6, (265), (2014).
  4. Huber-Lang, M., Lambris, J. D., Ward, P. A. Innate immune responses to trauma. Nature Immunology. 19, (4), 327-341 (2018).
  5. Novak, M. L., Koh, T. J. Phenotypic Transitions of Macrophages Orchestrate Tissue Repair. The American Journal of Pathology. 183, (5), 1352-1363 (2013).
  6. Martins-Green, M., Petreaca, M., Wang, L. Chemokines and Their Receptors Are Key Players in the Orchestra That Regulates Wound Healing. Advances in Wound Care. 2, (7), 327-347 (2013).
  7. Guerrero-Juarez, C. F., et al. Single-cell analysis reveals fibroblast heterogeneity and myeloid-derived adipocyte progenitors in murine skin wounds. Nature Communications. 10, (1), 650 (2019).
  8. Shook, B. A., et al. Myofibroblast proliferation and heterogeneity are supported by macrophages during skin repair. Science. 362, (6417), 2971 (2018).
  9. Davidson, J. M., et al. Accelerated wound repair, cell proliferation, and collagen accumulation are produced by a cartilage-derived growth factor. The Journal of Cell Biology. 100, (4), 1219-1227 (1985).
  10. Buckley, A., Davidson, J. M., Kamerath, C. D., Wolt, T. B., Woodward, S. C. Sustained release of epidermal growth factor accelerates wound repair. Proceedings of the National Academy of Sciences. 82, (21), 7340-7344 (1985).
  11. Peterson, J. M., Barbul, A., Breslin, R. J., Wasserkrug, H. L., Efron, G. Significance of T-lymphocytes in wound healing. Surgery. 102, (2), 300-305 (1987).
  12. Efron, J. E., Frankel, H. L., Lazarou, S. A., Wasserkrug, H. L., Barbul, A. Wound healing and T-lymphocytes. Journal of Surgical Research. 48, (5), 460-463 (1990).
  13. Schäffer, M. R., Tantry, U., Thornton, F. J., Barbul, A. Inhibition of nitric oxide synthesis in wounds: pharmacology and effect on accumulation of collagen in wounds in mice. The European Journal of Surgery = Acta Chirurgica. 165, (3), 262-267 (1999).
  14. Opalenik, S. R., Davidson, J. M. Fibroblast differentiation of bone marrow-derived cells during wound repair. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 19, (11), 1561-1563 (2005).
  15. Järveläinen, H., et al. A role for decorin in cutaneous wound healing and angiogenesis. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 14, (4), 443-452 (2006).
  16. Luckett, L. R., Gallucci, R. M. Interleukin-6 (IL-6) modulates migration and matrix metalloproteinase function in dermal fibroblasts from IL-6KO mice. The British Journal of Dermatology. 156, (6), 1163-1171 (2007).
  17. Daniel, T., et al. Regulation of the postburn wound inflammatory response by gammadelta T-cells. Shock. 28, (3), 278-283 (2007).
  18. MacLauchlan, S., et al. Macrophage fusion, giant cell formation, and the foreign body response require matrix metalloproteinase 9. Journal of Leukocyte Biology. 85, (4), 617-626 (2009).
  19. Schwacha, M. G., Thobe, B. M., Daniel, T., Hubbard, W. J. Impact of thermal injury on wound infiltration and the dermal inflammatory response. Journal of Surgical Research. 158, (1), 112-120 (2010).
  20. Ganesh, K., et al. Prostaglandin E2 Induces Oncostatin M Expression in Human Chronic Wound Macrophages through Axl Receptor Tyrosine Kinase Pathway. The Journal of Immunology. 189, (5), 2563-2573 (2012).
  21. Deskins, D. L., et al. Human mesenchymal stromal cells: identifying assays to predict potency for therapeutic selection. Stem Cells Translational Medicine. 2, (2), 151-158 (2013).
  22. Daley, J. M., Brancato, S. K., Thomay, A. A., Reichner, J. S., Albina, J. E. The phenotype of murine wound macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 87, (1), 59-67 (2010).
  23. Thomay, A. A., et al. Disruption of Interleukin-1 Signaling Improves the Quality of Wound Healing. The American Journal of Pathology. 174, (6), 2129-2136 (2009).
  24. Brancato, S. K., et al. Toll-like receptor 4 signaling regulates the acute local inflammatory response to injury and the fibrosis/neovascularization of sterile wounds. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 21, (4), 624-633 (2013).
  25. Daley, J. M., et al. Modulation of macrophage phenotype by soluble product(s) released from neutrophils. Journal of Immunology. 174, (4), 2265-2272 (2005).
  26. Crane, M. J., et al. The monocyte to macrophage transition in the murine sterile wound. PloS One. 9, (1), 86660 (2014).
  27. Falanga, V., et al. Full-thickness wounding of the mouse tail as a model for delayed wound healing: accelerated wound closure in Smad3 knock-out mice. Wound Repair and Regeneration. 12, (3), 320-326 (2004).
  28. Li, J., et al. Molecular mechanisms underlying skeletal growth arrest by cutaneous scarring. Bone. 66, 223-231 (2014).
  29. Zhou, S., et al. A Novel Model for Cutaneous Wound Healing and Scarring in the Rat. Plastic and Reconstructive Surgery. 143, (2), 468-477 (2019).
  30. Crane, M. J., et al. Pulmonary influenza A virus infection leads to suppression of the innate immune response to dermal injury. PLOS Pathogens. 14, (8), 1007212 (2018).
  31. Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research Techniques Made Simple: Animal Models Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138, (10), 2095-2105 (2018).
  32. Rittié, L. Cellular mechanisms of skin repair in humans and other mammals. Journal of Cell Communication and Signaling. 10, (2), 103-120 (2016).
  33. Falanga, V., et al. Autologous Bone Marrow-Derived Cultured Mesenchymal Stem Cells Delivered in a Fibrin Spray Accelerate Healing in Murine and Human Cutaneous Wounds. Tissue Engineering. 13, (6), 1299-1312 (2007).
  34. Lucas, T., et al. Differential Roles of Macrophages in Diverse Phases of Skin Repair. The Journal of Immunology. 184, (7), 3964-3977 (2010).
  35. Wang, J., et al. Visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair. Science. 358, (6359), 111-116 (2017).
  36. Mirza, R. E., Koh, T. J. Contributions of cell subsets to cytokine production during normal and impaired wound healing. Cytokine. 1-4 (2014).
  37. Mirza, R., DiPietro, L. A., Koh, T. J. Selective and Specific Macrophage Ablation Is Detrimental to Wound Healing in Mice. The American Journal of Pathology. 175, (6), 2454-2462 (2010).
  38. DiPietro, L. A., Burdick, M., Low, Q. E., Kunkel, S. L., Strieter, R. M. MIP-1alpha as a critical macrophage chemoattractant in murine wound repair. Journal of Clinical Investigation. 101, (8), 1693-1698 (1998).
  39. Wetzler, C., Kämpfer, H., Stallmeyer, B., Pfeilschifter, J., Frank, S. Large and Sustained Induction of Chemokines during Impaired Wound Healing in the Genetically Diabetic Mouse: Prolonged Persistence of Neutrophils and Macrophages during the Late Phase of Repair. Journal of Investigative Dermatology. 115, (2), 245-253 (2000).
  40. Kim, D. J., Mustoe, T., Clark, R. A. Cutaneous wound healing in aging small mammals: a systematic review. Wound Repair and Regeneration. 23, (3), 318-339 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics