הערכה של ריפוי בפצע חריפה באמצעות השרכה העור מפוליויניל כוהל של הרקמה העורית והזנב Excisional הפצע מודלים.

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

כאן, שני מודלים מורתיים ריפוי הפצע מתוארים, אחד שנועד להעריך את התגובה התאית הפצע ריפוי והשני כדי לכמת את שיעור סגירת הפצע. שיטות אלה ניתן להשתמש עם דגמי מחלות מורכבות כגון סוכרת כדי לקבוע מנגנונים של היבטים שונים של ריפוי הפצע המסכן.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Crane, M. J., Henry Jr, W. L., Tran, H. L., Albina, J. E., Jamieson, A. M. Assessment of Acute Wound Healing using the Dorsal Subcutaneous Polyvinyl Alcohol Sponge Implantation and Excisional Tail Skin Wound Models.. J. Vis. Exp. (157), e60653, doi:10.3791/60653 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ריפוי הפצע הוא תהליך מורכב הדורש התקדמות מסודרת של דלקת, רקמת היווצרות הגרטולציות, פיברוזיס, ורזולוציה. דגמי מורנה מספקים תובנה מכניסטית רבת ערך בתהליכים אלה; עם זאת, אף דגם יחיד לא מטפל באופן מלא בכל ההיבטים של התגובה ריפוי הפצע. במקום זאת, הוא אידיאלי להשתמש בדגמים מרובים כדי לטפל בהיבטים שונים של ריפוי הפצע. כאן, שתי שיטות שונות הכתובות היבטים מגוונים של תגובת ריפוי הפצע מתוארים. במודל הראשון, ספוגים לאלכוהול פוליוויניל מתת-עורי מושתלים לאורך העכבר dorsum. בעקבות איחזור ספוג, תאים יכולים להיות מבודדים על ידי שיבוש מכני, ונוזלים ניתן לחלץ על ידי צנטריפוגה, ובכך לאפשר אפיון מפורט של תגובות הסלולר וציטוקין בסביבה פצע אקוטי. הגבלה של מודל זה היא חוסר יכולת להעריך את קצב סגירת הפצע. לשם כך, נעשה שימוש במודל כריתה של עור הזנב. בדגם זה, 10 מ"מ x 3 מ"מ פיסת מלבנית של עור זנב הוא מגורש לאורך המשטח האחורי, ליד הבסיס של הזנב. מודל זה ניתן לצלם בקלות עבור ניתוח planimetric כדי לקבוע שיעורי הריפוי ניתן לקבל עבור ניתוח היסטולוגית. שתי השיטות המתוארות יכולות להיות מנוצל בזנים של עכברים ששונו גנטית, או בשילוב עם מודלים של תנאי תחלואה, כגון סוכרת, הזדקנות, או זיהום משני, על מנת להבהיר מנגנוני ריפוי הפצע.

Introduction

יש הרבה מערכות מודל murine זמין כדי לבחון את תהליכי ריפוי הפצע, כל אחד מהם בעל יתרונות ספציפיים ומגבלות1,2. השיטות הבאות מציגות שני דגמים של פציעות מורתיים, שכל אחד מהם מטפל בהיבט מסוים של תגובת הפצע, וניתן להשתמש בו כדי לזהות את הסיבה והתוצאה של רטבאליות בתגובה לפציעה. תהליך ריפוי הפצעים מתרחש בשלבים נפרדים. השלב הראשון הוא דלקתי, מאופיין הזרימה המהירה של טסיות, נויטרופילים, מונוציטים/מקרופאגים, כמו גם הייצור של ציטוקינים proinflammatory ו נוגדנים. בעקבות הרזולוציה של דלקת, הסביבה מעברים למצב משתנה יותר עם אינדוקציה של ציטוקינים profibrotic וגורמי צמיחה. רקמות גרטולציות מופטות ויוצרות צורה עם הגירה של מיופיברופיצוצים, פיברותקיעות, תאי אפיתל ותאי אנדותל. בשלבים הסופיים, מטריקס החילוץ הזמני הוא שופצה, והיווצרות צלקת הסגר הפצע ההכנסות2,3,4,5,6,7,8.

לא מודל murine אחד מספק מערכת ללמוד את כל השלבים של ריפוי הפצע2. כאן, שני מודלים הפצע כירורגי מתוארים: אחד מובהר התאים הסלולר אקוטי הפצע ריפוי, והשני מאפשר הערכה של סגירת הפצע, כמו גם ניתוח היסטולוגית. שתי השיטות הללו עשויות להיות מועסקים בצורה משלימה כדי להעריך את ההשפעות של הטיפול בהפרעות והתחלואה בהיבטים שונים של תגובת הפצע. השרטת תת עורית של פוליוויניל אלכוהול (pva) ספוגים היא מערכת אשר נעשה שימוש במודלים מכרסמים במשך עשורים כדי להבהיר היבטים רבים של התגובות רקמות תאית וגרטולציות9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 ,21,22,23,24 גישה זו מאפשרת לשליפה של נוזלי הפצע העשיר cytokine ומחלחל הסלולר. במודל זה, 1 ס מ x 1 ס מ x 0.5 ס מ חתיכות של ספוג PVA ממוקמים לתוך כיסים תת עורית דרך חתך 2 ס מ שנעשו על קו האמצע האחורי. החתך סגור עם כירורגי קליפים, ואת הספוגים ניתן לאחזר בזמן מאוחר יותר נקודות בידוד תאים ונוזלים. התקשורת התאית והציטוקין של ספוגים מבודדים משקפת את השלבים הנורמליים של ריפוי הפצע החריף עד 14 ימים פוסטיר. במועד מאוחר יותר המודל הוא יתרון יותר עבור לימוד היווצרות רקמת הגרטולזה ואת תגובת גוף זר1. עם מערכת זו, ניתן לבודד את > 106 תאים, אשר מציעה יתרון ברור עבור הספק פנוטיic ופונקציונלי ובידוד RNA, על בידוד תאים משיטות אחרות המבוססות על ביופסיה1,22,23,25,26.

שיעור סגירת הפצע נקבע באמצעות מודל כריתה של עור הזנב. במודל זה, כפי שמתואר בתחילה על ידי falanga ואח ' ודיווחו על ידי אחרים27,28,29,30, 1 ס"מ x 0.3 ס"מ בעובי מקטע של עור זנב מוסר ליד בסיס הזנב. אזור הפציעה הוא מדמיין בקלות, ניתן למדוד לאורך זמן. לחילופין, ניתן לבודד את רקמת הזנב לניתוח היסטולוגית. גישה זו יכולה לשמש כחלופה או בשילוב עם שיטת ביופסיה מבוססת על המכה היטב. ההבדלים העיקריים בין שני מודלים אלה הם שיעור סגירת הפצע, נוכחות או העדר פרווה, ומבנה העור2,31,32. פצעי העור של הזנב מציעים פרק זמן ארוך יותר בו יש להעריך את סגירת הפצע, כפי שנדרש כ -21 יום לסיום מלא. זה מנוגד לunsplinted ביופסיות אגרוף, אשר לרפא מהר הרבה יותר (~ 7-10 ימים), בעיקר על ידי התכווצות בשל הפעולה של הפניקולוס carnosus. Splinted ביופסיות אגרוף לרפא לאט יותר ולצמצם את ההשפעות של ריפוי הקונקטילה, אבל להסתמך על נוכחות של גוף זר כדי להגביל את המנגנון המבוסס על מנגנונים1,2,27,30,31,33.

מודלים הפצע המתואר הם אינפורמטיבי להבנת תהליכי ריפוי נורמליים הפצע בהיעדר הפרטורציה. בעוד הריפוי של העור מכרסם שונה בדרכים משמעותיות מאוד מן העור האנושי, כולל מבנה רופף, הסתמכות על ריפוי הקונקטילה, והבדלים אנטומיים אחרים, מערכת murine מציע יתרונות מסוימים למחקרים מכניסטיים והקרנה. בראש ובראשונה מדובר בזמינות של זנים מוטקיים ומוטציות גנטיות, מסאחיזה גנטית ועלות נמוכה יותר. תובנות מכניסטיות שנרכשו ממחקרים מורתיים ניתן לתרגם למודלים בעלי חיים מורכבים המחקים יותר את ריפוי העור האנושי, כגון מערכת חזירי2,31.

בנוסף לבדיקה של תגובות ריפוי פצעים במצב יציב, מודלים אלה יכולים להיות משולבים עם תנאי טיפול מקבל כדי להבין את הבסיס של מומים ריפוי הפצע בסלולר, cy, ורמת רקמה גסה. זה בהגדרה זו מסוים כי שני הדגמים ניתן להשתמש בקונצרט כדי להעריך את ההשפעות של מצב מסוים בשיעור תחלואה, כגון דלקת ריאות לאחר הניתוח, הן התגובה התאית חריפה הפצע ואת שיעור סגירת הפצע30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל מחקרים בעלי חיים שתוארו כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת בראון והשתמש וביצע בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המכון הלאומי לבריאות.  הערה: בסרטון הווידאו, המסך הכירורגי הושמט למטרות הדגמה.

1. השתלת תת-עורית של ספוגים PVA

  1. השימוש במספריים לגזור גיליונות של ספוג PVA לתוך 8 מ"מ x 8 מ"מ x 4 מ מ חתיכות. מייבשים את פיסות הספוג של PVA באמצעות מיזוג אותם בתוך הערוץ 1x סטרילי בגביע.
  2. לחיטוי הספוגים 1 x PBS לחטא, וקריר לחלוטין. מאחסנים ספוגים לאחסון באמצעות ערוץ הPBS של 1x ב -4 ° c.
  3. לפני ביצוע ההשתלה כירורגית, סדרת מחלקים את המספר הדרוש של ספוגים לתוך תבשיל תרבות סטרילית תחת תנאים סטריליים במכסה זרם למינארי. לאחסן את הספוגים הנוספים ב-1x סטרילי ב 4 ° צ' לשימוש עתידי. ודא כי ספוגים להתנפח 1 ס"מ x 1 ס"מ x 0.5 ס"מ לאחר הסבה. תמונה של ספוגים PVA מיובש מוצג באיור 1A.
    הערה: כדי לשמור על עקרות האתר כירורגי, הליך השרשה ספוג PVA דורש אדם אחד כדי לטפל בעכבר ולהכין את האתר כירורגי, ואדם שני לבצע את ההשתלה.
  4. באמצעות הזרקת הצפק של 80 מ"ג/ק"ג במשך שבוע בן 8 – 12 שבועות, זכר C57BL/6J. ניהול 40 מ"ג/ק"ג של xylazine intraperitoneally לחוסר כאבים.  לאשר את עומק ההרדמה על ידי אובדן של רפלקס דוושה. הכינו את האתר כירורגי על ידי הסרת השיער לאורך dorsum עם קוצץ. באמצעות גזה סטרילי, להחיל povidone-פתרון יוד לאזור גילוח 2x, ואחריו 70% אתנול.
  5. למקם את העכבר על וילונות כירורגי סטרילי. מניחים משטח מחומם מתחת וילונות כירורגיים כדי לשמור על טמפרטורת הליבה של העכבר.
  6. לחבוש כפפות כירורגי סטרילי לביצוע הניתוח. משוך את העור האחורי הרחק מן הרקמה הבסיסית עם מלקחיים, ובאמצעות מספריים כירורגי סטרילי, לעשות חתך 2 ס מ לאורך קו האמצע בערך 2 ס מ קדמי לבסיס הזנב. בעוד מחזיק את החתך פתוח עם מלקחיים סטרילי, להשתמש מעוקל סטרילי, מספריים בוטה ניתוח משופעת ליצור כיס תת עורית לאורך dorsum באחת המיקומים המצוינים באיור 1B.
  7. המשך להשתמש מלקחיים כדי להסיר את העור הרחק הרקמה הבסיסית. באמצעות מספריים כירורגי סטרילי, בעדינות לסחוט אחד ספוג PVA בצלחת התרבות כדי להסיר את העודף PBS. להרים את הספוג PVA בפינה אחת באמצעות מספריים כירורגי סטרילי, מובילה עם הפינה המוחזקות על ידי המספריים, מניחים את הספוג לתוך הכיס התת עורית שנוצר בשלב 1.4.
  8. חזור על תהליך זה 5x, הצבת סך של שישה ספוגים לתוך כיסים תת עורית כפי שמוצג באיור 1B.
  9. לצבוט את העור ביחד עם מלקחיים סטרילי ולסגור את החתך עם שני קטעי הפצע נירוסטה.
  10. השתמש בערכה חדשה של כלי ניתוח סטרילי עבור כל עכבר. לחילופין, השתמש בעיקור חרוזים כדי לעקר מכשירים בין עכברים.

2. בידוד נוזלים מספוגים PVA

  1. על מנת להעריך את הפצע החריף של הפצעים, לבודד ספוגים בין 1 – 14 ימים פוסטימ.
  2. הכינו צינור לאיסוף נוזלים באמצעות קינון חבית של מזרק של 5 מ"ל לתוך צינור התרבות של 16 מ"ל.
  3. המתת חסד עכבר עם ספוגים PVA מושתל על ידי שיתוף2 חנק ואחריו פריקה צוואר הרחם.
  4. להסיר את הסיכות כירורגי ולפתוח את החתך עם מלקחיים שיניים. השתמש במספריים כדי להאריך את החתך לאורך קו האמצע.
  5. באמצעות מלקחיים, לחלץ ספוג אחד מכיסו התת עורית ולהעביר אותו לחבית מוכן מזרק, להיות זהיר כדי למזער את הלחץ על הספוג. שטחו את כל רקמת החיבור שנותרה דבקה על פני השטח של הספוג. השתמש במספריים כדי לנתח את הספוג מהרקמה שמסביב במידת הצורך. חזור על תהליך ההסרה ספוג עם הספוגים הנותרים. מניחים את הצינור המכיל את הספוגים על הקרח.
  6. כדי לבודד את נוזל הפצע, צנטריפוגה את צינור התרבות המכילה את 5 מזרק mL עם ספוגים ב 700 x g עבור 10 דקות.
  7. לאחר הצנטריפוגה, למחוק את המזרק ואת הספוגים. נוזל הפצע נאסף בתוך 16 שפופרת התרבות של mL. תמונה ייצוגית של נוזל שנאסף מיום 7 פצע מוצג באיור 1D. העבירו את נוזל הפצע לצינור נקי לאחסון לטווח ארוך ב-80 ° c.

3. בידוד תאים מספוגים PVA

  1. כדי להעריך את הפצע החריף הריפוי התאים הסלולריים, לאסוף ספוגים בין 1 – 14-ימים השרשה לאחר ספוג. ספוגים שהתקבלו מפצע 7 ימים לאחר השרשה מוצגים באיור 1E.
  2. להכין אוסף בינוני המכיל 1x HBSS (+ סידן/מגנזיום/-פנול אדום) שיושלם עם 1% FBS, 1% HEPES, ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין.
  3. מחלק 5 מ ל של בינוניות של אוסף HBSS לתוך צינור מתחת ל 15 מ ל חרוט.
  4. לחלץ את ספוגים PVA מעכברים מורדמים כמתואר 2.2 – 2.4. מניחים את הספוגים לתוך צינור החרוט המכיל 5 מ ל של מדיום אוסף HBSS.
  5. העבר את הספוגים ואת מדיום אוסף HBSS לשקית מבלנדר של 80 mL על ידי שפיכת. תלו את שקית הבלנדר מתוך הצוהר של בלנדר ההנעה, ממוקם כך המשוטים להכות את ספוגים ומדיה. להתאים את ההגדרות של בלנדר ההנעה לרוץ בגבוה עבור 60 s.. לחץ על התחל
  6. העבר את המדיה משקית הבלנדר בחזרה ל-15 mL עם פיפטה, ומשאיר את הספוגים מאחור בשקית. לסחוט את הספוגים לשחרר ביסודיות את המדיה. להתאים את ההגדרות של בלנדר ההנעה לרוץ 30 s על גבוה. הוסף 5 מ ל של מדיה לשקית הבלנדר וחזור על התהליך המכאוב 2x עבור סך של שלושה שטיפת ספוג.
  7. צנטריפוגה את צינור החרוט ב 250 x g עבור 5 דקות. כדוריות אדומות של תאים ותאי דם אדומים יהיו גלויים בתחתית צינור החרוט לאחר צנטריפוגה.
  8. להיפטר supernatant ולבצע הליזה תא דם אדום: להוסיף 900 μL של dH2O כדי הגלולה תא ו פיפטה לערבב. לנטרל עם 100 μL של 10x PBS. הוסף 4 מ ל של 1x PBS לצינור כדי לנטרל במלואו את הליזה, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 250 x g עבור 5 דקות.
    הערה: שלב הפירוק צריך להיות קצר; לעזוב את המים במגע עם התאים במשך יותר מ 3-5 s יכול לגרום לפירוק של כדוריות דם לא אדומות.
  9. לאחר צנטריפוגה, כדורית תא לבן המכיל תאי הפצע נטול כדוריות דם אדומות יהיה נוכח בתחתית צינור החרוט. השמט את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה במדיום הרצוי לניתוח במורד הזרם.

4. הזרימה האופציונלית לניתוח של לוקיציטים מולדים מבודדים מפצעי הספוג PVA

  1. השהה מחדש 0.5 – 1 x 106 תאים הפצע ב 25 μl של פתרון 2x של הנוגדן חסימת המכיל 10 Μg/mL ANTI-CD16/CD32 FCRΓII/III נוגדן מדולל ב-1X PBS + 1% bsa.
    הערה: כל הנוגדנים צריך להיות מתוח כדי לקבוע ריכוזים אופטימליים עבור הניתוח cy, הזרימה.
  2. דגירה את התאים עם נוגדן חסימת עבור 10 דקות על הקרח.
  3. לעשות שילוב מאסטר 2x של נוגדנים המכילים 2.5 mg/mL של PerCP-eFluor710-Ly6G, 5 מ"ג/mL של FITC-Ly6C, APC-Fire750-CD 45.2, APC-R700-Siglec-F, ו 10 מ"ג/mL של eFluor660-F4-80 מדולל 1x PBS + 1% BSA. במישרין להוסיף 25 μL של קוקטייל הנוגדן לתאים המדגירה של נוגדן חוסם.
  4. מגנה את התאים במשך 20 דקות על הקרח, מוגן מפני אור.
  5. לשטוף את התאים 2x עם 1x PBS.
  6. לעשות שילוב מאסטר של הכדאיות אמין-תגובתי לתיקון-eFluor506 מדולל 1:1000 ב-1x PBS. השהה מחדש את הגלולה בתא ב-50 μL של הפתרון לצבע הכדאיות.
    הערה: הסרום חייב להיות מחוץ לשלב הכדאיות הניתן לתיקון, כפי שהוא ימנע כריכת הצבע לחלבונים אנדוגניים. מגנה את התאים במשך 20 דקות על הקרח, מוגן מפני אור.
  7. לשטוף את התאים 2x עם 1x PBS. השהה מחדש את הגלולה בתא ב 50 μL של 1% פאראמפורמלדהיד.
  8. דגירה את התאים עם 1% פאראמפורמלדהיד עבור 15 דקות על הקרח, מוגן מפני אור.
  9. לשטוף את התאים 1x עם הPBS 1x ולהשעות מחדש את הגלולה ב-1x PBS עבור ניתוח cy, לצורך זרימה.

5. כריתה של עור זנב

  1. באמצעות הזרקת הצפק של 80 מ"ג/ק"ג של שבוע בן 8-12, זכר C57BL/6J. ניהול 40 מ"ג/ק"ג של xylazine intraperitoneally לחוסר כאבים. לאשר את עומק ההרדמה על ידי אובדן של רפלקס דוושה.
  2. להכין את האתר כירורגי על הזנב של העכבר מורדם באמצעות גזה סטרילית להחיל povidone-הפתרון יוד 2x, ואחריו יישום אחד של 70% אתנול.
  3. הגדרת קטע 10 מ"מ x 3 מ"מ על המשטח האחורי של הזנב, 10 מ"מ מהבסיס של הזנב (איור 1C) באמצעות סמן קבוע להתחקות אחר תבנית premade.
  4. מניחים את העכבר המעומנת. על וילונות כירורגיים סטריליים
  5. לחבוש כפפות סטרילי כירורגי לבצע את ההליכים כירורגי. עם להב אזמל סטרילי, לעשות חתך בעובי מלא לאורך החלק הימני, התחתון, ואת הקצה השמאלי של אזור הפצע.
  6. באמצעות מלקחיים סטרילי, לקלף את העור המתלהב הרחק הזנב, ולהשתמש מספריים כירורגי סטרילי לחתוך את הקצה העליון של אזור הפצע.
  7. תפעילי לחץ עם גזה סטרילית. כדי להפסיק את הדימום
  8. החלת סרט ריסוס מכשול על מיטת הפצע.
  9. צלם את הפצעים ממרחק קבוע במרווחי זמן קבועים. לנתח תמונות על ידי ניתוח planimetric כדי לקבוע מדידות אזור הפצע. לחילופין, השתמש בקליפרס כדי להשיג מדידות באורך וברוחב של הפצע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תגובה דלקתית מערכתית לאחר השתלת ספוג PVA
ניתוח השתלת ספוג PVA שנוצר תגובה דלקתית מערכתית, כפי שמתואר על ידי אינדוקציה של IL-6 פלזמה 1 יום לאחר פצעו (איור 2A). ציטוקינים אחרים proinflammatory כולל tnf-α ו-IL-1β, כמו גם מערך של נוגדנים כולל CCL2 ו CXCL1 המושרה באופן מערכתית ב -7 ימים הראשונים שלאחר pva השתלת ספוג, ותוארו במקומות אחרים26,30.

בידוד תאים ונוזלים מפצעי ספוג של PVA
היתרון העיקרי של המודל הפצע בספוג PVA הוא היכולת לשחזר מספיק תאים לניתוח פנוטילים ופונקציונלי של תגובת הפצע הסלולר חריפה. מספר התאים שניתן לשחזר מפצעים ספוג PVA מגביר לאורך זמן, מ כ 2 x 106 תאים לכל שישה ספוגים ביום הפצע 1 x 106 כדי 8 x 106 תאים על הפצע יום 7 (איור 2b). מספר הטלפון ממשיך לגדול. מעבר ליום השביעי לא מומלץ להמשיך מודל זה מעבר ~ 14 ימים בגלל הספוגים להיות מלאה על ידי קולגן ומעברים מערכת מידול תגובה לריפוי פציעה חריפה כדי לדגמן הגוף הזרה גרגירומה1,22,23,25,26. נויטרופילים, מונוציטים, מקרופאגים היו הסלולר העיקרי לחדור פצעי ספוג PVA. נויטרופילים מראש את הפצע הסלולר ביום אחד לאחר פצעו, כפי שמוערך על ידי ניתוח cytometric הזרימה (איור 2C). מונוציטים ומקרופאגים נגזרים שהצטברו בתוך 3 ימים השתלת ספוג, ושלוש אוכלוסיות תאים גדלו במספר לאורך זמן (איור 2C). זרם מייצג cy, מנסה לאתר אסטרטגיה לזיהוי נויטרופילים, מונוציט ואוכלוסיות מקרופאג מוצג באיור 2D. לאחר כלילת תא doublets באמצעות הפרמטרים FSC-h ו-אס-סי-H (איור 2D, i ו- ii), תאים שאינם ניתנים לשימוש לא נכללו באמצעות צבע הכדאיות אמין-תגובתי (המוצג כאן) או לצבוע חומצת גרעין (למשל, בדיקת רעלים או Propidium יודיד) (איור 2d, iii). שרידי שרידים סלולריים לא הוסרו על ידי הצעדים הקודמים הנמצאים אז נשלל באמצעות FSC-A ו-מהאס-אס-אס פרמטרים (איור 2D, iv). תאים המטפאות מורכבת מרוב התאים PVA הפצע ספוג וזוהו על ידי CD45 ביטוי (איור 2D, v). נויטרופילים זוהו כמו Ly6G+siglec-F(איור 2d, vi). Siglec-F+ תאים היו בעיקר אאוזיפילים (איור 2d, vii). ב-Ly6G-siglec-F תאים, מונוציטים/מקרופאגים זוהו כ-F4/80+ תאים (איור 2d, viii). F4/80+ תאים יכול להיות מפוצל עוד יותר על-ידי ביטוי Ly6C כדי להבדיל Ly6Chi דלקתיות מונוציטים (איור 2d, ix) ו-Ly6C מקרופאגים מונוציטנמוך הנגזר (איור 2d, x)26.

היכולת למדוד ציטוקינים וגורמים אחרים מסיסים בפצע הוא יתרון נוסף למודל הפצע בספוג PVA. ניתן לחלץ עד 100 μL של נוזל לכל ספוג. נוזלים מחולצים מתאימים למגוון של במורד הזרם. האיתור של ציטוקינים ו-נוגדנים מוקדם ומאוחר נוזלי הפצע על ידי אליסה או חרוז מבוססי מולטיפלקס החיסונית דיווחו במקום אחר26,30. ניתן להשיג את שני התאים והנוזלים מאותו פצע. כדי לעשות זאת, מומלץ לבודד שלושה ספוגים מצדו השני של קו האמצע לבידוד התא 3 ספוגים מהצד הנגדי של קו האמצע להפקת נוזלים.

הערכת סגירת פצע באמצעות מודל כריתה של עור הזנב
מודל העור זנב excisional מספק אלטרנטיבה העור האחורי אגרוף שיטה ביופסיה כדי ללמוד סגירת הפצע איטי בעור המשרד חסר פרווה צפופה. תמונות דוגמה של פצעי עור זנב ב-1, 7 ו-15 ימים שלאחר כריתה מוצגים באיור 3A. הסגר פצע יכול להיות מכמת על ידי מדידת האזור של מיטת הפצע לאורך זמן. היום 7 ויום 15 המיטה באזור הפצע היו כ 70% ו 35%, בהתאמה, של היום 1 אזור הפצע (איור 3B). סגירת הפצע המלא נדרש כ 28 ימים. הפצע בעור הזנב יכול להיות גם נצפתה בחתך על ידי ניתוח היסטולוגית. איור 3C ואיור 3c להראות תמונות הנציגה של ה-H & E ו מסון ' s trichrome המוכתמת הזנב סעיפים, בהתאמה. השוליים הצדדיים של העור ההוא מסומנים על ידי ראשי חץ על המשטח האחורי של הזנב.

Figure 1
איור 1: סכמטית של מודלים ריפוי הפצע מורדין. (א) צד (שמאל) והחלק העליון (מימין) של ספוגים pva מיובש מדידה 8 מ"מ x 8 מ"מ x 0.4 מ"מ. (ב) איור של העכבר להפגין את המיקום של החתך באמצע הקו המרכזי (קו אדום מרכזי) ושישה 1 ס"מ x 1 ס"מ x 0.5 ס מ בכיסים תת עורית. (C) סכמטי מפגין את הגודל והמיקום של פצע העור האקסוציטי (10 מ"מ x 3 מ"מ מלבן אדום) על פני השטח של הזנב. (ד) נוזל הפצע מבודד שלושה ספוגים שאוחזרו מהחלל התת עורי 7 ימים לאחר השרשה. (ה) המראה של ספוגים שאוחזרו מהפצע 7 ימים לאחר השרשה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: התגובה הסיסטמית והתאית להשתלת ספוג PVA. (א) מסלול הזמן של רמות IL-6 בפלסמה מדגים כי השתלת ספוג pva הנגרמת תגובה דלקתית מערכתית. הריכוז של IL-6 נמדד באמצעות שיטת החיסוני המבוססת על חרוזים. (ב) מספר התאים מבודדים מ pva ספוגים פצע גדל לאורך זמן. (ג) קורס הזמן ממחיש את הצטברות של נויטרופילים, מונוציטים, ו מונופאגים נגזר הנגזרים בפצעי ספוג pva לאורך זמן. (ד) נציג הנושא אסטרטגיה של תאים בודדים מפצעי ספוג של pva מדגים כיצד לזהות תת מערכות ליקוציט על ידי ניתוח ציטומטלי זרימה. שערים מוגדרים כדלקמן:(i ו- ii) הדרה ללא ספק, (iii) הוצאה לפועל של תא מת תוך שימוש בצבע הכדאיות של מאמין-מגיב, (iv) פסולת הוצאה מהכלל על ידי fsc-a ו-אס. אס. אס, (v) CD45+ תאים המטפאות, (Vi) Ly6G+ נויטרופילים, (vii) siglec-f+ אאוזינופילים (viii) Ly6Gsiglec-f f4/80 + מונוציטים/מקרופאגים, (ix) f4 Ly6Chi -מונוציטים, ו (x) F4/80+Ly6C מקרופאגיםנמוכים . גייטס הוצבו על פי בקרות זריחה-פחות אחת (FMO). הנתונים המוצגים בC הם ממוצע ± SEM, n = 6 – 10 עכברים לכל קבוצה ב (א), n = 8-9 עכברים ב (ב), ו n = 6-8 עכברים ב (ג). כל הנתונים משולבים 2 – 3 ניסויים עצמאיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הערכה של ריפוי הפצע בעור הזנב האקסוציאני. (א) תצלומים מייצגים של פצעי העור הצוניים שנלקחו 1, 7 ו -15 יום לאחר פציעתו. (ב) שיעור הסגר על פצעי העור הצוניים. . הפצעים צולמו בכל יום אחר תוכנת עיבוד תמונה שימש כדי לעקוב אחר מיטה הפצע שוליים ולחשב את אזור הפצע בנקודות הזמן המצוין. אזור הפציעה מוצג כחלק מאזור הפצע הנמדד ביום הראשון. תמונות מייצגות של סעיפים הצלב זנב כי היו פרפין-מוטבע, מנות, ומוכתם עם (ג) H & E או (ד) הטריכרום של masson. הפצע נמצא על המשטח האחורי של חתך הזנב; שולי הפצע הצדדי מצוינים על ידי ראשי חץ. הנתונים המוצגים ב (ב) הם הממוצע ± SEM, n = 8 עכברים לכל קבוצה. הנתונים משולבים משני ניסויים עצמאיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מאמר זה מתאר שני מודלים הפצע murine מורי המאפשרים הערכה של תגובת הפצע לריפוי חריפה. השיטה הראשונה כרוכה ההשתלה כירורגית של ספוגים PVA בחלל תת עורית. גישה זו מציעה יתרון ברור על פני מודלים ביופסיה מבוססי הפצע ללמוד את התגובה התאית הריפוי הפצע בשל מספר גדול של תאים וכמות של נוזלי הפצע שהתקבלו מתוך ספוגים מבודדים. לביצוע מוצלח של הליך זה, שמירה על שדה כירורגי סטרילי על ידי ניקוי יסודי של העור סביב החתך הוא הכרחי, כמו רוברטסונית של חיידקים לתוך הפצע יהיה לשנות באופן משמעותי את מהלך הריפוי. באמצעות שיטת בידוד התא המתואר כאן, ניתן לבודד לפחות 1 – 10 x 106 תאים מתוך ספוגים pva, בהתאם לזמן של חילוץ ספוג. רוב התאים מבודדים מפצעי ספוג PVA הם קיימא (איור 2D). עם זאת, כי זה אפשרי עבור תאים מתים להוות עד ~ 20% של תאי הפצע בודד לאחר שיבוש מכני, מומלץ מאוד להשתמש בכתם הכדאיות כאשר ממשיכים עם הניתוח cy, מבוססי הזרימה. תאים בודדים מפצעי ספוג PVA הם בעיקר של מקור המטפאות כפי שנקבע על ידי CD45 חיוביות (איור 2D). הצטברות מהירה של נויטרופילים ואחריו מונוציטים מקרופאגים הוא עקבי עם שלבים חריפה של תיקון פצע3,4,34,35,36,37,38. תאים מבודדים מתאימים מנתח במורד הזרם כולל immunophenotyping קלדה, מיון התא, culturing, הפקת RNA, ומגוון של assays פונקציונלי.

מודל הפצע בספוג pva מאפשר גם לבידוד של נוזלים, אשר אידיאלית עבור הערכת ציטוקינים והתגובות גורם הצמיחה בסביבה פצע אקוטי. נוזלי הספוג של PVA מתאימים לבדיקות של אליסה, המבוססת על מולטינויה ומבוססת על החלבון, וכימות החלבונים בין היתר. מחקרים קודמים הפגינו באמצעות ציטוקינים ומדידת גורם הצמיחה כי הסביבה הפצע המוקדם הוא דלקתי בטבע, עם אינדוקציה מהירה של IL-6, tnf-α, ו-IL-1β מימים 1 – 3. סביבת הפצע ולאחר מכן מעברים למצב משתנה עם אינדוקציה מאוחרת יותר של גורמי הצמיחה pro-אנגיוגנטיים ופרו-פיברוטיק, כולל וואפ ו tgf-β22,23,25,26,30.

בעוד המודל ספוג PVA השתלת הוא יתרון עבור לימוד התגובה התאית הסלולר וcy, אחד המגבלות שלה היא חוסר יכולת למדוד את הקצב או מידת הריפוי. המדידה של היבט זה של ריפוי הפצע עשוי להידרש בעת הערכת ההשפעות של תנאי בחינה על היבטים שונים של תגובת הפצע ריפוי30. עבור מדד זה, שיטות המבוססות על ביופסיה מועדפות. כאן, מוצג מודל כריתה של עור הזנב. במודל זה, קטע עובי מלא של עור זנב הוא מגורש מהמשטח האחורי של הזנב. שוב, שמירה על שדה כירורגי סטרילי חשוב כדי להימנע מפני הפצע המיטה. השימוש בסרט ריסוס או כיסוי פצעים אחרים מומלץ גם להימנע מזיהום הפצע מאוחר יותר. עכברים זכרים מבוגרים או זנים אגרסיביים דורשים דיור סולו כדי למנוע הפרעה של הפצע. יתרון מסוים של הזנב כאתר לחקר ריפוי הפצע הוא כי הוא מסתמך יותר על האפיתל מחדש לסגירת, כפי שמתואר על ידי אחרים27,32,33. בנוסף למדידת מיטת הפצע באזור וביצוע ניתוחים היסטלוגיים, אחרים דיווחו על השימוש שלו בהערכת היעילות של התערבויות אקטואלי ב מודוללידירוג תהליכי הריפוי33.

כל אחד מדגמי הפצעים המתוארים בשיטות אלה מציע יתרונות שונים להבנת תהליכי תיקון הפצעים במצב היציב ובנוכחות מצבי-החשיבה. בשל הזמינות הרחבה של זנים ששונו גנטית של עכברים מקוקיים, ניתן גם לטפל בתגובות ריפוי הפצע כדי לענות על שאלות מכניסטיות על התהליך. יתר על כן, מערכות אלה ניתן ליישם מודלים murine של התנאים הקשורים ריפוי הפצע המסכן כולל סוכרת, הזדקנות, זיהום משני, ואחרים30,36,39,40. התובנות המפעיתיות שנרכשו ממחקרים מורחיים עשויים לספק לאחר מכן את הבסיס לחקר ריפוי פצעים במודלים של בעלי חיים גבוהים יותר. יחד, השתלת הספוג pva והעור זנב מודלים הפצע לספק צייתן מערכות רב-תכליתי להבהיר תהליכים ריפוי הפצע במצב יציב מצבים פתולוגיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

המחברים רוצים להודות קווין קרלסון של מתקן האוניברסיטה בראון Cy, מיון המרכז לייעוץ וסיוע עם הזרימה cy, try ניסויים. תמונות באיור 1B ו-C נוצרו עם ביוריאנדר. מודה לקיילה לי ולגרגורי סראפה על הסיוע הצילומי שלהם. עבודה זו היתה נתמכת על ידי מענקים מן הבאים: הגנה מתקדמים פרויקטים מחקר הסוכנות (DARPA) YFAA15 D15AP00100, התחומים של דיקן פרס המדע החדש המתעוררים (אוניברסיטת בראון), ריאות הלב הלאומי ומכון הדם (NHLBI) 1R01HL126887-01A1, המכון הלאומי למדעי הסביבה (החקות) T32-ES7272 (אימון בפתולוגיה סביבתית), ופרס הגרעין האוניברסיטאי למחקר באוניברסיטת בראון.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific BP3991
15 mL centrifuge tubes, Olympus Genesee 28-103
1x HBSS (+Calcium, +Magnesium, –Phenol Red) ThermoFisher Scientific 14025076
5ml Syringe BD 309646
Anti-mouse CD45.2-APC Fire750 BioLegend 109852 Clone 104
Anti-mouse F4/80-eFluor660 ThermoFisher Scientific 50-4801-82 Clone BM8
Anti-mouse Ly6C-FITC BD Biosciences 553104 Clone AL-21
Anti-mouse Ly6G-PerCP-eFluor710 ThermoFisher Scientific 46-9668-82 Clone 1A8-Ly6g
Anti-mouse Siglec-F-APC-R700 BD Biosciences 565183 Clone E50-2440
Autoclip Stainless Steel Wound Clip Applier Braintree Scientific NC9021392
Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9mm Braintree Scientific NC9334081
Blender Bag, 80mL Fisher Scientific 14258201
Culture Tube, 16mL, 17x100 Genesee Scientific 21-130
Fetal Bovine Serum - Standard ThermoFisher Scientific 10437028
Fixable Viability Dye eFluor506 ThermoFisher Scientific 65-0866-14
Hepes Solution, 1M Genesee Scientific 25-534
ImageJ Software NIH
Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15070-063
Polyvinyl alcohol sponge - large pore size Ivalon/PVA Unlimited www.sponge-pva.com
Povidone-iodine solution, 10% Fisher Scientific 3955-16
Spray barrier film, Cavilon 3M 3346E
Stomacher 80 Biomaster, 110V Seward 0080/000/AJ

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gottrup, F., Agren, M. S., Karlsmark, T. Models for use in wound healing research: a survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 8, (2), 83-96 (2000).
  2. Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. A Modeling Conundrum: Murine for Cutaneous Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138, (4), 736-740 (2018).
  3. Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: Mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6, (265), (2014).
  4. Huber-Lang, M., Lambris, J. D., Ward, P. A. Innate immune responses to trauma. Nature Immunology. 19, (4), 327-341 (2018).
  5. Novak, M. L., Koh, T. J. Phenotypic Transitions of Macrophages Orchestrate Tissue Repair. The American Journal of Pathology. 183, (5), 1352-1363 (2013).
  6. Martins-Green, M., Petreaca, M., Wang, L. Chemokines and Their Receptors Are Key Players in the Orchestra That Regulates Wound Healing. Advances in Wound Care. 2, (7), 327-347 (2013).
  7. Guerrero-Juarez, C. F., et al. Single-cell analysis reveals fibroblast heterogeneity and myeloid-derived adipocyte progenitors in murine skin wounds. Nature Communications. 10, (1), 650 (2019).
  8. Shook, B. A., et al. Myofibroblast proliferation and heterogeneity are supported by macrophages during skin repair. Science. 362, (6417), 2971 (2018).
  9. Davidson, J. M., et al. Accelerated wound repair, cell proliferation, and collagen accumulation are produced by a cartilage-derived growth factor. The Journal of Cell Biology. 100, (4), 1219-1227 (1985).
  10. Buckley, A., Davidson, J. M., Kamerath, C. D., Wolt, T. B., Woodward, S. C. Sustained release of epidermal growth factor accelerates wound repair. Proceedings of the National Academy of Sciences. 82, (21), 7340-7344 (1985).
  11. Peterson, J. M., Barbul, A., Breslin, R. J., Wasserkrug, H. L., Efron, G. Significance of T-lymphocytes in wound healing. Surgery. 102, (2), 300-305 (1987).
  12. Efron, J. E., Frankel, H. L., Lazarou, S. A., Wasserkrug, H. L., Barbul, A. Wound healing and T-lymphocytes. Journal of Surgical Research. 48, (5), 460-463 (1990).
  13. Schäffer, M. R., Tantry, U., Thornton, F. J., Barbul, A. Inhibition of nitric oxide synthesis in wounds: pharmacology and effect on accumulation of collagen in wounds in mice. The European Journal of Surgery = Acta Chirurgica. 165, (3), 262-267 (1999).
  14. Opalenik, S. R., Davidson, J. M. Fibroblast differentiation of bone marrow-derived cells during wound repair. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 19, (11), 1561-1563 (2005).
  15. Järveläinen, H., et al. A role for decorin in cutaneous wound healing and angiogenesis. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 14, (4), 443-452 (2006).
  16. Luckett, L. R., Gallucci, R. M. Interleukin-6 (IL-6) modulates migration and matrix metalloproteinase function in dermal fibroblasts from IL-6KO mice. The British Journal of Dermatology. 156, (6), 1163-1171 (2007).
  17. Daniel, T., et al. Regulation of the postburn wound inflammatory response by gammadelta T-cells. Shock. 28, (3), 278-283 (2007).
  18. MacLauchlan, S., et al. Macrophage fusion, giant cell formation, and the foreign body response require matrix metalloproteinase 9. Journal of Leukocyte Biology. 85, (4), 617-626 (2009).
  19. Schwacha, M. G., Thobe, B. M., Daniel, T., Hubbard, W. J. Impact of thermal injury on wound infiltration and the dermal inflammatory response. Journal of Surgical Research. 158, (1), 112-120 (2010).
  20. Ganesh, K., et al. Prostaglandin E2 Induces Oncostatin M Expression in Human Chronic Wound Macrophages through Axl Receptor Tyrosine Kinase Pathway. The Journal of Immunology. 189, (5), 2563-2573 (2012).
  21. Deskins, D. L., et al. Human mesenchymal stromal cells: identifying assays to predict potency for therapeutic selection. Stem Cells Translational Medicine. 2, (2), 151-158 (2013).
  22. Daley, J. M., Brancato, S. K., Thomay, A. A., Reichner, J. S., Albina, J. E. The phenotype of murine wound macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 87, (1), 59-67 (2010).
  23. Thomay, A. A., et al. Disruption of Interleukin-1 Signaling Improves the Quality of Wound Healing. The American Journal of Pathology. 174, (6), 2129-2136 (2009).
  24. Brancato, S. K., et al. Toll-like receptor 4 signaling regulates the acute local inflammatory response to injury and the fibrosis/neovascularization of sterile wounds. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 21, (4), 624-633 (2013).
  25. Daley, J. M., et al. Modulation of macrophage phenotype by soluble product(s) released from neutrophils. Journal of Immunology. 174, (4), 2265-2272 (2005).
  26. Crane, M. J., et al. The monocyte to macrophage transition in the murine sterile wound. PloS One. 9, (1), 86660 (2014).
  27. Falanga, V., et al. Full-thickness wounding of the mouse tail as a model for delayed wound healing: accelerated wound closure in Smad3 knock-out mice. Wound Repair and Regeneration. 12, (3), 320-326 (2004).
  28. Li, J., et al. Molecular mechanisms underlying skeletal growth arrest by cutaneous scarring. Bone. 66, 223-231 (2014).
  29. Zhou, S., et al. A Novel Model for Cutaneous Wound Healing and Scarring in the Rat. Plastic and Reconstructive Surgery. 143, (2), 468-477 (2019).
  30. Crane, M. J., et al. Pulmonary influenza A virus infection leads to suppression of the innate immune response to dermal injury. PLOS Pathogens. 14, (8), 1007212 (2018).
  31. Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research Techniques Made Simple: Animal Models Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138, (10), 2095-2105 (2018).
  32. Rittié, L. Cellular mechanisms of skin repair in humans and other mammals. Journal of Cell Communication and Signaling. 10, (2), 103-120 (2016).
  33. Falanga, V., et al. Autologous Bone Marrow-Derived Cultured Mesenchymal Stem Cells Delivered in a Fibrin Spray Accelerate Healing in Murine and Human Cutaneous Wounds. Tissue Engineering. 13, (6), 1299-1312 (2007).
  34. Lucas, T., et al. Differential Roles of Macrophages in Diverse Phases of Skin Repair. The Journal of Immunology. 184, (7), 3964-3977 (2010).
  35. Wang, J., et al. Visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair. Science. 358, (6359), 111-116 (2017).
  36. Mirza, R. E., Koh, T. J. Contributions of cell subsets to cytokine production during normal and impaired wound healing. Cytokine. 1-4 (2014).
  37. Mirza, R., DiPietro, L. A., Koh, T. J. Selective and Specific Macrophage Ablation Is Detrimental to Wound Healing in Mice. The American Journal of Pathology. 175, (6), 2454-2462 (2010).
  38. DiPietro, L. A., Burdick, M., Low, Q. E., Kunkel, S. L., Strieter, R. M. MIP-1alpha as a critical macrophage chemoattractant in murine wound repair. Journal of Clinical Investigation. 101, (8), 1693-1698 (1998).
  39. Wetzler, C., Kämpfer, H., Stallmeyer, B., Pfeilschifter, J., Frank, S. Large and Sustained Induction of Chemokines during Impaired Wound Healing in the Genetically Diabetic Mouse: Prolonged Persistence of Neutrophils and Macrophages during the Late Phase of Repair. Journal of Investigative Dermatology. 115, (2), 245-253 (2000).
  40. Kim, D. J., Mustoe, T., Clark, R. A. Cutaneous wound healing in aging small mammals: a systematic review. Wound Repair and Regeneration. 23, (3), 318-339 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics