Avaliação da Cicatrização aguda de Feridas utilizando o Implante de Esponja de Álcool Subcutâneo Subcutâneo Dorsal e Modelos de Ferida de Cauda Excisional.

Immunology and Infection

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Summary

Aqui, dois modelos de cicatrização de feridas murinasão são descritos, um projetado para avaliar as respostas de cicatrização celular e citocina e o outro para quantificar a taxa de fechamento da ferida. Esses métodos podem ser usados com modelos de doenças complexas, como o diabetes, para determinar mecanismos de vários aspectos da má cicatrização de feridas.

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Crane, M. J., Henry Jr, W. L., Tran, H. L., Albina, J. E., Jamieson, A. M. Assessment of Acute Wound Healing using the Dorsal Subcutaneous Polyvinyl Alcohol Sponge Implantation and Excisional Tail Skin Wound Models.. J. Vis. Exp. (157), e60653, doi:10.3791/60653 (2020).

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Abstract

A cicatrização de feridas é um processo complexo que requer a progressão ordenada da inflamação, formação de tecido de granulação, fibrose e resolução. Os modelos murine fornecem uma valiosa visão mecanicista sobre esses processos; no entanto, nenhum modelo único aborda totalmente todos os aspectos da resposta de cicatrização de feridas. Em vez disso, é ideal usar vários modelos para abordar os diferentes aspectos da cicatrização de feridas. Aqui, dois métodos diferentes que abordam diversos aspectos da resposta à cicatrização de feridas são descritos. No primeiro modelo, esponjas de álcool polivinil são subcutâneamente implantadas ao longo do dorsum do rato. Após a recuperação da esponja, as células podem ser isoladas por ruptura mecânica, e os fluidos podem ser extraídos por centrifugação, permitindo assim uma caracterização detalhada das respostas celulares e citocinas no ambiente agudo da ferida. Uma limitação desse modelo é a incapacidade de avaliar a taxa de fechamento de feridas. Para isso, utiliza-se um modelo de excisão da pele da cauda. Neste modelo, um pedaço retangular de 10 mm x 3 mm da pele da cauda é excisado ao longo da superfície dorsal, perto da base da cauda. Este modelo pode ser facilmente fotografado para análise planimétrica para determinar as taxas de cura e pode ser extirparado para análise histológica. Ambos os métodos descritos podem ser utilizados em cepas de camundongos geneticamente alteradas, ou em conjunto com modelos de condições comórbidas, como diabetes, envelhecimento ou infecção secundária, a fim de elucidar mecanismos de cicatrização de feridas.

Introduction

Existem muitos sistemas de modelos murine disponíveis para examinar processos de cicatrização de feridas, cada um possuindo vantagens e limitações específicas1,2. Os seguintes métodos apresentam dois modelos de ferida murina, cada um dos quais aborda um aspecto específico da resposta de cicatrização da ferida, e que podem ser usados para identificar a causa e o efeito das perturbações na resposta à lesão. O processo de cicatrização de feridas ocorre em fases distintas. A primeira fase é inflamatória, caracterizada pelo rápido fluxo de plaquetas, neutrófilos e monócitos/macrófagos, bem como pela produção de citocinas proinflamatórias e quimiocinas. Após a resolução da inflamação, o ambiente passa para um estado mais reparador com a indução de citocinas profibroticas e proangiogênicas e fatores de crescimento. O tecido de granulação é depositado e os neovasos se formam com a migração de miofibroblastos, fibroblastos, células epiteliais e células endoteliais. Nos estágios finais, a matriz extracelular provisória é remodelada, e a formação da cicatriz e o fechamento da ferida prosseguem2,3,4,5,6,7,8.

Nenhum modelo de murina único fornece um sistema para estudar todos os estágios de cicatrização de feridas2. Aqui, dois modelos de feridas cirúrgicas são descritos: um elucida respostas agudas de cicatrização celular e citocina, e o outro permite a avaliação do fechamento da ferida, bem como análises histológicas. Esses dois métodos podem ser empregados de forma complementar para avaliar os efeitos de uma perturbação ou comorbidade em diferentes aspectos da resposta à cicatrização de feridas. A implantação subcutânea dorsal de esponjas de álcool polivinilolito (PVA) é um sistema que tem sido usado em modelos de roedores há décadas para elucidar inúmeros aspectos das respostas do tecido celular e de granulação9,,10,,11,,12,,13,,14,15,,16,,17,18,19,20 ,21,,22,,23,,24. Esta abordagem permite a recuperação de fluidos de feridas ricos em citocinas e infiltrações celulares. Neste modelo, 1 cm x 1 cm x 0,5 cm de esponja PVA são colocados em bolsos subcutâneos através de uma incisão de 2 cm feita na linha média dorsal posterior. A incisão é fechada com clipes cirúrgicos, e as esponjas podem ser recuperadas posteriormente para isolamento celular e fluido. O meio celular e citocina de esponjas isoladas reflete os estágios normais de cicatrização aguda da ferida até cerca de 14 dias após a implantação. Em pontos posteriores, o modelo é mais vantajoso para estudar a formação de tecidos de granulação e a resposta do corpo estranho1. Com este sistema, é possível isolar >106 células, o que oferece uma vantagem distinta para ensaios ofotinópicos e funcionais e isolamento de RNA, sobre células isoladas de outros métodos baseados em biópsia1,22,23,25,26.

A taxa de fechamento da ferida é determinada usando o modelo de excisão da pele da cauda. Neste modelo, como descrito inicialmente por Falanga et al. e relatado por outros27,28,29,30, uma seção de espessura total de 1 cm x 0,3 cm da pele da cauda é removida perto da base da cauda. A área da ferida é facilmente visualizada e pode ser medida ao longo do tempo. Alternativamente, o tecido da cauda pode ser isolado para análise histológica. Esta abordagem pode ser usada como uma alternativa ou em conjunto com o método bem estabelecido de biópsia de perfuração dorsal. As principais distinções entre esses dois modelos são a taxa de fechamento da ferida, a presença ou ausência de peles, e a estrutura da pele2,31,32. As feridas da pele da cauda oferecem um prazo mais longo para avaliar o fechamento da ferida, pois leva aproximadamente 21 dias para que ocorra o fechamento total. Isso se opõe às biópsias de socos dorsais não desponadas, que cicatrizam muito mais rápido (~7-10 dias), principalmente por contração devido à ação do carnoso panniculus. As biópsias de perfuração dorsal estaladas curam-se mais lentamente e diminuem os efeitos da cicatrização contífica, mas dependem da presença de um corpo estranho para restringir os mecanismos de contração11,2,,27,,30,,31,33.

Os modelos de feridas descritos são informativos para a compreensão dos processos normais de cicatrização de feridas na ausência de perturbação. Embora a cicatrização da pele de roedor difere de formas muito significativas da pele humana, incluindo estrutura solta, dependência da cura de contrações e outras diferenças anatômicas, o sistema murine oferece certas vantagens para estudos mecanicistas e de triagem. Entre eles está a disponibilidade de cepas de raça e mutantes genéticos, trabilidade genética e menor custo. A percepção mecanicista obtida a partir de estudos de murina pode ser traduzida em modelos animais complexos que imitam mais de perto a cicatrização da pele humana, como o sistema suíno2,31.

Além de examinar as respostas de cicatrização de feridas no estado estável, esses modelos podem ser combinados com condições comórbidas para entender a base de defeitos de cicatrização de feridas no nível celular, citocina e tecido bruto. É neste cenário específico que os dois modelos podem ser utilizados em conjunto para avaliar os efeitos de uma determinada condição comórbida, como pneumonia pós-operatória, tanto na resposta aguda de cicatrização da ferida celular quanto na taxa de fechamento da ferida30.

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Protocol

Todos os estudos em animais descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso De Animais Institucionais da Universidade Brown e realizados de acordo com o Guia de Cuidado e Uso de Animais dos Institutos Nacionais de Saúde.  NOTA: no vídeo, a cortina cirúrgica foi omitida para fins de demonstração.

1. Implantação subcutânea de esponjas PVA

  1. Use uma tesoura para cortar folhas de esponja PVA em pedaços de 8 mm x 8 mm x 4 mm. Reidrate os pedaços de esponja PVA submergindo-os em 1x PBS estéril em um béquer.
  2. Autoclave as esponjas em 1x PBS para esterilizar, e esfriar completamente. Armazene esponjas autoclaved em 1x PBS estéril a 4 °C.
  3. Antes de realizar a implantação cirúrgica, alíquota o número necessário de esponjas em um prato de cultura estéril em condições estéreis em uma capa de fluxo laminar. Guarde as esponjas extras em 1x PBS estéril a 4 °C para uso futuro. Certifique-se de que as esponjas incharam para 1 cm x 1 cm x 0,5 cm após a reidratação. Uma imagem de esponjas PVA desidratadas é mostrada na Figura 1A.
    NOTA: Para manter a esterilidade do local cirúrgico, o procedimento de implantação da esponja PVA requer um indivíduo para manusear o rato e preparar o local cirúrgico, e uma segunda pessoa para realizar a implantação.
  4. Anestesiar um rato C57BL/6J macho de 8-12 semanas de idade por injeção intraperitoneal de 80 mg/kg de cetamina. Administrar 40 mg/kg de xilazina intraperitonealmente para analgesia.  Confirme a profundidade da anestesia pela perda de um reflexo do pedal. Prepare o local cirúrgico removendo o cabelo ao longo do dorso com cortadores. Utilizando gaze estéril, aplique solução de povidone-iodo na área de raspagem 2x, seguida por 70% de etanol.
  5. Coloque o rato em cortinas cirúrgicas estéreis. Coloque uma almofada aquecida abaixo das cortinas cirúrgicas para manter a temperatura do núcleo do mouse.
  6. Use luvas cirúrgicas estéreis para a realização da cirurgia. Puxe a pele dorsal para longe do tecido subjacente com fórceps, e usando uma tesoura cirúrgica estéril, faça uma incisão de 2 cm ao longo da linha média dorsal aproximadamente 2 cm anterior à base da cauda. Enquanto segurar a incisão aberta com fórceps estéreis, use uma tesoura cirúrgica estéril curvada e de ponta cega para formar um bolso subcutâneo ao longo do dorso em uma das posições indicadas na Figura 1B.
  7. Continue a usar fórceps para levantar a pele do tecido subjacente. Usando uma tesoura cirúrgica estéril, aperte suavemente uma esponja PVA no prato de cultura para remover o excesso de PBS. Pegue a esponja PVA por um canto usando uma tesoura cirúrgica estéril e, levando com o canto segurado pela tesoura, coloque a esponja no bolso subcutâneo formado no passo 1.4.
  8. Repita este processo 5x, colocando um total de seis esponjas em bolsos subcutâneos, conforme mostrado na Figura 1B.
  9. Aperte a pele dorsal incisada juntamente com fórceps estéreis e feche a incisão com dois clipes de ferida de aço inoxidável.
  10. Use um novo conjunto de instrumentos cirúrgicos estéreis para cada rato. Alternativamente, use um esterilizador de miolos para esterilizar instrumentos entre ratos.

2. Isolamento de fluidos de esponjas PVA

  1. Para avaliar o meio de citocina aguda da ferida, isole esponjas entre 1 e 14 dias após a implantação.
  2. Prepare um tubo de coleta de fluidos aninhando o barril de uma seringa de 5 mL em um tubo de cultura de 16 mL.
  3. Eutanie um rato com esponjas PVA implantadas por asfixia de CO2 seguida de luxação cervical.
  4. Remova os grampos cirúrgicos e abra a incisão com fórceps dentados. Use uma tesoura para estender a incisão ao longo da linha média dorsal.
  5. Usando fórceps, extraia uma esponja do bolso subcutâneo e transfira-a para o barril de seringa preparado, tendo o cuidado de minimizar a pressão sobre a esponja. Desassociar qualquer tecido conjuntivo que permaneça aderido à superfície da esponja. Use uma tesoura para dissecar a esponja do tecido circundante, se necessário. Repita o processo de remoção da esponja com as esponjas restantes. Coloque o tubo contendo as esponjas no gelo.
  6. Para isolar o fluido da ferida, centrifugar o tubo de cultura contendo a seringa de 5 mL com as esponjas a 700 x g por 10 min.
  7. Após a centrifugação, descarte a seringa e as esponjas. O fluido da ferida será coletado no tubo de cultura de 16 mL. Uma imagem representativa do fluido coletado de uma ferida dia 7 é mostrada na Figura 1D. Transfira o fluido da ferida para um tubo limpo para armazenamento a -80 °C.

3. Isolamento das células das esponjas PVA

  1. Para avaliar o meio celular de cicatrização aguda da ferida, colete esponjas entre 1-14 dias após a implantação da esponja. Esponjas obtidas de uma ferida 7 dias após a implantação são mostradas na Figura 1E.
  2. Preparar o meio de coleta contendo 1x HBSS (+cálcio/+magnésio/-fenol vermelho) suplementado com 1% de FBS, 1% HEPES e 1% de penicilina-estreptomicina.
  3. Alíquota de 5 mL do meio de coleta HBSS em um tubo cônico de 15 mL.
  4. Extrair as esponjas PVA de camundongos eutanizados como descrito em 2.2-2.4. Coloque as esponjas no tubo cônico contendo 5 mL de meio de coleta HBSS.
  5. Transfira as esponjas e o meio de coleta HBSS para um saco de liquidificador de 80 mL derramando. Pendure o saco do liquidificador da escotilha do liquidificador de pás, posicionado de modo que as pás atinjam as esponjas e a mídia. Ajuste as configurações do liquidificador de pás para funcionar em alta por 60 s. Pressione a partida.
  6. Transfira a mídia do saco do liquidificador de volta para o tubo cônico de 15 mL com uma pipeta, deixando as esponjas para trás no saco. Aperte as esponjas para liberar completamente a mídia. Ajuste as configurações do liquidificador de pás para funcionar por 30 s no alto. Adicione 5 mL de mídia ao saco do liquidificador e repita o processo de estômago 2x para um total de três lava-esponjas.
  7. Centrifugar o tubo cônico a 250 x g por 5 min. Uma pelota vermelha de células e glóbulos vermelhos será visível na parte inferior do tubo cônico após a centrifugação.
  8. Descarte o sobrenadante e realize uma lse de glóbulos vermelhos: adicione 900 μL de dH2O à pelota celular e pipeta para misturar. Neutralizar com 100 μL de 10x PBS. Adicione 4 mL de 1x PBS ao tubo para neutralizar totalmente a líse, depois centrífuga a 250 x g por 5 min.
    NOTA: O passo da lyse deve ser breve; Deixar a água em contato com as células para mais de 3-5 s pode resultar em lse de glóbulos não vermelhos.
  9. Após a centrifugação, uma pelota de células brancas contendo células feridas desprovidas de glóbulos vermelhos estará presente na parte inferior do tubo cônico. Descarte o sobrenadante e resuspenda a pelota celular no meio desejado para análises a jusante.

4. Análise opcional de citometria de fluxo de leucócitos inatos isolados de feridas de esponja PVA

  1. Resuspender 0,5-1 x 106 células feridas em 25 μL de uma solução de 2x de anticorpo de bloqueio contendo 10 μg/mL anti-CD16/CD32 FcRγII/III anticorpo diluído em 1x PBS + 1% BSA.
    NOTA: Todos os anticorpos devem ser titulados para determinar concentrações ideais para análise de citometria de fluxo.
  2. Incubar as células com anticorpo de bloqueio por 10 min no gelo.
  3. Faça uma mistura 2x master de anticorpos contendo 2,5 mg/mL de PerCP-eFluor710-Ly6G, 5 mg/mL de FITC-Ly6C, APC-Fire750-CD45.2, APC-R700-Siglec-F e 10 mg/mL de eFluor660-F4-80 diluído em 1x PBS + 1% BSA. Adicione diretamente 25 μL do coquetel de anticorpos às células incubando no anticorpo de bloqueio.
  4. Incubar as células por 20 min no gelo, protegidas da luz.
  5. Lave as células 2x com 1x PBS.
  6. Faça uma mistura mestre de amina-reativa viável viabilidade dye-eFluor506 diluída 1:1.000 em 1x PBS. Resuspenda a pelota celular em 50 μL da solução de tino de viabilidade.
    NOTA: O soro deve ser excluído da etapa de viabilidade fixável, pois evitará a ligação do tintura a proteínas endógenas. Incubar as células por 20 min no gelo, protegidas da luz.
  7. Lave as células 2x com 1x PBS. Resuspenda a pelota celular em 50 μL de 1% de paraformaldeído.
  8. Incubar as células com 1% de paraformaldeído por 15 min no gelo, protegidas da luz.
  9. Lave as células 1x com 1x PBS e resuspenda a pelota em 1x PBS para análise citométrica de fluxo.

5. Excisão da pele da cauda

  1. Anestesiar um rato C57BL/6J macho de 8-12 semanas de idade por injeção intraperitoneal de 80 mg/kg de cetamina. Administrar 40 mg/kg de xilazina intraperitonealmente para analgesia. Confirme a profundidade da anestesia pela perda de um reflexo do pedal.
  2. Prepare o local cirúrgico na cauda do rato anestesiado utilizando gaze estéril para aplicar a solução de povidone-iodo 2x, seguida de uma aplicação de 70% de etanol.
  3. Defina uma seção de 10 mm x 3 mm na superfície dorsal da cauda, 10 mm da base da cauda(Figura 1C)usando um marcador permanente para rastrear a partir de um modelo pré-fabricado.
  4. Coloque o mouse anestesiado em cortinas cirúrgicas estéreis.
  5. Use luvas cirúrgicas estéreis para realizar os procedimentos cirúrgicos. Com uma lâmina de bisturi estéril, faça uma incisão de espessura total ao longo das bordas direita, inferior e esquerda da área da ferida.
  6. Usando fórceps estéreis, retire a pele excisada da cauda e use uma tesoura cirúrgica estéril para cortar a borda superior da área da ferida.
  7. Aplique pressão com gaze estéril para parar o sangramento.
  8. Aplique uma aplicação de barreira de spray no leito da ferida.
  9. Fotografe as feridas de uma distância fixa em intervalos de tempo regulares. Analisar fotografias por análise planimétrica para determinar as medições da área da ferida. Alternativamente, use pinças para obter medidas de comprimento e largura da ferida.

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Representative Results

Resposta inflamatória sistêmica após implantação de esponja PVA
A cirurgia de implantação da esponja PVA gerou uma resposta inflamatória sistêmica, como demonstrado pela indução de IL-6 no plasma 1 dia após a ferida(Figura 2A). Outras citocinas proinflamatórias, incluindo TNF-α e IL-1β, bem como uma série de quimiocinas, incluindo CCL2 e CXCL1, foram induzidas sistemicamente nos primeiros 7 dias após a implantação da esponja PVA, e foram descritas em outros lugares26,30.

Isolamento de células e fluidos de feridas de esponja PVA
A principal vantagem do modelo da ferida da esponja PVA é a capacidade de recuperar células suficientes para análises phenotypic e funcionais da resposta aguda de cicatrização da ferida celular. O número de células que podem ser recuperadas de feridas de esponja PVA aumenta ao longo do tempo, de aproximadamente 2 x 106 células por seis esponjas no dia da ferida 1 x 106 a 8 x 106 células no dia 7 da ferida (Figura 2B). O número de células continua aumentando além do dia 7. Não é recomendável continuar este modelo além de ~14 dias porque as esponjas ficam totalmente encapsuladas pelo colágeno e o sistema transita de modelar uma resposta aguda de cicatrização de feridas para modelar um corpo estranho granuloma1,22,23,25,26. Neutrófilos, monócitos e macrófagos foram o principal infiltrado celular em feridas de esponja PVA. Os neutrófilos predominaram o meio celular da ferida um dia após o ferimento, conforme avaliado pela análise citométrica do fluxo (Figura 2C). Monócitos e macrófagos derivados de monócitos acumularam-se dentro de 3 dias após a implantação da esponja, e as três populações celulares aumentaram em número ao longo do tempo (Figura 2C). Uma estratégia representativa de citometria de fluxo para identificar populações de neutrófilos, monócitos e macrófagos é mostrada na Figura 2D. Após a exclusão de doublets celulares utilizando parâmetros FSC-H e SSC-H(Figura 2D, i e ii),as células inviáveis foram excluídas usando um dóe de viabilidade fixável amina-reativa (mostrado aqui) ou um tine de ácido nucleico (por exemplo, sitox ou iodeto de propidio)(Figura 2D, iii). Os detritos celulares residuais não removidos pelas etapas anteriores de gating foram então excluídos utilizando parâmetros FSC-A e SSC-A(Figura 2D, iv). As células hematopoiéticas constituíram a maioria das células de feridas de esponja PVA e foram identificadas pela expressão CD45 (Figura 2D, v). Os neutrófilos foram identificados como Ly6G+Siglec-F(Figura 2D, vi). As células siglec-F+ eram principalmente eosinófilos(Figura 2D, vii). Gating on Ly6GSiglec-F células, monócitos/macrófagos foram identificados como F4/80+ células(Figura 2D, viii). As células F4/80+ podem ser ainda mais fracionadas pela expressão Ly6C para distinguir os monócitos inflamatórios Ly6Chi (Figura 2D, ix)e macrófagos derivados de monocitosbaixos Ly6C(Figura 2D, x)26.

A capacidade de medir citocinas e outros fatores solúveis da ferida é outra vantagem para o modelo de ferida de esponja PVA. É possível extrair até 100 μL de fluido por esponja. Fluidos extraídos são adequados para uma variedade de ensaios a jusante. A detecção de citocinas e quimiocinas em fluidos de feridas precoces e tardias por ELISA ou imunoensaios multiplex baseados em conta foram relatadas em outros lugares26,30. É possível obter células e fluidos da mesma ferida. Para isso, recomenda-se isolar três esponjas de um lado da linha média dorsal para isolamento celular e 3 esponjas do lado oposto da linha média dorsal para extração de fluidos.

Avaliação do fechamento da ferida usando o modelo de excisão da pele da cauda
O modelo de pele da cauda excisional fornece uma alternativa ao método de biópsia do perfurador de pele dorsal para estudar o fechamento lento da ferida em pele firme sem pele densa. Imagens exemplo de feridas da pele da cauda em 1, 7 e 15 dias após a excisão são mostradas na Figura 3A. O fechamento da ferida pode ser quantificado medindo a área do leito da ferida ao longo do tempo. Nos dias 7 e 15, as áreas de leito de feridas foram de aproximadamente 70% e 35%, respectivamente, da área de ferida do dia 1 (Figura 3B). O fechamento total da ferida exigiu aproximadamente 28 dias. A ferida da pele da cauda também pode ser observada na seção transversal pela análise histológica. A Figura 3C e a Figura 3D mostram imagens representativas das seções transversais da cauda tricocromicamente de H&E e Masson, respectivamente. As margens laterais da pele excisada são indicadas por pontas de flecha na superfície dorsal da cauda.

Figure 1
Figura 1: Esquema de modelos de cicatrização de feridas de murina. (A) Visão lateral (esquerda) e superior (direita) de esponjas PVA desidratadas medindo 8 mm x 8 mm x 0,4 mm.(B)Ilustração de um rato que demonstre a colocação da incisão dorsal midline (linha vermelha central) e seis esponjas de 1 cm x 1 cm x 0,5 cm PVA em bolsos subcutâneos. (C) Esquemático demonstrando o tamanho e a colocação de uma ferida de pele excisional (retângulo vermelho de 10 mm x 3 mm) na superfície dorsal da cauda. (D) Fluido de ferida isolado de três esponjas que foram recuperadas do espaço subcutâneo 7 dias após a implantação. (E) O aparecimento de esponjas recuperadas da ferida 7 dias após a implantação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: A resposta sistêmica e celular à implantação da esponja PVA. (A)Um curso temporal dos níveis de IL-6 no plasma demonstra que a implantação da esponja PVA induziu uma resposta inflamatória sistêmica. A concentração de IL-6 foi medida usando um imunoensaio à base de múltiplas cómpios. (B) O número de células isoladas da ferida das esponjas PVA aumentou ao longo do tempo. (C) Um curso de tempo demonstra o acúmulo de neutrófilos, monócitos e macrófagos derivados de monócitos em feridas de esponja PVA ao longo do tempo. (D) Uma estratégia representativa de gating de células isoladas das feridas da esponja PVA demonstra como identificar subconjuntos de leucócitos por análise citométrica de fluxo. Os portões são definidos da seguinte forma: (i e ii) exclusão de células mortas,(iii)exclusão de células mortas usando um dine de viabilidade amina-reativa fixável, (iv) exclusão de detritos por FSC-A e SSC-A, (v) CD45+ células hematopoiéticas, (vi) Ly6G+ neutrófilos, (vii) Siglec-F+ eosinófilos, (viii) Ly6GSiglec-F F4/80+ monócitos/macrófagos, (ix) F4/80+ Ly6Chi monócitos, e (x) F4/80+Macrófagosbaixos Ly6C. Os portões foram colocados de acordo com os controles de fluorescência-menos um (FMO). Os dados apresentados em AC são a média ± SEM, n = 6-10 ratos por grupo em (A), n = 8-9 ratos em(B), e n = 6-8 ratos em(C). Todos os dados são combinados de 2 a 3 experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Avaliação da cicatrização da ferida da pele da cauda excisional. (A) Fotografias representativas de feridas de pele da cauda excisional tiradas 1, 7 e 15 dias após a lesão. (B)A taxa de fechamento de feridas de pele da cauda excisional. As feridas eram fotografadas dia não. O software de processamento de imagens foi usado para rastrear as margens do leito da ferida e calcular a área da ferida em pontos de tempo indicados. A área da ferida é apresentada como uma fração da área da ferida medida no primeiro dia. Imagens representativas de seções transversais de cauda que foram incorporadas à parafina, seccionadas e manchadas com (C) H&E ou(D) Tricromo de Masson. A ferida foi localizada na superfície dorsal da seção transversal da cauda; as margens da ferida lateral são indicadas por pontas de flecha. Os dados apresentados em (B) são a média ± SEM, n = 8 camundongos por grupo. Os dados são combinados a partir de dois experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Este artigo descreve dois modelos de ferida murina tratável que permitem a avaliação da resposta aguda de cicatrização da ferida. O primeiro método envolve a implantação cirúrgica de esponjas PVA no espaço subcutâneo dorsal. Esta abordagem oferece uma vantagem distinta sobre os modelos de feridas baseadas em biópsia para estudar a resposta de cicatrização de feridas celulares devido ao grande número de células e quantidade de fluidos de ferida obtidos a partir das esponjas isoladas. Para a execução bem sucedida deste procedimento, manter um campo cirúrgico estéril limpando completamente a pele ao redor da incisão é imperativo, pois a translocação de bactérias na ferida alterará significativamente o curso da cicatrização. Usando o método de isolamento celular descrito aqui, é possível isolar pelo menos 1-10 x 106 células das esponjas PVA, dependendo do tempo de extração da esponja. A maioria das células isoladas das feridas da esponja PVA são viáveis (Figura 2D). No entanto, como é possível que as células mortas constituam até ~20% das células isoladas da ferida após a interrupção mecânica, é altamente recomendável usar uma mancha de viabilidade ao prosseguir com análises baseadas em citometria de fluxo. As células isoladas das feridas da esponja PVA são principalmente de origem hematopoiética, conforme determinado pela positividade do CD45 (Figura 2D). O rápido acúmulo de neutrófilos seguidos de monócitos e macrófagos é consistente com os estágios agudos de reparação da ferida3,4,34,35,36,37,38. Células isoladas são adequadas para análises a jusante, incluindo imunofenotipagem, classificação celular, cultivo, extração de RNA e uma variedade de ensaios funcionais.

O modelo de ferida de esponja PVA também permite o isolamento dos fluidos, o que é ideal para avaliar as respostas da citocina e do fator de crescimento no ambiente da ferida aguda. Os fluidos de esponja PVA são adequados para testes por ELISA, imunoensaio multiplex à base de bead, e quantitação de proteínas, entre outros. Estudos anteriores demonstraram através da citocina e da medição do fator de crescimento que o ambiente da ferida precoce é de natureza inflamatória, com indução rápida de IL-6, TNF-α e IL-1β dos dias 1 e 3. O ambiente da ferida passa então para um estado reparador com a posterior indução de fatores de crescimento pro-angiogênicos e pró-fibrosos, incluindo VEGF e TGF-β22,,23,25,26,30.

Embora o modelo de implantação da esponja PVA seja vantajoso para estudar respostas celulares agudas e citocinas, uma de suas limitações é a incapacidade de medir a taxa ou o grau de cicatrização. A medição deste aspecto da cicatrização da ferida pode ser necessária ao avaliar os efeitos de uma condição comórbida em vários aspectos da resposta de cicatrização da ferida30. Para esta métrica, os métodos baseados em biópsia são preferidos. Aqui, o modelo de excisão da pele da cauda é apresentado. Neste modelo, uma seção de espessura total da pele da cauda é excisada da superfície dorsal da cauda. Novamente, manter um campo cirúrgico estéril é importante para evitar a inoculação do leito da ferida. O uso de uma filme de barreira de pulverização ou outra cobertura de feridas também é recomendado para evitar infecção posterior da ferida. Ratos machos mais velhos ou cepas agressivas requerem habitação solo para evitar a interrupção da ferida. Uma vantagem particular da cauda como local para estudar a cicatrização de feridas é que ela depende mais da re-epitelialização para o fechamento, como descrito por outros27,32,33. Além de medir a área do leito da ferida e realizar análises histológicas, outros relataram seu uso na avaliação da eficácia das intervenções tópicas na modulação dos processos de cura33.

Cada um dos modelos de ferida descritos nesses métodos oferecem vantagens distintas para a compreensão dos processos de reparação de feridas em estado estável e na presença de comorbidades. Devido à ampla disponibilidade de cepas geneticamente alteradas de camundongos inatos, também é possível manipular as respostas de cicatrização de feridas para responder a perguntas mecanicistas sobre o processo. Além disso, esses sistemas podem ser implementados em modelos murina de condições associadas à má cicatrização de feridas, incluindo diabetes, envelhecimento, infecção secundária, e outros30,36,39,40. Os insights mecanicistas obtidos a partir de estudos de murina podem, então, fornecer a base para estudar a cicatrização de feridas em modelos animais de ordem superior. Juntos, os modelos de implantação de esponja PVA e de ferida de cauda excisional fornecem sistemas tratáveis e versáteis para elucidar processos de cicatrização de feridas em estado estável e condições patológicas.

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Disclosures

Os autores não têm nada para revelar.

Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer a Kevin Carlson do Brown University Flow Cytometry and Sorting Facility para consulta e assistência com experimentos de citometria de fluxo. As imagens das Figuras 1B e C foram criadas com o BioRender. Kayla Lee e Gregory Serpa são gratos por sua assistência fotográfica. Este trabalho foi apoiado por subsídios da seguinte: Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) YFAA15 D15AP00100, Dean's Areas of Emerging New Science Award (Brown University), National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) 1R01HL126887-01A1, Instituto Nacional de Ciência ambiental (NIES) T32-ES7272 (Treinamento em Patologia Ambiental) e o Prêmio Brown University Research Seed Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific BP3991
15 mL centrifuge tubes, Olympus Genesee 28-103
1x HBSS (+Calcium, +Magnesium, –Phenol Red) ThermoFisher Scientific 14025076
5ml Syringe BD 309646
Anti-mouse CD45.2-APC Fire750 BioLegend 109852 Clone 104
Anti-mouse F4/80-eFluor660 ThermoFisher Scientific 50-4801-82 Clone BM8
Anti-mouse Ly6C-FITC BD Biosciences 553104 Clone AL-21
Anti-mouse Ly6G-PerCP-eFluor710 ThermoFisher Scientific 46-9668-82 Clone 1A8-Ly6g
Anti-mouse Siglec-F-APC-R700 BD Biosciences 565183 Clone E50-2440
Autoclip Stainless Steel Wound Clip Applier Braintree Scientific NC9021392
Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9mm Braintree Scientific NC9334081
Blender Bag, 80mL Fisher Scientific 14258201
Culture Tube, 16mL, 17x100 Genesee Scientific 21-130
Fetal Bovine Serum - Standard ThermoFisher Scientific 10437028
Fixable Viability Dye eFluor506 ThermoFisher Scientific 65-0866-14
Hepes Solution, 1M Genesee Scientific 25-534
ImageJ Software NIH
Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15070-063
Polyvinyl alcohol sponge - large pore size Ivalon/PVA Unlimited www.sponge-pva.com
Povidone-iodine solution, 10% Fisher Scientific 3955-16
Spray barrier film, Cavilon 3M 3346E
Stomacher 80 Biomaster, 110V Seward 0080/000/AJ

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References

  1. Gottrup, F., Agren, M. S., Karlsmark, T. Models for use in wound healing research: a survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 8, (2), 83-96 (2000).
  2. Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. A Modeling Conundrum: Murine for Cutaneous Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138, (4), 736-740 (2018).
  3. Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: Mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6, (265), (2014).
  4. Huber-Lang, M., Lambris, J. D., Ward, P. A. Innate immune responses to trauma. Nature Immunology. 19, (4), 327-341 (2018).
  5. Novak, M. L., Koh, T. J. Phenotypic Transitions of Macrophages Orchestrate Tissue Repair. The American Journal of Pathology. 183, (5), 1352-1363 (2013).
  6. Martins-Green, M., Petreaca, M., Wang, L. Chemokines and Their Receptors Are Key Players in the Orchestra That Regulates Wound Healing. Advances in Wound Care. 2, (7), 327-347 (2013).
  7. Guerrero-Juarez, C. F., et al. Single-cell analysis reveals fibroblast heterogeneity and myeloid-derived adipocyte progenitors in murine skin wounds. Nature Communications. 10, (1), 650 (2019).
  8. Shook, B. A., et al. Myofibroblast proliferation and heterogeneity are supported by macrophages during skin repair. Science. 362, (6417), 2971 (2018).
  9. Davidson, J. M., et al. Accelerated wound repair, cell proliferation, and collagen accumulation are produced by a cartilage-derived growth factor. The Journal of Cell Biology. 100, (4), 1219-1227 (1985).
  10. Buckley, A., Davidson, J. M., Kamerath, C. D., Wolt, T. B., Woodward, S. C. Sustained release of epidermal growth factor accelerates wound repair. Proceedings of the National Academy of Sciences. 82, (21), 7340-7344 (1985).
  11. Peterson, J. M., Barbul, A., Breslin, R. J., Wasserkrug, H. L., Efron, G. Significance of T-lymphocytes in wound healing. Surgery. 102, (2), 300-305 (1987).
  12. Efron, J. E., Frankel, H. L., Lazarou, S. A., Wasserkrug, H. L., Barbul, A. Wound healing and T-lymphocytes. Journal of Surgical Research. 48, (5), 460-463 (1990).
  13. Schäffer, M. R., Tantry, U., Thornton, F. J., Barbul, A. Inhibition of nitric oxide synthesis in wounds: pharmacology and effect on accumulation of collagen in wounds in mice. The European Journal of Surgery = Acta Chirurgica. 165, (3), 262-267 (1999).
  14. Opalenik, S. R., Davidson, J. M. Fibroblast differentiation of bone marrow-derived cells during wound repair. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 19, (11), 1561-1563 (2005).
  15. Järveläinen, H., et al. A role for decorin in cutaneous wound healing and angiogenesis. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 14, (4), 443-452 (2006).
  16. Luckett, L. R., Gallucci, R. M. Interleukin-6 (IL-6) modulates migration and matrix metalloproteinase function in dermal fibroblasts from IL-6KO mice. The British Journal of Dermatology. 156, (6), 1163-1171 (2007).
  17. Daniel, T., et al. Regulation of the postburn wound inflammatory response by gammadelta T-cells. Shock. 28, (3), 278-283 (2007).
  18. MacLauchlan, S., et al. Macrophage fusion, giant cell formation, and the foreign body response require matrix metalloproteinase 9. Journal of Leukocyte Biology. 85, (4), 617-626 (2009).
  19. Schwacha, M. G., Thobe, B. M., Daniel, T., Hubbard, W. J. Impact of thermal injury on wound infiltration and the dermal inflammatory response. Journal of Surgical Research. 158, (1), 112-120 (2010).
  20. Ganesh, K., et al. Prostaglandin E2 Induces Oncostatin M Expression in Human Chronic Wound Macrophages through Axl Receptor Tyrosine Kinase Pathway. The Journal of Immunology. 189, (5), 2563-2573 (2012).
  21. Deskins, D. L., et al. Human mesenchymal stromal cells: identifying assays to predict potency for therapeutic selection. Stem Cells Translational Medicine. 2, (2), 151-158 (2013).
  22. Daley, J. M., Brancato, S. K., Thomay, A. A., Reichner, J. S., Albina, J. E. The phenotype of murine wound macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 87, (1), 59-67 (2010).
  23. Thomay, A. A., et al. Disruption of Interleukin-1 Signaling Improves the Quality of Wound Healing. The American Journal of Pathology. 174, (6), 2129-2136 (2009).
  24. Brancato, S. K., et al. Toll-like receptor 4 signaling regulates the acute local inflammatory response to injury and the fibrosis/neovascularization of sterile wounds. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 21, (4), 624-633 (2013).
  25. Daley, J. M., et al. Modulation of macrophage phenotype by soluble product(s) released from neutrophils. Journal of Immunology. 174, (4), 2265-2272 (2005).
  26. Crane, M. J., et al. The monocyte to macrophage transition in the murine sterile wound. PloS One. 9, (1), 86660 (2014).
  27. Falanga, V., et al. Full-thickness wounding of the mouse tail as a model for delayed wound healing: accelerated wound closure in Smad3 knock-out mice. Wound Repair and Regeneration. 12, (3), 320-326 (2004).
  28. Li, J., et al. Molecular mechanisms underlying skeletal growth arrest by cutaneous scarring. Bone. 66, 223-231 (2014).
  29. Zhou, S., et al. A Novel Model for Cutaneous Wound Healing and Scarring in the Rat. Plastic and Reconstructive Surgery. 143, (2), 468-477 (2019).
  30. Crane, M. J., et al. Pulmonary influenza A virus infection leads to suppression of the innate immune response to dermal injury. PLOS Pathogens. 14, (8), 1007212 (2018).
  31. Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research Techniques Made Simple: Animal Models Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138, (10), 2095-2105 (2018).
  32. Rittié, L. Cellular mechanisms of skin repair in humans and other mammals. Journal of Cell Communication and Signaling. 10, (2), 103-120 (2016).
  33. Falanga, V., et al. Autologous Bone Marrow-Derived Cultured Mesenchymal Stem Cells Delivered in a Fibrin Spray Accelerate Healing in Murine and Human Cutaneous Wounds. Tissue Engineering. 13, (6), 1299-1312 (2007).
  34. Lucas, T., et al. Differential Roles of Macrophages in Diverse Phases of Skin Repair. The Journal of Immunology. 184, (7), 3964-3977 (2010).
  35. Wang, J., et al. Visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair. Science. 358, (6359), 111-116 (2017).
  36. Mirza, R. E., Koh, T. J. Contributions of cell subsets to cytokine production during normal and impaired wound healing. Cytokine. 1-4 (2014).
  37. Mirza, R., DiPietro, L. A., Koh, T. J. Selective and Specific Macrophage Ablation Is Detrimental to Wound Healing in Mice. The American Journal of Pathology. 175, (6), 2454-2462 (2010).
  38. DiPietro, L. A., Burdick, M., Low, Q. E., Kunkel, S. L., Strieter, R. M. MIP-1alpha as a critical macrophage chemoattractant in murine wound repair. Journal of Clinical Investigation. 101, (8), 1693-1698 (1998).
  39. Wetzler, C., Kämpfer, H., Stallmeyer, B., Pfeilschifter, J., Frank, S. Large and Sustained Induction of Chemokines during Impaired Wound Healing in the Genetically Diabetic Mouse: Prolonged Persistence of Neutrophils and Macrophages during the Late Phase of Repair. Journal of Investigative Dermatology. 115, (2), 245-253 (2000).
  40. Kim, D. J., Mustoe, T., Clark, R. A. Cutaneous wound healing in aging small mammals: a systematic review. Wound Repair and Regeneration. 23, (3), 318-339 (2015).

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