Bedömning av akut sårläkning med dorsala subkutan polyvinyl alkohol svamp implantation och excisional svans hud sår modeller.

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Här beskrivs två murine sårläkningsmodeller, en utformad för att bedöma cellulära och cytokin sårläkning svar och den andra för att kvantifiera graden av sår stängning. Dessa metoder kan användas med komplexa sjukdomsmodeller som diabetes för att bestämma mekanismer för olika aspekter av dålig sårläkning.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Crane, M. J., Henry Jr, W. L., Tran, H. L., Albina, J. E., Jamieson, A. M. Assessment of Acute Wound Healing using the Dorsal Subcutaneous Polyvinyl Alcohol Sponge Implantation and Excisional Tail Skin Wound Models.. J. Vis. Exp. (157), e60653, doi:10.3791/60653 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Sårläkning är en komplex process som kräver en ordnad progression av inflammation, granulering vävnadsbildning, fibros, och upplösning. Murine modeller ger värdefull mekanistisk inblick i dessa processer; Ingen enda modell tar dock helt upp alla aspekter av sårläkningssvaret. Istället är det idealiskt att använda flera modeller för att ta itu med de olika aspekterna av sårläkning. Här beskrivs två olika metoder som behandlar olika aspekter av sårläkningssvaret. I den första modellen, polyvinyl alkohol svampar subkutant implanteras längs musen dorsum. Efter svamp hämtning, celler kan isoleras genom mekaniska störningar, och vätskor kan extraheras genom centrifugering, vilket möjliggör en detaljerad karakterisering av cellulära och cytokin svar i den akuta sårmiljön. En begränsning av denna modell är oförmågan att bedöma graden av sår stängning. För detta, en svans hud excision modell används. I denna modell, en 10 mm x 3 mm rektangulär bit svans hud är strukits längs dorsala ytan, nära basen av svansen. Denna modell kan enkelt fotograferas för planimetrisk analys för att bestämma läkningshastigheter och kan strukits för histologiska analys. Båda beskrivna metoder kan användas i genetiskt modifierade mus stammar, eller i samband med modeller av komorbida villkor, såsom diabetes, åldrande, eller sekundär infektion, för att belysa sårläkning mekanismer.

Introduction

Det finns många murine modellsystem tillgängliga för att undersöka sårläkning processer, var och en har särskilda fördelar och begränsningar1,2. Följande metoder presenterar två murine sår modeller, som var och en behandlar en viss aspekt av sårläkning svar, och som kan användas för att identifiera orsaken och effekten av störningar i svaret på skada. Processen för sårläkning sker i olika faser. Den första fasen är inflammatorisk, kännetecknas av den snabba tillströmningen av trombocyter, neutrofiler och monocyter/makrofager, liksom produktionen av proinflammatoriska cytokiner och kemokines. Efter upplösning av inflammation övergår miljön till ett mer reparativ tillstånd med induktion av profibrotic och proangiogenic cytokines och tillväxtfaktorer. Granulering vävnad deponeras och neovessels form med migration av myofibroblasts, fibroblaster, epitelceller och endotelceller. I slutskedet renoveras den provisoriska extracellulära matrisen och ärrbildning och sårnedslutning fortsätter2,,3,4,,5,,6,,7,8.,

Ingen enda murine modell ger ett system för att studera alla stadier av sårläkning2. Här beskrivs två kirurgiska sårmodeller: en belyser akuta cellulära och cytokin sårläkning svar, och den andra möjliggör bedömning av sår stängning samt histologiska analyser. Dessa två metoder kan användas på ett kompletterande sätt för att bedöma effekterna av en störning eller komorbiditet på olika aspekter av sårläkningssvaret. Dorsala subkutan implantation av polyvinylalkohol (PVA) svampar är ett system som har använts i gnagare modeller i årtionden för att belysa många aspekter av cellulära och granulering vävnad svar9,10,11,12,13,14,15,16,17,,18,19,20 ,21,22,23,24. Detta tillvägagångssätt möjliggör hämtning av cytokinrika sårvätskor och cellulära infiltrates. I denna modell placeras 1 cm x 1 cm x 0,5 cm bitar av PVA-svamp i subkutan fickor genom ett 2 cm snitt som görs vid den bakre dorsala mittlinjen. Snittet är stängt med kirurgiska klipp, och svamparna kan hämtas vid senare tidpunkter för cell- och vätskeisolering. Den cellulära och cytokine miljö av isolerade svampar återspeglar de normala stadierna av akut sårläkning upp till ca 14 dagar postimplantation. Vid senare tidpunkter modellen är mer fördelaktigt för att studera granulering vävnadsbildning och främmande kropp svar1. Med detta system är det möjligt att isolera >106 celler, vilket ger en klar fördel för fenotypiska och funktionella analyser och RNA-isolering, över isolerande celler från andra biopsibaserade metoder1,22,23,25,26.

Graden av sår stängning bestäms med hjälp av svansen huden excision modell. I denna modell, som ursprungligen beskrivs av Falanga et al. och rapporteras av andra27,28,29,30, en 1 cm x 0,3 cm full tjocklek del av svansen huden avlägsnas nära basen av svansen. Sårområdet visualiseras enkelt och kan mätas med tiden. Alternativt kan svansvävnad isoleras för histologisk analys. Detta tillvägagångssätt kan användas som ett alternativ till eller tillsammans med den väletablerade dorsala punch biopsi metod. De primära skillnaderna mellan dessa två modeller är graden av sår stängning, förekomsten eller frånvaron av päls, och huden struktur2,31,32. Svanshud sår erbjuder en längre tidsram för att bedöma sår stängning, eftersom det tar cirka 21 dagar för full stängning ske. Detta motsätter sig oskämda dorsala punch tarmbiopsier, som läker mycket snabbare (~ 7-10 dagar), främst genom kontraktion på grund av verkan av panniculus carnosus. Splinted dorsala punch tarmbiopsier läka långsammare och minska effekterna av kontraktila healing, men lita på förekomsten av en främmande kropp för att begränsa kontraktila-baserade mekanismer1,2,27,30,31,33.

De beskrivna sårmodellerna är informativa för att förstå normala sårläkningsprocesser i avsaknad av störning. Medan läkning av gnagare huden skiljer sig på mycket betydande sätt från mänsklig hud, inklusive lös struktur, beroende av kontraktil healing, och andra anatomiska skillnader, murine systemet erbjuder vissa fördelar för mekanistiska och screening studier. Främst bland dessa är tillgången på inavlade stammar och genetiska mutanter, genetisk tractability, och lägre kostnad. Mekanistisk insikt från murine studier kan översättas till komplexa djurmodeller som närmare efterliknar mänsklig hud healing, såsom svin systemet2,31.

Förutom att undersöka sårläkning svar i stabilt tillstånd, dessa modeller kan kombineras med komorbida villkor för att förstå grunden för sårläkning defekter på cellulära, cytokin, och brutto vävnad nivå. Det är i denna inställning som de två modellerna kan användas i samförstånd för att bedöma effekterna av ett visst komorbidt tillstånd, såsom postoperativ lunginflammation, på både den akuta cellulära sårläkning svar och graden av sår stängning30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djurstudier som beskrivs här godkändes av Brown University Institutional Animal Care and Use Committee och genomfördes i enlighet med Guide for the Care and Use of Animals of the National Institutes of Health.  OBS: i videon har den kirurgiska draperiet utelämnats för demonstrationsändamål.

1. Subkutan implantation av PVA svampar

  1. Använd saxen för att skära ark PVA svamp i 8 mm x 8 mm x 4 mm bitar. Rehydrera pva-svampbitarna genom att doppa dem i steril 1x PBS i en bägare.
  2. Autoklav svamparna i 1x PBS för att sterilisera, och svalna helt. Förvara autoklaverade svampar i sterila 1x PBS vid 4 °C.
  3. Innan du utför kirurgisk implantation, aliquot det nödvändiga antalet svampar i en steril kultur skålen under sterila förhållanden i en laminär flöde huva. Förvara de extra svamparna i steril 1x PBS vid 4 °C för framtida bruk. Se till att svamparna sväller till 1 cm x 1 cm x 0,5 cm efter rehydrering. En bild av uttorkade PVA-svampar visas i figur 1A.
    OBS: För att bibehålla steriliteten på operationsstället kräver PVA svampimplantation förfarande en individ att hantera musen och förbereda operationsområdet, och en andra person för att utföra implantationen.
  4. Bedöva en 8-12 veckor gammal hane C57BL/6J mus genom intraperitoneal injektion av 80 mg/kg ketamin. Administrera 40 mg/kg xylazin intraperitonealt för analgesi.  Bekräfta anestesidjupet genom att förlora en pedalreflex. Förbered operationsplatsen genom att ta bort håret längs dorsum med clippers. Använd steril gasväv, applicera povidone-jodlösning på rakområdet 2x, följt av 70% etanol.
  5. Placera musen på sterila kirurgiska draperier. Placera en uppvärmd pad under de kirurgiska draperierna för att bibehålla musens kärntemperatur.
  6. Använd sterila operationshandskar för att utföra operationen. Dra dorsala huden bort från den underliggande vävnaden med pincett, och med hjälp av steril kirurgisk sax, gör en 2 cm snitt längs dorsala mittlinjen cirka 2 cm främre till basen av svansen. När du håller snittet öppet med sterila pincett, använd steril böjd, trubbigt spetsad kirurgisk sax för att bilda en subkutan ficka längs dorsum i en av de positioner som anges i figur 1B.
  7. Fortsätt att använda pincett för att lyfta huden bort från den underliggande vävnaden. Tryck försiktigt på en PVA-svamp i kulturskålen med steril kirurgisk sax för att ta bort överflödig PBS. Plocka upp PVA svampen i ett hörn med steril kirurgisk sax och, som leder med hörnet som innehas av saxen, placera svampen i den subkutana fickan bildas i steg 1.4.
  8. Upprepa denna process 5x och placera totalt sex svampar i subkutan fickor enligt figur 1B.
  9. Nyp ihop den incised dorsala huden med sterila pincett och stäng snittet med två rostfria sårklämmor.
  10. Använd en ny uppsättning sterila kirurgiska instrument för varje mus. Alternativt kan du använda en pärlsterilizer för att sterilisera instrument mellan möss.

2. Isolering av vätskor från PVA svampar

  1. För att bedöma den akuta sårcytokine miljö, isolera svampar mellan 1-14 dagar postimplantation.
  2. Förbered ett vätskeuppsamlingsrör genom att bygga in pipan på en 5 ml-spruta i ett 16 ml-odlingsrör.
  3. Avliva en mus med implanterade PVA svampar av CO2 kvävning följt av livmoderhalscancer störningen.
  4. Ta bort de kirurgiska häftklamrarna och öppna snittet med tandade pincett. Använd sax för att förlänga snittet längs dorsala mittlinjen.
  5. Använd pincett, extrahera en svamp från sin subkutana ficka och överföra den till den förberedda sprutan fat, var noga med att minimera trycket till svampen. Ta avstånd från eventuell bindväv som förblir fäst vid svampens yta. Använd sax för att dissekera svampen från den omgivande vävnaden om det behövs. Upprepa svampborttagningsprocessen med de återstående svamparna. Placera röret som innehåller svamparna på is.
  6. För att isolera sårvätskan, centrifugera kulturröret som innehåller 5 ml-sprutan med svamparna vid 700 x g i 10 min.
  7. Kassera sprutan och svamparna efter centrifugeringen. Sårvätskan kommer att ha samlats i 16 ml-kulturröret. En representativ bild av vätska som samlats in från ett sår dag 7 visas i figur 1D. Överför sårvätskan till ett rent rör för långtidsförvaring vid -80 °C.

3. Isolering av celler från PVA svampar

  1. För att bedöma den akuta sårläkning cellulära miljö, samla svampar mellan 1-14-dagar post-sponge implantation. Svampar som erhållits från ett sår 7 dagar efter implantation visas i figur 1E.
  2. Förbered insamlingsmedium som innehåller 1x HBSS (+kalcium/+magnesium/-fenolröd) kompletterat med 1% FBS, 1% HEPES och 1% penicillin-streptomycin.
  3. Aliquot 5 ml HBSS samlingsmedium i ett koniskt rör på 15 ml.
  4. Extrahera PVA-svamparna från avlivade möss enligt beskrivningen i 2.2–2.4. Placera svamparna i det koniska röret som innehåller 5 ml HBSS-uppsamlingsmedium.
  5. Överför svamparna och HBSS-kollektionen till en 80 ml mixerpåse genom att hälla. Häng mixerpåsen från luckan på paddelmixern, placerad så att paddlarna träffar svamparna och media. Justera inställningarna för paddelmixern för att köras på hög i 60 s. Tryck på start.
  6. Överför mediet från mixerpåsen tillbaka till det koniska röret på 15 ml med en pipett och lämna svamparna kvar i påsen. Krama svamparna för att noggrant släppa mediet. Justera inställningarna för paddelmixern för att köra i 30 s på hög. Tillsätt 5 ml media till mixerpåsen och upprepa magprocessen 2x för totalt tre svamptvättar.
  7. Centrifugera det koniska röret vid 250 x g i 5 min. En röd pellet av celler och röda blodkroppar kommer att synas längst ner i det koniska röret efter centrifugering.
  8. Kasta supernatanten och utför en röd blodcellslys: tillsätt 900 μL dH2O till cellpelleten och pipetten för att blanda. Neutralisera med 100 μl 10x PBS. Tillsätt 4 ml 1x PBS till röret för att helt neutralisera lysen och centrifugera sedan vid 250 x g i 5 min.
    OBS: Lyssteget bör vara kort; om vattnet kommer i kontakt med cellerna i mer än 3–5 år kan det leda till att de icke-röda blodkropparna är lysda.
  9. Efter centrifugering, en vit cell pellet som innehåller sårceller saknar röda blodkroppar kommer att finnas på botten av det koniska röret. Kasta supernatanten och återsuspend cellpellet i önskat medium för nedströms analyser.

4. Valfri flödescytometrianalys av medfödda leukocyter isolerade från PVA svampsår

  1. Resuspend 0,5–1 x 106 sårceller i 25 μL av en 2x lösning av blockerande antikropp som innehåller 10 μg/mL anti-CD16/CD32 FcRγII/III antikropp utspädd i 1x PBS + 1% BSA.
    OBS: Alla antikroppar ska titreras för att bestämma optimala koncentrationer för flödescytometrianalys.
  2. Inkubera cellerna med blockerande antikropp i 10 min på is.
  3. Gör en 2x master blandning av antikroppar som innehåller 2,5 mg/ml perCP-eFluor710-Ly6G, 5 mg/ml FITC-Ly6C, APC-Fire750-CD45.2, APC-R700-Siglec-F och 10 mg/ml eFluor660-F4-80 utspädd i 1x PBS + 1% BSA. Tillsätt direkt 25 μL av antikroppscocktailen till cellerna som ruvar för att blockera antikroppar.
  4. Inkubera cellerna i 20 min på is, skyddad från ljus.
  5. Tvätta cellerna 2x med 1x PBS.
  6. Gör en master blandning av amin-reaktiv fixeringsbar livsdugliga färgämne-eFluor506 utspädd 1:1000 i 1x PBS. Resuspend cell pelleten i 50 μL av lönsamhet färgämne lösning.
    OBS: Serum måste uteslutas från det fastställbara lönsamhetssteget, eftersom det förhindrar bindning av färgämnet till endogena proteiner. Inkubera cellerna i 20 min på is, skyddad från ljus.
  7. Tvätta cellerna 2x med 1x PBS. Resuspend cellletlet i 50 μL av 1% paraformaldehyd.
  8. Inkubera cellerna med 1% paraformaldehyd i 15 min på is, skyddad från ljus.
  9. Tvätta cellerna 1x med 1x PBS och återsuspend pelleten i 1x PBS för flöde cytometrisk analys.

5. Svans hud excision

  1. Bedöva en 8-12 veckor gammal hane C57BL/6J mus genom intraperitoneal injektion av 80 mg/kg ketamin. Administrera 40 mg/kg xylazin intraperitonealt för analgesi. Bekräfta anestesidjupet genom att förlora en pedalreflex.
  2. Förbered operationsplatsen på svansen av den sövda musen genom att använda steril gasväv för att applicera povidone-jodlösning 2x, följt av en applicering av 70% etanol.
  3. Definiera en 10 mm x 3 mm sektion på svansens dorsala yta, 10 mm från svansens botten (figur 1C) med hjälp av en permanent markör för att spåra från en färdig mall.
  4. Placera den sövda musen på sterila kirurgiska draperier.
  5. Använd sterila operationshandskar för att utföra kirurgiska ingrepp. Med ett sterilt skalpelelblad, gör ett full tjockleksnitt längs sårområdets högra, nedre och vänstra kanter.
  6. Med hjälp av sterila pincett, skala den strukna huden bort från svansen, och använd steril kirurgisk sax för att skära bort den övre kanten av sårområdet.
  7. Tryck med steril gasväv för att stoppa blödningen.
  8. Applicera en spraybarriärfilm på sårbädden.
  9. Fotografera såren från ett fast avstånd med jämna mellanrum. Analysera fotografier genom planimetrisk analys för att bestämma sårområdesmätningar. Alternativt kan du använda bromsok för att få sårlängd och breddmätningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Systemisk inflammatorisk respons efter PVA svamp implantation
PVA svamp implantation kirurgi genererade ett systemiskt inflammatoriskt svar, vilket framgår av induktion av IL-6 i plasma 1 dag efter sår (Figur 2A). Andra proinflammatoriska cytokiner inklusive TNF-α och IL-1β, samt en rad chemokines inklusive CCL2 och CXCL1 inducerades systemiskt under de första 7 dagarna efter PVA svamp implantation, och har beskrivits någon annanstans26,30.

Isolering av celler och vätskor från PVA svamp sår
Den främsta fördelen med PVA svamp sår modellen är förmågan att återhämta sig tillräckligt med celler för fenotypiska och funktionella analyser av den akuta cellulära sårläkning svar. Antalet celler som kan återvinnas från PVA svamp sår ökar med tiden, från cirka 2 x 106 celler per sex svampar på sår dag 1 x 106 till 8 x 106 celler på sår dag 7 (Figur 2B). Cellnumret fortsätter att öka efter dag 7. Det rekommenderas inte att fortsätta denna modell utöver ~ 14 dagar eftersom svamparna blir helt inkapslade av kollagen och systemet övergår från modellering en akut sårläkning svar på modellering en främmande kropp granulom1,22,23,25,26. Neutrofiler, monocyter och makrofager var den primära cellulära infiltrera i PVA svamp sår. Neutrofiler dominerade sårcellulär miljö en dag efter sårskada, enligt bedömning av flödescytometrisk analys (figur 2C). Monocyter och monocytbaserade makrofager ackumulerade inom 3 dagar efter svampimplantationen, och de tre cellpopulationerna ökade i antal över tiden (figur 2C). En representativ flödescytometrigtatingstrategi för att identifiera populationer av neutrofilt, monocyter och makrofag visas i figur 2D. Efter att ha uteslutit celldubblett med FSC-H- och SSC-H-parametrar (figur 2D, i och ii) uteslöts icke-viabla celler med hjälp av ett amine-reaktivt fixerbart lönsamhetsfärgämne (visas här) eller ett nukleinsy acid-färgämne (t.ex. sytox eller propidium jodid) (figur 2D, iii). Kvarvarande cellavfall som inte avlägsnats av de föregående gating-stegen uteslöts sedan med parametrarna FSC-A och SSC-A (figur 2D, iv). Hematopoietiska celler utgjorde majoriteten av PVA svamp sårceller och identifierades med CD45 uttryck (Figur 2D, v). Neutrofiler identifierades som Ly6G+Siglec-F(Figur 2D, vi). Siglec-F+ celler var främst eosinofiler (Figur 2D, vii). Gating på Ly6GSiglec-F celler, monocyter/makrofager identifierades som F4/80+ celler (figur 2D, viii). F4/80+ celler kan fraktioneras ytterligare av Ly6C uttryck för att skilja Ly6Chi inflammatoriska monocyter (Figur 2D, ix) och Ly6Clåg monocyt-härledda makrofager (Figur 2D, x)26.

Förmågan att mäta cytokiner och andra sårlösliga faktorer är en annan fördel för PVA svamp sår modell. Det är möjligt att extrahera upp till 100 μl vätska per svamp. Extraherade vätskor är lämpliga för en mängd olika nedströms analyser. Upptäckten av cytokiner och chemokines i tidiga och sena sårvätskor av ELISA eller pärla-baserade multiplex immunoassays har rapporterats någon annanstans26,30. Det är möjligt att få både celler och vätskor från samma sår. För att göra detta rekommenderas att isolera tre svampar från ena sidan av dorsala mittlinjen för cellisolering och 3 svampar från motsatt sida av dorsala mittlinjen för vätskeextraktion.

Bedömning av sårstängning med hjälp av svanshudsexcisionmodellen
Den excisional svans hud modell ger ett alternativ till dorsala huden punch biopsi metod för att studera långsam sår stängning i fast hud saknar tät päls. Exempel bilder av svanshud sår vid 1, 7 och 15 dagar efter excision visas i figur 3A. Sårstängning kan kvantifieras genom att mäta sårbäddens område över tiden. Dag 7 och dag 15 sårbädd områden var cirka 70% och 35%, respektive, av dagen 1 sårområde (Figur 3B). Full sår stängning krävs cirka 28 dagar. Svansen huden såret kunde också observeras i tvärsnitt genom histologiska analys. Figur 3C och figur 3D visar representativa bilder av H&E och Massons trichromefärgade svanstvärsnitt. De laterala marginalerna av den strukna huden indikeras av pilspetsar på svansens dorsala yta.

Figure 1
Figur 1: Schematisk av murin sårläkningsmodeller. (A)Sidovy (vänster) och övre (höger) vy över dehydratiserade PVA-svampar som mäter 8 mm x 8 mm x 0,4 mm.(B)Illustration av en mus som visar placeringen av dorsala mittlinjesnittet (centralröd linje) och sex 1 cm x 1 cm x 0,5 cm PVA-svampar i subkutana fickor. (C)Schematisk som visar storlek och placering av ett excisional hudsår (10 mm x 3 mm röd rektangel) på svansens dorsala yta. (D) Sårvätska isolerad från tre svampar som hämtades från det subkutana utrymmet 7 dagar efter implantation. (E) Utseendet på svampar som hämtats från såret 7 dagar efter implantation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Det systemiska och cellulära svaret på PVA svampimplantation. (A) En tidsförlopp av IL-6 nivåer i plasma visar att PVA svamp implantation inducerade ett systemiskt inflammatoriskt svar. Koncentrationen av IL-6 mättes med hjälp av en multiplex pärla-baserade immunoassay. ( B)Antalet celler som isolerats från PVA svampar sår ökade med tiden. (C)En tidskurs visar ackumulering av neutrofiler, monocyter och monocyt-härledda makrofager i PVA svamp sår över tiden. DD) En representativ gating strategi för celler som isolerats från PVA svamp sår visar hur man identifierar leukocyte delmängder genom flöde cytometrisk analys. Grindar definieras på följande sätt:(i och ii)doublet exclusion,iii)död cell uteslutning med hjälp av en amine-reaktiv fixerbara livsdugliga livsdugliga färgämne,iv)uteslutning av skräp av FSC-A och SSC-A, (v) CD45+ hematopoietiska celler, (vi) Ly6G+ neutrofiler, (vii) Siglec-F+ eosinofiler,viii) Ly6GSiglec-F F4/80+ monocyter/makrofager, (ix) F4/80+ Ly6Chi monocyter, och (x) F4/80+Ly6Clåga makrofager. Utfärda utegångsförbud för förlades enligt fluorescens-minus en (FMO) kontrollerar. De data som visas i AC är medelvärdet ± SEM, n = 6–10 möss per grupp i (A), n = 8–9 möss i( B) och n = 6–8 möss i (C). Alla data kombineras från 2–3 oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Bedömning av excisional svans huden sårläkning. (A)Representativa fotografier av excisional svans hud sår tagna 1, 7 och 15 dagar efter sår. (B)Graden av stängning av excisional svans hudsår. Sår fotograferades varannan dag. Bildbehandling programvara användes för att spåra sårbädden marginaler och beräkna sårområdet vid angivna tidpunkter. Sårområdet presenteras som en bråkdel av sårområdet mätt dag 1. Representativa bilder av svanstvärsnitt som var paraffinin inbäddade, sektionerade och färgade med(C)H&E eller (D) Masson's Trichrome. Såret var beläget på den dorsala ytan av svanstvärsnittet; sårmarginaler indikeras med pilspetsar. De data som visas i (B) är medelvärdet ± SEM, n = 8 möss per grupp. Data kombineras från två oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denna artikel beskriver två tractable murine sår modeller som möjliggör bedömning av den akuta sårläkning svar. Den första metoden innebär kirurgisk implantation av PVA svampar i dorsala subkutan utrymme. Detta tillvägagångssätt erbjuder en klar fördel jämfört med biopsi-baserade sårmodeller för att studera den cellulära sårläkning svar på grund av det stora antalet celler och mängden sårvätskor som erhållits från isolerade svampar. För ett framgångsrikt genomförande av detta förfarande, upprätthålla ett sterilt kirurgiskt fält genom att noggrant rengöra huden runt snittet är absolut nödvändigt, eftersom flyttning av bakterier i såret avsevärt kommer att förändra läkningsförloppet. Med hjälp av cellisoleringsmetoden som beskrivs här är det möjligt att isolera minst 1–10 x 106 celler från PVA-svamparna, beroende på tidpunkten för svamputsugning. Majoriteten av de celler som isolerats från PVA svamp sår är livskraftiga (figur 2D). Men eftersom det är möjligt för döda celler att utgöra upp till ~ 20% av isolerade sårceller efter mekaniska störningar, det rekommenderas starkt att använda en livsduglighet fläck när man fortsätter med flöde cytometri-baserade analyser. Celler som isolerats från PVA svamp sår är främst av hematopoietic ursprung som bestäms av CD45 positivitet (figur 2D). Den snabba ansamling av neutrofiler följt av monocyter och makrofager överensstämmer med de akuta stadierna av sårreparation3,,4,,34,,35,,36,,37,38. Isolerade celler är lämpliga för nedströmsanalyser inklusive immunophenotyping, cellsortering, odling, RNA-extraktion och en mängd olika funktionella analyser.

PVA svamp sår modell möjliggör också isolering av vätskor, som är idealisk för att bedöma cytokin och tillväxtfaktor svar i den akuta sårmiljön. PVA svampvätskor är lämpliga för testning av ELISA, pärla-baserade multipleximmunanalys, och protein kvantation, bland annat. Tidigare studier har genom cytokin- och tillväxtfaktormätning visat att den tidiga sårmiljön är inflammatorisk till sin natur, med snabb induktion av IL-6, TNF-α och IL-1β från dag 1–3. Sårmiljön övergår sedan till ett reparativ tillstånd med senare induktion av pro-angiogenic och pro-fibrotic tillväxtfaktorer, inklusive VEGF och TGF-β22,23,25,26,30.

Medan PVA svamp implantation modellen är fördelaktigt för att studera akut sår cellulära och cytokin svar, en av dess begränsningar är oförmågan att mäta graden eller graden av läkning. Mätning av denna aspekt av sårläkning kan krävas vid bedömningen av effekterna av ett komorbidt tillstånd på olika aspekter av sårläkningssvaret30. För detta mått, biopsi-baserade metoder är att föredra. Här presenteras svanshud excision modellen. I denna modell är en full tjocklek del av svanshud strukits från den dorsala ytan av svansen. Återigen, upprätthålla ett sterilt kirurgiskt fält är viktigt att undvika att inokukulera sårbädden. Användning av en spraybarriärfilm eller annat sårbeläggning rekommenderas också för att undvika senare sårinfektion. Äldre manliga möss eller aggressiva stammar kräver solohölje för att undvika störningar i såret. En särskild fördel med svansen som en plats för att studera sårläkning är att den förlitar sig mer på åter epitelialisering för stängning, som beskrivs av andra27,32,33. Förutom att mäta sårbäddsområdet och utföra histologiska analyser har andra rapporterat dess användning vid bedömningen av effekten av topikala ingrepp vid modulering av läkningsprocesserna33.

Var och en av de sårmodeller som beskrivs i dessa metoder erbjuder tydliga fördelar för att förstå sårreparationsprocesser i stabilt tillstånd och i närvaro av komorbiditeter. På grund av den stora tillgången på genetiskt modifierade stammar av inavlade möss är det också möjligt att manipulera sårläkningssvaren för att svara på mekanistiska frågor om processen. Dessutom kan dessa system genomföras i murine modeller av villkor i samband med dålig sårläkning inklusive diabetes, åldrande, sekundär infektion, och andra30,,36,39,40. De mekanistiska insikter som vunnits från murine studier kan sedan ligga till grund för att studera sårläkning i högre ordning djurmodeller. Tillsammans ger PVA svampimplantation och excisional svans huden sår modeller tractable och mångsidiga system för att belysa sårläkning processer under steady state och patologiska förhållanden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Kevin Carlson från Brown University Flow Cytometry and Sorting Facility för konsultation och hjälp med flödescytometriexperiment. Bilder i figur 1B och C skapades med BioRender. Kayla Lee och Gregory Serpa tackas för deras fotografiska hjälp. Detta arbete stöddes av bidrag från följande: Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) YFAA15 D15AP00100, Dean's Areas of Emerging New Science Award (Brown University), National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) 1R01HL126887-01A1, National Institute of Environmental Science (NIES) T32-ES7272 (Utbildning i miljöpatologi) och Brown University Research Seed Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific BP3991
15 mL centrifuge tubes, Olympus Genesee 28-103
1x HBSS (+Calcium, +Magnesium, –Phenol Red) ThermoFisher Scientific 14025076
5ml Syringe BD 309646
Anti-mouse CD45.2-APC Fire750 BioLegend 109852 Clone 104
Anti-mouse F4/80-eFluor660 ThermoFisher Scientific 50-4801-82 Clone BM8
Anti-mouse Ly6C-FITC BD Biosciences 553104 Clone AL-21
Anti-mouse Ly6G-PerCP-eFluor710 ThermoFisher Scientific 46-9668-82 Clone 1A8-Ly6g
Anti-mouse Siglec-F-APC-R700 BD Biosciences 565183 Clone E50-2440
Autoclip Stainless Steel Wound Clip Applier Braintree Scientific NC9021392
Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9mm Braintree Scientific NC9334081
Blender Bag, 80mL Fisher Scientific 14258201
Culture Tube, 16mL, 17x100 Genesee Scientific 21-130
Fetal Bovine Serum - Standard ThermoFisher Scientific 10437028
Fixable Viability Dye eFluor506 ThermoFisher Scientific 65-0866-14
Hepes Solution, 1M Genesee Scientific 25-534
ImageJ Software NIH
Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15070-063
Polyvinyl alcohol sponge - large pore size Ivalon/PVA Unlimited www.sponge-pva.com
Povidone-iodine solution, 10% Fisher Scientific 3955-16
Spray barrier film, Cavilon 3M 3346E
Stomacher 80 Biomaster, 110V Seward 0080/000/AJ

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gottrup, F., Agren, M. S., Karlsmark, T. Models for use in wound healing research: a survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 8, (2), 83-96 (2000).
  2. Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. A Modeling Conundrum: Murine for Cutaneous Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138, (4), 736-740 (2018).
  3. Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: Mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6, (265), (2014).
  4. Huber-Lang, M., Lambris, J. D., Ward, P. A. Innate immune responses to trauma. Nature Immunology. 19, (4), 327-341 (2018).
  5. Novak, M. L., Koh, T. J. Phenotypic Transitions of Macrophages Orchestrate Tissue Repair. The American Journal of Pathology. 183, (5), 1352-1363 (2013).
  6. Martins-Green, M., Petreaca, M., Wang, L. Chemokines and Their Receptors Are Key Players in the Orchestra That Regulates Wound Healing. Advances in Wound Care. 2, (7), 327-347 (2013).
  7. Guerrero-Juarez, C. F., et al. Single-cell analysis reveals fibroblast heterogeneity and myeloid-derived adipocyte progenitors in murine skin wounds. Nature Communications. 10, (1), 650 (2019).
  8. Shook, B. A., et al. Myofibroblast proliferation and heterogeneity are supported by macrophages during skin repair. Science. 362, (6417), 2971 (2018).
  9. Davidson, J. M., et al. Accelerated wound repair, cell proliferation, and collagen accumulation are produced by a cartilage-derived growth factor. The Journal of Cell Biology. 100, (4), 1219-1227 (1985).
  10. Buckley, A., Davidson, J. M., Kamerath, C. D., Wolt, T. B., Woodward, S. C. Sustained release of epidermal growth factor accelerates wound repair. Proceedings of the National Academy of Sciences. 82, (21), 7340-7344 (1985).
  11. Peterson, J. M., Barbul, A., Breslin, R. J., Wasserkrug, H. L., Efron, G. Significance of T-lymphocytes in wound healing. Surgery. 102, (2), 300-305 (1987).
  12. Efron, J. E., Frankel, H. L., Lazarou, S. A., Wasserkrug, H. L., Barbul, A. Wound healing and T-lymphocytes. Journal of Surgical Research. 48, (5), 460-463 (1990).
  13. Schäffer, M. R., Tantry, U., Thornton, F. J., Barbul, A. Inhibition of nitric oxide synthesis in wounds: pharmacology and effect on accumulation of collagen in wounds in mice. The European Journal of Surgery = Acta Chirurgica. 165, (3), 262-267 (1999).
  14. Opalenik, S. R., Davidson, J. M. Fibroblast differentiation of bone marrow-derived cells during wound repair. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 19, (11), 1561-1563 (2005).
  15. Järveläinen, H., et al. A role for decorin in cutaneous wound healing and angiogenesis. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 14, (4), 443-452 (2006).
  16. Luckett, L. R., Gallucci, R. M. Interleukin-6 (IL-6) modulates migration and matrix metalloproteinase function in dermal fibroblasts from IL-6KO mice. The British Journal of Dermatology. 156, (6), 1163-1171 (2007).
  17. Daniel, T., et al. Regulation of the postburn wound inflammatory response by gammadelta T-cells. Shock. 28, (3), 278-283 (2007).
  18. MacLauchlan, S., et al. Macrophage fusion, giant cell formation, and the foreign body response require matrix metalloproteinase 9. Journal of Leukocyte Biology. 85, (4), 617-626 (2009).
  19. Schwacha, M. G., Thobe, B. M., Daniel, T., Hubbard, W. J. Impact of thermal injury on wound infiltration and the dermal inflammatory response. Journal of Surgical Research. 158, (1), 112-120 (2010).
  20. Ganesh, K., et al. Prostaglandin E2 Induces Oncostatin M Expression in Human Chronic Wound Macrophages through Axl Receptor Tyrosine Kinase Pathway. The Journal of Immunology. 189, (5), 2563-2573 (2012).
  21. Deskins, D. L., et al. Human mesenchymal stromal cells: identifying assays to predict potency for therapeutic selection. Stem Cells Translational Medicine. 2, (2), 151-158 (2013).
  22. Daley, J. M., Brancato, S. K., Thomay, A. A., Reichner, J. S., Albina, J. E. The phenotype of murine wound macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 87, (1), 59-67 (2010).
  23. Thomay, A. A., et al. Disruption of Interleukin-1 Signaling Improves the Quality of Wound Healing. The American Journal of Pathology. 174, (6), 2129-2136 (2009).
  24. Brancato, S. K., et al. Toll-like receptor 4 signaling regulates the acute local inflammatory response to injury and the fibrosis/neovascularization of sterile wounds. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 21, (4), 624-633 (2013).
  25. Daley, J. M., et al. Modulation of macrophage phenotype by soluble product(s) released from neutrophils. Journal of Immunology. 174, (4), 2265-2272 (2005).
  26. Crane, M. J., et al. The monocyte to macrophage transition in the murine sterile wound. PloS One. 9, (1), 86660 (2014).
  27. Falanga, V., et al. Full-thickness wounding of the mouse tail as a model for delayed wound healing: accelerated wound closure in Smad3 knock-out mice. Wound Repair and Regeneration. 12, (3), 320-326 (2004).
  28. Li, J., et al. Molecular mechanisms underlying skeletal growth arrest by cutaneous scarring. Bone. 66, 223-231 (2014).
  29. Zhou, S., et al. A Novel Model for Cutaneous Wound Healing and Scarring in the Rat. Plastic and Reconstructive Surgery. 143, (2), 468-477 (2019).
  30. Crane, M. J., et al. Pulmonary influenza A virus infection leads to suppression of the innate immune response to dermal injury. PLOS Pathogens. 14, (8), 1007212 (2018).
  31. Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research Techniques Made Simple: Animal Models Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138, (10), 2095-2105 (2018).
  32. Rittié, L. Cellular mechanisms of skin repair in humans and other mammals. Journal of Cell Communication and Signaling. 10, (2), 103-120 (2016).
  33. Falanga, V., et al. Autologous Bone Marrow-Derived Cultured Mesenchymal Stem Cells Delivered in a Fibrin Spray Accelerate Healing in Murine and Human Cutaneous Wounds. Tissue Engineering. 13, (6), 1299-1312 (2007).
  34. Lucas, T., et al. Differential Roles of Macrophages in Diverse Phases of Skin Repair. The Journal of Immunology. 184, (7), 3964-3977 (2010).
  35. Wang, J., et al. Visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair. Science. 358, (6359), 111-116 (2017).
  36. Mirza, R. E., Koh, T. J. Contributions of cell subsets to cytokine production during normal and impaired wound healing. Cytokine. 1-4 (2014).
  37. Mirza, R., DiPietro, L. A., Koh, T. J. Selective and Specific Macrophage Ablation Is Detrimental to Wound Healing in Mice. The American Journal of Pathology. 175, (6), 2454-2462 (2010).
  38. DiPietro, L. A., Burdick, M., Low, Q. E., Kunkel, S. L., Strieter, R. M. MIP-1alpha as a critical macrophage chemoattractant in murine wound repair. Journal of Clinical Investigation. 101, (8), 1693-1698 (1998).
  39. Wetzler, C., Kämpfer, H., Stallmeyer, B., Pfeilschifter, J., Frank, S. Large and Sustained Induction of Chemokines during Impaired Wound Healing in the Genetically Diabetic Mouse: Prolonged Persistence of Neutrophils and Macrophages during the Late Phase of Repair. Journal of Investigative Dermatology. 115, (2), 245-253 (2000).
  40. Kim, D. J., Mustoe, T., Clark, R. A. Cutaneous wound healing in aging small mammals: a systematic review. Wound Repair and Regeneration. 23, (3), 318-339 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics