Bewertung der akuten Wundheilung mit den dorsalen subkutanen Polyvinylalkoholschwammimplantation und Exzisional Tail Skin Wound Models.

Immunology and Infection

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Summary

Hier werden zwei murine Wundheilungsmodelle beschrieben, eines zur Beurteilung der zellulären und zytokinen Wundheilungsreaktionen und das andere zur Quantifizierung der Rate des Wundverschlusses. Diese Methoden können mit komplexen Krankheitsmodellen wie Diabetes verwendet werden, um Mechanismen verschiedener Aspekte der schlechten Wundheilung zu bestimmen.

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Crane, M. J., Henry Jr, W. L., Tran, H. L., Albina, J. E., Jamieson, A. M. Assessment of Acute Wound Healing using the Dorsal Subcutaneous Polyvinyl Alcohol Sponge Implantation and Excisional Tail Skin Wound Models.. J. Vis. Exp. (157), e60653, doi:10.3791/60653 (2020).

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Abstract

Wundheilung ist ein komplexer Prozess, der das geordnete Fortschreiten von Entzündungen, Granulationsgewebebildung, Fibrose und Auflösung erfordert. Murine Modelle bieten wertvolle mechanistische Einblicke in diese Prozesse; Kein einziges Modell berücksichtigt jedoch alle Aspekte der Wundheilungsreaktion vollständig. Stattdessen ist es ideal, mehrere Modelle zu verwenden, um die verschiedenen Aspekte der Wundheilung anzusprechen. Hier werden zwei verschiedene Methoden beschrieben, die verschiedene Aspekte der Wundheilungsreaktion behandeln. Im ersten Modell werden Polyvinylalkoholschwämme subkutan entlang des Mausdorsums implantiert. Nach dem Abruf von Schwämmen können Zellen durch mechanische Störungen isoliert werden, und Flüssigkeiten können durch Zentrifugation extrahiert werden, was eine detaillierte Charakterisierung der zellulären und zytokinen Reaktionen in der akuten Wundumgebung ermöglicht. Eine Einschränkung dieses Modells ist die Unfähigkeit, die Rate des Wundverschlusses zu beurteilen. Dazu wird ein Schwanzhautexzisionsmodell verwendet. Bei diesem Modell wird ein 10 mm x 3 mm rechteckiges Stück Schwanzhaut entlang der rückenden Oberfläche, in der Nähe der Basis des Schwanzes, ausgeschnitten. Dieses Modell kann leicht für die planimetrische Analyse fotografiert werden, um Heilungsraten zu bestimmen, und kann für histologische Analysen ausgeschnitten werden. Beide beschriebenen Methoden können in genetisch veränderten Mausstämmen oder in Verbindung mit Modellen von komorbiden Erkrankungen wie Diabetes, Alterung oder Sekundärinfektionen eingesetzt werden, um Wundheilungsmechanismen aufzuklären.

Introduction

Es gibt viele murine Modellsysteme zur Verfügung, um Wundheilungsprozesse zu untersuchen, die jeweils spezifische Vorteile und Einschränkungenbesitzen 1,2. Die folgenden Methoden stellen zwei murine Wundmodelle dar, von denen jedes einen bestimmten Aspekt der Wundheilungsreaktion behandelt und die verwendet werden können, um Ursache und Wirkung von Störungen in der Reaktion auf Verletzungen zu identifizieren. Der Prozess der Wundheilung findet in verschiedenen Phasen statt. Die erste Phase ist entzündlich, gekennzeichnet durch den schnellen Zustrom von Thrombozyten, Neutrophilen und Monozyten/Makrophagen, sowie die Produktion von proinflammatorischen Zytokinen und Chemokinen. Nach der Auflösung der Entzündung übergeht die Umgebung in einen reparativen Zustand mit der Induktion von profibrotischen und proangiogenen Zytokinen und Wachstumsfaktoren. Granulationsgewebe wird abgelagert und Neogefäße bilden sich mit der Migration von Myofibroblasten, Fibroblasten, Epithelzellen und Endothelzellen. In den letzten Stadien wird die provisorische extrazelluläre Matrix umgebaut, und Narbenbildung und Wundverschluss gehenweiter 2,3,4,5,6,7,8.

Kein einziges murines Modell bietet ein System, um alle Stadien der Wundheilung zu studieren2. Hier werden zwei chirurgische Wundmodelle beschrieben: Eines erläutert akute zelluläre und zytokine Wundheilungsreaktionen, das andere ermöglicht die Beurteilung des Wundverschlusses sowie histologische Analysen. Diese beiden Methoden können komplementär eingesetzt werden, um die Auswirkungen einer Störung oder Komorbidität auf verschiedene Aspekte der Wundheilungsreaktion zu bewerten. Die dorsale subkutane Implantation von Polyvinylalkoholschwämmen (PVA) ist ein System, das seit Jahrzehnten in Nagetiermodellen verwendet wird, um zahlreiche Aspekte der zellulären und Granulationsgewebereaktionen9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 ,21,22,23,24. Dieser Ansatz ermöglicht die Rückgewinnung von zytokinreichen Wundflüssigkeiten und zellulären Infiltraten. Bei diesem Modell werden 1 cm x 1 cm x 0,5 cm PVA-Schwammstücke durch einen 2 cm Schnitt an der hinteren dorsalen Mittellinie in subkutane Taschen gelegt. Der Schnitt wird mit chirurgischen Clips geschlossen, und die Schwämme können zu späteren Zeitpunkten für die Zell- und Flüssigkeitsisolierung abgerufen werden. Das zelluläre und zytokinische Milieu isolierter Schwämme spiegelt die normalen Stadien der akuten Wundheilung bis etwa 14 Tage nach der Implantation wider. Zu späteren Zeitpunkten ist das Modell vorteilhafter für die Untersuchung der Granulationsgewebebildung und der Fremdkörperreaktion1. Mit diesem System ist es möglich, >106 Zellen zu isolieren, was einen deutlichen Vorteil für phänotypische und funktionelle Assays und RNA-Isolierung bietet, gegenüber der Isolierung von Zellen von anderen biopsiebasierten Methoden1,22,23,25,26.

Die Rate des Wundverschlusses wird anhand des Schwanzhautexzessionsmodells bestimmt. In diesem Modell, wie ursprünglich von Falanga et al. beschrieben und von anderen berichtet27,28,29,30, wird ein 1 cm x 0,3 cm voller Dicke Abschnitt der Schwanzhaut in der Nähe der Basis des Schwanzes entfernt. Der Wundbereich ist leicht zu visualisieren und kann im Laufe der Zeit gemessen werden. Alternativ kann Schwanzgewebe für die histologische Analyse isoliert werden. Dieser Ansatz kann als Alternative zur oder in Verbindung mit der etablierten Dorsal-Punch-Biopsiemethode verwendet werden. Die primären Unterscheidungen zwischen diesen beiden Modellen sind die Rate des Wundverschlusses, das Vorhandensein oder Fehlen von Fell und die Hautstruktur2,31,32. Schwanzhautwunden bieten einen längeren Zeitrahmen, um den Wundverschluss zu beurteilen, da es etwa 21 Tage dauert, bis eine Vollsperrung auftritt. Dies steht im Gegensatz zu unplinierten dorsalen Punschbiopsien, die viel schneller heilen (ca. 7–10 Tage), vor allem durch Kontraktion aufgrund der Wirkung des Panniculus carnosus. Splinted dorsal Punch Biopsien heilen langsamer und verringern die Auswirkungen der kontraktilen Heilung, aber verlassen Sie sich auf die Anwesenheit eines Fremdkörpers, kontraktile-basierte Mechanismen zu beschränken1,2,27,30,31,33.

Die beschriebenen Wundmodelle sind informativ, um normale Wundheilungsprozesse ohne Störung zu verstehen. Während sich die Heilung der Nagetierhaut in sehr signifikanter Weise von der menschlichen Haut unterscheidet, einschließlich loser Struktur, Abhängigkeit von kontraktiler Heilung und anderen anatomischen Unterschieden, bietet das murine System bestimmte Vorteile für mechanistische und Screening-Studien. Dazu gehören vor allem die Verfügbarkeit von inzuchtierten Stämmen und genetischen Mutanten, genetische Traktionsfähigkeit und niedrigere Kosten. Mechanistische Erkenntnisse aus murinen Studien können in komplexe Tiermodelle übersetzt werden, die die Heilung menschlicher Haut stärker nachahmen, wie das Schweinesystem2,31.

Zusätzlich zur Untersuchung der Wundheilungsreaktionen im stationären Zustand können diese Modelle mit komorbiden Bedingungen kombiniert werden, um die Grundlage von Wundheilungsdefekten auf Zell-, Zytokin- und Bruttogewebeebene zu verstehen. In diesem speziellen Umfeld können die beiden Modelle gemeinsam verwendet werden, um die Auswirkungen einer bestimmten komorbiden Erkrankung, wie z. B. einer postoperativen Lungenentzündung, sowohl auf die akute zelluläre Wundheilungsreaktion als auch auf die Rate des Wundverschlusses30zu bewerten.

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Protocol

Alle hier beschriebenen Tierstudien wurden vom Brown University Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt und in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Tieren der National Institutes of Health durchgeführt.  HINWEIS: Im Video wurde der chirurgische Vorhang zu Demonstrationszwecken weggelassen.

1. Subkutane Implantation von PVA-Schwämmen

  1. Verwenden Sie Scheren, um Blätter aus PVA-Schwamm in 8 mm x 8 mm x 4 mm Stücke zu schneiden. Rehydrieren Sie die Stücke des PVA-Schwamms, indem Sie sie in sterile 1x PBS in einem Becher untertauchen.
  2. Autoclavdiedie Schwämme in 1x PBS zu sterilisieren, und vollständig abkühlen. Autoklavierte Schwämme in sterilen 1x PBS bei 4 °C lagern.
  3. Vor der chirurgischen Implantation, aliquot die notwendige Anzahl von Schwämmen in eine sterile Kulturschale unter sterilen Bedingungen in einer laminaren Strömungshaube. Bewahren Sie die zusätzlichen Schwämme in sterilen 1x PBS bei 4 °C für die zukünftige Verwendung auf. Stellen Sie sicher, dass die Schwämme nach der Rehydrierung auf 1 cm x 1 cm x 0,5 cm anschwellen. Ein Bild von dehydrierten PVA-Schwämmen ist in Abbildung 1Adargestellt.
    HINWEIS: Um die Sterilität der chirurgischen Stelle zu erhalten, erfordert das PVA-Schwammimplantationsverfahren eine Person, um die Maus zu behandeln und die chirurgische Stelle vorzubereiten, und eine zweite Person, um die Implantation durchzuführen.
  4. Anästhetisieren Sie eine 8-12 Wochen alte männliche C57BL/6J Maus durch intraperitoneale Injektion von 80 mg/kg Ketamin. 40 mg/kg Xylazin intraperitoneal zur Analgesie verabreichen.  Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie durch den Verlust eines Pedalreflexes. Bereiten Sie die chirurgische Stelle vor, indem Sie das Haar entlang des Dorsums mit Clippern entfernen. Mit steriler Gaze, Povidon-Jod-Lösung auf den Rasierbereich 2x auftragen, gefolgt von 70% Ethanol.
  5. Legen Sie die Maus auf sterile chirurgische Vorhänge. Legen Sie ein beheiztes Pad unter die chirurgischen Vorhänge, um die Kerntemperatur der Maus zu halten.
  6. Tragen Sie sterile chirurgische Handschuhe für die Durchführung der Operation. Ziehen Sie die dorsale Haut mit Zangen vom darunter liegenden Gewebe weg und machen Sie mit einer sterilen chirurgischen Schere einen 2 cm großen Schnitt entlang der dorsalen Mittellinie ca. 2 cm vordere Richtung zur Basis des Schwanzes. Während Sie den Schnitt mit steriler Zange offen halten, verwenden Sie eine sterile gekrümmte, stumpfe chirurgische Schere, um eine subkutane Tasche entlang des Dorsums in einer der in Abbildung 1Bangegebenen Positionen zu bilden.
  7. Verwenden Sie weiterhin Zangen, um die Haut vom darunter liegenden Gewebe wegzuheben. Mit steriler chirurgischer Schere, drücken Sie vorsichtig einen PVA-Schwamm in der Kulturschale, um überschüssige PBS zu entfernen. Nehmen Sie den PVA-Schwamm um eine Ecke mit einer sterilen chirurgischen Schere und legen Sie den Schwamm mit der Ecke, die von der Schere gehalten wird, in die in Schritt 1.4 gebildete subkutane Tasche.
  8. Wiederholen Sie diesen Vorgang 5x und legen Sie insgesamt sechs Schwämme in subkutane Taschen, wie in Abbildung 1Bdargestellt.
  9. Kneifen Sie die eingeschnittene Rückenhaut mit steriler Zange zusammen und schließen Sie den Schnitt mit zwei Edelstahl-Wundclips.
  10. Verwenden Sie einen neuen Satz steriler chirurgischer Instrumente für jede Maus. Alternativ können Sie einen Perlensterilisator verwenden, um Instrumente zwischen Mäusen zu sterilisieren.

2. Isolierung von Flüssigkeiten aus PVA-Schwämmen

  1. Um das akute Zytokinmilieu zu bewerten, isolieren Sie Schwämme zwischen 1 und 14 Tagen nach der Implantation.
  2. Bereiten Sie ein Flüssigkeitssammelrohr vor, indem Sie den Lauf einer 5 ml Spritze in ein 16 ml Kulturrohr verschachteln.
  3. Euthanisieren Sie eine Maus mit implantierten PVA-Schwämmen durch CO2-Erstickung, gefolgt von zervikaler Dislokation.
  4. Entfernen Sie die chirurgischen Klammern und öffnen Sie den Schnitt mit zahngezahnten Zangen. Verwenden Sie eine Schere, um den Schnitt entlang der dorsalen Mittellinie zu verlängern.
  5. Mit Zangen einen Schwamm aus seiner subkutanen Tasche extrahieren und in den vorbereiteten Spritzenfass geben, wobei darauf geachtet wird, den Druck auf den Schwamm zu minimieren. Entkortieren Sie alle Bindegewebe, das an der Oberfläche des Schwamms haftet. Verwenden Sie eine Schere, um den Schwamm aus dem umgebenden Gewebe zu sezieren, wenn nötig. Wiederholen Sie den Schwammentfernungsprozess mit den restlichen Schwämmen. Legen Sie das Rohr mit den Schwämmen auf Eis.
  6. Um die Wundflüssigkeit zu isolieren, zentrieren Sie das Kulturrohr, das die 5 ml Spritze enthält, mit den Schwämmen bei 700 x g für 10 min.
  7. Nach der Zentrifugation die Spritze und die Schwämme entsorgen. Die Wundflüssigkeit wird sich in der 16 ml Kulturröhre gesammelt haben. Ein repräsentatives Bild der Flüssigkeit, die aus einer Wunde am Tag 7 gesammelt wurde, ist in Abbildung 1Ddargestellt. Übertragen Sie die Wundflüssigkeit zur Langzeitlagerung bei -80 °C in ein Sauberes Rohr.

3. Isolierung von Zellen aus PVA-Schwämmen

  1. Um das akute wundheilende Zellmilieu zu bewerten, sammeln Sie Schwämme zwischen 1–14 Tagen nach der Implantation. Schwämme, die 7 Tage nach der Implantation aus einer Wunde gewonnen wurden, sind in Abbildung 1Edargestellt.
  2. Bereiten Sie Sammelmedium mit 1x HBSS (+Calcium/+Magnesium/-Phenol rot) vor, das mit 1% FBS, 1% HEPES und 1% Penicillin-Streptomycin ergänzt wird.
  3. Aliquot 5 ml HBSS-Sammelmedium in ein 15 ml konisches Rohr.
  4. Extrahieren Sie die PVA-Schwämme von eingeschläferten Mäusen, wie in 2.2–2.4 beschrieben. Legen Sie die Schwämme in das konische Rohr mit 5 ml HBSS-Sammelmedium.
  5. Übertragen Sie die Schwämme und das HBSS-Sammelmedium in einen 80 ml Mixerbeutel durch Gießen. Hängen Sie den Mixerbeutel aus der Luke des Paddelmixers, so dass die Paddel die Schwämme und Medien treffen. Passen Sie die Einstellungen des Paddelmixers so an, dass er 60 s hoch läuft. Drücken Sie den Start.
  6. Übertragen Sie die Medien aus dem Mixerbeutel mit einer Pipette zurück auf das 15 ml konische Rohr und lassen Sie die Schwämme im Beutel zurück. Drücken Sie die Schwämme, um die Medien gründlich freizugeben. Passen Sie die Einstellungen des Paddelmixers so an, dass er 30 s hoch läuft. Fügen Sie 5 ml Medien in den Mixerbeutel und wiederholen Sie den Magenprozess 2x für insgesamt drei Schwammwasachten.
  7. Zentrifugieren Sie das konische Rohr bei 250 x g für 5 min. Ein rotes Pellet aus Zellen und roten Blutkörperchen wird nach der Zentrifugation am Boden des konischen Röhrchens sichtbar sein.
  8. Entsorgen Sie den Überstand und führen Sie eine rote Blutzelllyse durch: Fügen Sie 900 l dH2O in das Zellpellet und die Pipette ein, um sie zu mischen. Neutralisieren Sie mit 100 l mit 10x PBS. Fügen Sie 4 ml 1x PBS in das Rohr, um die Lyse vollständig zu neutralisieren, dann Zentrifuge bei 250 x g für 5 min.
    HINWEIS: Der Lyseschritt sollte kurz sein; Das Wasser mehr als 3-5 s in Kontakt mit den Zellen zu lassen, kann zu einer Lyse nicht-roter Blutkörperchen führen.
  9. Nach der Zentrifugation wird ein weißes Zellpellet mit Wundzellen ohne rote Blutkörperchen am Boden des konischen Röhrchens vorhanden sein. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet im gewünschten Medium für nachgeschaltete Analysen wieder aus.

4. Optionale Durchflusszytometrie-Analyse von angeborenen Leukozyten, die aus PVA-Schwammwunden isoliert sind

  1. 0,5–1 x 106 Wundzellen in 25 l einer 2x-Lösung von blockierendem Antikörper, der 10 g/ml Anti-CD16/CD32 FCR-II/III-Antikörper enthält, in 1x PBS + 1% BSA verdünnt.
    HINWEIS: Alle Antikörper sollten titriert werden, um optimale Konzentrationen für die Durchflusszytometrieanalyse zu bestimmen.
  2. Inkubieren Sie die Zellen mit blockierendem Antikörper für 10 min auf Eis.
  3. Machen Sie einen 2x Master-Mix von Antikörpern, die 2,5 mg/ml PerCP-eFluor710-Ly6G, 5 mg/ml FITC-Ly6C, APC-Fire750-CD45.2, APC-R700-Siglec-F und 10 mg/ml eFluor660-F4-80 in 1x PBS + 1% BSA verdünnt enthalten. Fügen Sie den Zellen, die in blockendem Antikörper brüten, direkt 25 l des Antikörpercocktails hinzu.
  4. Inkubieren Sie die Zellen für 20 min auf Eis, vor Licht geschützt.
  5. Waschen Sie die Zellen 2x mit 1x PBS.
  6. Machen Sie eine Master-Mischung aus amin-reaktive fixierbare Lebensfähigkeit Farbstoff-eFluor506 verdünnt 1:1.000 in 1x PBS. Setzen Sie das Zellpellet in 50 l der Lebensfähigkeitsfarbstofflösung wieder auf.
    HINWEIS: Serum muss von der fixierbaren Lebensfähigkeitsstufe ausgeschlossen werden, da es die Bindung des Farbstoffs an endogene Proteine verhindert. Inkubieren Sie die Zellen für 20 min auf Eis, vor Licht geschützt.
  7. Waschen Sie die Zellen 2x mit 1x PBS. Setzen Sie das Zellpellet in 50 l mit 1% Paraformaldehyd aus.
  8. Inkubieren Sie die Zellen mit 1% Paraformaldehyd für 15 min auf Eis, geschützt vor Licht.
  9. Waschen Sie die Zellen 1x mit 1x PBS und setzen Sie das Pellet in 1x PBS für die zytometrische Durchflussanalyse wieder auf.

5. Schwanzhautexzision

  1. Anästhetisieren Sie eine 8-12 Wochen alte männliche C57BL/6J Maus durch intraperitoneale Injektion von 80 mg/kg Ketamin. 40 mg/kg Xylazin intraperitoneal zur Analgesie verabreichen. Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie durch den Verlust eines Pedalreflexes.
  2. Bereiten Sie die chirurgische Stelle am Schwanz der anästhesierten Maus vor, indem Sie sterile Gaze verwenden, um Povidon-Jod-Lösung 2x aufzutragen, gefolgt von einer Anwendung von 70% Ethanol.
  3. Definieren Sie einen 10 mm x 3 mm Abschnitt auf der dorsalen Oberfläche des Schwanzes, 10 mm von der Basis des Schwanzes (Abbildung 1C) mit einem permanenten Marker, um von einer vorgefertigten Schablone zu verfolgen.
  4. Legen Sie die anästhesierte Maus auf sterile chirurgische Vorhänge.
  5. Tragen Sie sterile chirurgische Handschuhe, um die chirurgischen Eingriffe durchzuführen. Mit einer sterilen Skalpellklinge, machen Sie einen vollen Dicke Schnitt entlang der rechten, unteren und linken Ränder des Wundbereichs.
  6. Mit sterilen Zangen, schälen Sie die ausgeschnittene Haut weg vom Schwanz, und verwenden Sie sterile chirurgische Schere, um den oberen Rand des Wundbereichs zu schneiden.
  7. Drücken Sie mit steriler Gaze, um die Blutung zu stoppen.
  8. Tragen Sie einen Sprühbarrierefilm auf das Wundbett auf.
  9. Fotografieren Sie die Wunden in regelmäßigen Zeitabständen aus einem festen Abstand. Analysieren Sie Fotos durch planimetrische Analyse, um Wundbereichsmessungen zu bestimmen. Alternativ können Sie Sättel verwenden, um Wundlängen- und Breitenmessungen zu erhalten.

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Representative Results

Systemische Entzündungsreaktion nach PVA-Schwammimplantation
Die PVA-Schwammimplantationschirurgie erzeugte eine systemische Entzündungsreaktion, wie die Induktion von IL-6 im Plasma 1 Tag nach der Wundwunde zeigte (Abbildung 2A). Andere proinflammatorische Zytokine, einschließlich TNF-A und IL-1, sowie eine Reihe von Chemokinen einschließlich CCL2 und CXCL1 wurden in den ersten 7 Tagen nach der PVA-Schwammimplantation systemisch induziert und an anderer Stelle beschrieben26,30.

Isolierung von Zellen und Flüssigkeiten aus PVA-Schwammwunden
Der Hauptvorteil des PVA-Schwammwundenmodells ist die Fähigkeit, genügend Zellen für phänotypische und funktionelle Analysen der akuten zellulären Wundheilungsreaktion zurückzugewinnen. Die Anzahl der Zellen, die aus PVA-Schwammwunden zurückgewonnen werden können, steigt im Laufe der Zeit von etwa 2 x 106 Zellen pro sechs Schwämme am Wundtag 1 x 106 bis 8 x 106 Zellen am Wundtag 7 (Abbildung 2B). Die Zellzahl steigt über Tag 7 hinaus weiter an. Es wird nicht empfohlen, dieses Modell über 14 Tage hinaus fortzusetzen, da die Schwämme vollständig durch Kollagen verkapselt werden und das System von der Modellierung einer akuten Wundheilungsreaktion zur Modellierung eines Fremdkörpergranuloms1,22,23,25,26 übergeht. Neutrophile, Monozyten und Makrophagen waren das primäre zelluläre Infiltrat in PVA-Schwammwunden. Neutrophile dominierten das Wundzellmilieu einen Tag nach der Verwundung, wie durch die zytometrische Analyse des Flusses beurteilt wurde (Abbildung 2C). Monozyten und monozytenabgeleitete Makrophagen akkumulierten sich innerhalb von 3 Tagen nach der Schwammimplantation, und die drei Zellpopulationen nahmen im Laufe der Zeit zu (Abbildung 2C). Eine repräsentative Strategie zur Identifizierung von Neutrophilen-, Monozyten- und Makrophagenpopulationen ist in Abbildung 2Ddargestellt. Nach Ausschluss von Zelldoublets mit FSC-H- und SSC-H-Parametern (Abbildung 2D, i und ii) wurden nicht lebensfähige Zellen mit einem amin-reaktiven fixierbaren Lebensfähigkeitsfarbstoff (hier dargestellt) oder einem Nukleinsäurefarbstoff (z. B. Sytox oder Propidiumiodid) ausgeschlossen (Abbildung 2D, iii). Restzellablagerungen, die nicht durch die vorherigen Gating-Schritte entfernt wurden, wurden dann mit FSC-A- und SSC-A-Parametern ausgeschlossen (Abbildung 2D, iv). Hämatopoetische Zellen bestanden aus der Mehrheit der PVA-Schwammwundzellen und wurden durch CD45-Expression identifiziert (Abbildung 2D, v). Neutrophile wurden als Ly6G+Siglec-F– ( Abbildung 2D, vi) identifiziert. Siglec-F+ Zellen waren in erster Linie Eosinophile (Abbildung 2D, vii). Gating auf Ly6GSiglec-F Zellen, Monozyten/Makrophagen wurden als F4/80+ Zellen identifiziert (Abbildung 2D, viii). F4/80+ Zellen könnten weiter durch Ly6C-Expression fraktioniert werden, um Ly6C-hi-entzündliche Monozyten zu unterscheiden (Abbildung 2D, ix) und Ly6C-Low-Monocyte-abgeleitete Makrophagen (Abbildung 2D, x)26. low

Die Fähigkeit, Zytokine und andere wundlösliche Faktoren zu messen, ist ein weiterer Vorteil für das PVA-Schwammwundenmodell. Es ist möglich, bis zu 100 l Flüssigkeit pro Schwamm zu extrahieren. Extrahierte Flüssigkeiten eignen sich für eine Vielzahl von nachgeschalteten Tests. Der Nachweis von Zytokinen und Chemokinen in frühen und späten Wundflüssigkeiten durch ELISA oder perlenbasierte Multiplex-Immunoassays wurde an anderer Stelle berichtet26,30. Es ist möglich, sowohl Zellen als auch Flüssigkeiten aus derselben Wunde zu erhalten. Um dies zu tun, wird empfohlen, drei Schwämme von einer Seite der dorsalen Mittellinie für die Zellisolierung und 3 Schwämme von der gegenüberliegenden Seite der dorsalen Mittellinie für die Flüssigkeitsextraktion zu isolieren.

Beurteilung des Wundverschlusses mit dem Schwanzhautexzisionsmodell
Das exzisionale Schwanzhautmodell bietet eine Alternative zur dorsalen Hautpunschbiopsiemethode, um langsamen Wundverschluss in fester Haut ohne dichtes Fell zu untersuchen. Beispielbilder von Schwanzhautwunden bei 1, 7 und 15 Tagen nach der Exzision sind in Abbildung 3Adargestellt. Der Wundverschluss konnte quantifiziert werden, indem man den Bereich des Wundbettes im Laufe der Zeit misst. Der Tag 7 und Tag 15 Wundbettbereiche waren etwa 70% bzw. 35% des Tages 1 Wundbereich (Abbildung 3B). Der vollständige Wundverschluss benötigte ca. 28 Tage. Die Schwanzhautwunde konnte auch im Querschnitt durch histologische Analyse beobachtet werden. Abbildung 3C und Abbildung 3D zeigen repräsentative Bilder von H&E bzw. Massons Trichrom-befleckten Schwanzquerschnitten. Die seitlichen Ränder der ausgeschnittenen Haut sind durch Pfeilspitzen auf der Rückenfläche des Schwanzes gekennzeichnet.

Figure 1
Abbildung 1: Schematic der murinen Wundheilungsmodelle. (A) Seitenansicht (links) und obere (rechte) Ansicht der dehydrierten PVA-Schwämme von 8 mm x 8 mm x 0,4 mm. (B) Abbildung einer Maus, die die Platzierung des dorsalen Mittellinienschnitts (zentrale rote Linie) und sechs 1 cm x 1 cm x 0,5 cm PVA Schwämme in subkutanen Taschen demonstriert. (C) Schemat, das die Größe und Platzierung einer exzisionalen Hautwunde (10 mm x 3 mm rotes Rechteck) auf der rückenden Oberfläche des Schwanzes demonstriert. (D) Wundflüssigkeit isoliert aus drei Schwämmen, die 7 Tage nach der Implantation aus dem subkutanen Raum entnommen wurden. (E) Das Auftreten von Schwämmen aus der Wunde 7 Tage nach der Implantation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Die systemische und zelluläre Reaktion auf die PVA-Schwammimplantation. (A) Ein Zeitverlauf der IL-6-Spiegel im Plasma zeigt, dass die PVA-Schwammimplantation eine systemische Entzündungsreaktion induzierte. Die Konzentration von IL-6 wurde mit einem Multiplex-Perlen-basierten Immunoassay gemessen. (B) Die Anzahl der Zellen, die aus PVA-Schwämmen gewickelt isoliert im Laufe der Zeit erhöht. (C) Ein Zeitverlauf zeigt die Anhäufung von Neutrophilen, Monozyten und Monozyten-abgeleiteten Makrophagen in PVA-Schwammwunden im Laufe der Zeit. (D) Eine repräsentative Gating-Strategie von Zellen, die aus PVA-Schwammwunden isoliert sind, zeigt, wie Leukozyten-Teilmengen durch zytometrische Flussanalyse identifiziert werden können. Gates sind wie folgt definiert: (i und ii) doublet exclusion, (iii) dead cell exclusion using a ammine-reactive fixable viability dye, (iv) Trümmerausschluss durch FSC-A und SSC-A, (v) CD45+ hämatopoetische Zellen, (vi) Ly6G+ Neutrophile, (vii) Siglec-F+ eosinophils, (viii) Ly6GSiglec-F F4/80+ monocytes/macrophages, (ix) F4/80+ Ly6Chi monocytes, und (x) F4/80+Ly6Cniedrige Makrophagen. Die Tore wurden nach Fluoreszenz-minus-eins (FMO) Kontrollen platziert. Die in AC dargestellten Daten sind der Mittelwert von SEM, n = 6–10 Mäuse pro Gruppe in (A), n = 8–9 Mäuse in (B) und n = 6–8 Mäuse in (C). Alle Daten werden aus 2-3 unabhängigen Experimenten kombiniert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Bewertung der exzisionalen Schwanzhautwundheilung. (A) Repräsentative Fotos von exzisionalen Schwanzhautwunden, die 1, 7 und 15 Tage nach der Verwundung aufgenommen wurden. (B) Die Rate des Verschlusses von exzisionalen Schwanzhautwunden. Wunden wurden jeden zweiten Tag fotografiert. Bildverarbeitungssoftware wurde verwendet, um die Wundbettränder zu verfolgen und die Wundfläche zu angegebenen Zeitpunkten zu berechnen. Die Wundfläche wird als Bruchteil der wundfläche dargestellt, die am ersten Tag gemessen wird. Repräsentative Bilder von Schwanzquerschnitten, die paraffin-eingebettet, geschnitten und mit (C) H&E oder (D) Masson es Trichrome gefärbt wurden. Die Wunde befand sich auf der dorsalen Oberfläche des Schwanzquerschnitts; seitliche Wundränder werden durch Pfeilspitzen angezeigt. Die in (B) angegebenen Daten sind der Mittelwert von SEM, n = 8 Mäuse pro Gruppe. Die Daten werden aus zwei unabhängigen Experimenten kombiniert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Dieser Artikel beschreibt zwei traktierbare murine Wundmodelle, die die Beurteilung der akuten Wundheilungsreaktion ermöglichen. Die erste Methode beinhaltet die chirurgische Implantation von PVA-Schwämmen im dorsalen subkutanen Raum. Dieser Ansatz bietet einen deutlichen Vorteil gegenüber biopsiebasierten Wundmodellen für die Untersuchung der zellulären Wundheilungsreaktion aufgrund der großen Anzahl von Zellen und der Menge an Wundflüssigkeiten, die aus den isolierten Schwämmen gewonnen werden. Für die erfolgreiche Durchführung dieses Verfahrens ist die Aufrechterhaltung eines sterilen Operationsfeldes durch gründliche Reinigung der Haut um den Schnitt unerlässlich, da die Translokation von Bakterien in die Wunde den Heilungsverlauf erheblich verändern wird. Mit der hier beschriebenen Zellisolationsmethode ist es möglich, je nach Zeitpunkt der Schwammextraktion mindestens 1–10 x 106 Zellen aus den PVA-Schwämmen zu isolieren. Die Mehrheit der Zellen, die aus PVA-Schwammwunden isoliert sind, sind lebensfähig (Abbildung 2D). Da es jedoch möglich ist, dass abgestorbene Zellen nach mechanischer Störung bis zu 20 % der isolierten Wundzellen bilden können, wird dringend empfohlen, einen Lebensfähigkeitsfleck zu verwenden, wenn sie mit Strömungszytometrie-basierten Analysen fortfahren. Zellen, die aus PVA-Schwammwunden isoliert sind, sind in erster Linie hämatopoetischen Ursprungs, wie durch CD45 Positivität bestimmt (Abbildung 2D). Die schnelle Anhäufung von Neutrophilen gefolgt von Monozyten und Makrophagen ist konsistent mit den akuten Stadien der Wundreparatur3,4,34,35,36,37,38. Isolierte Zellen eignen sich für nachgeschaltete Analysen, einschließlich Immunophenotypisierung, Zellsortierung, Kultivierung, RNA-Extraktion und einer Vielzahl von funktionellen Assays.

Das PVA-Schwammwundenmodell ermöglicht auch die Isolierung von Flüssigkeiten, was ideal für die Beurteilung von Zytokin- und Wachstumsfaktorreaktionen in der akuten Wundumgebung ist. PVA-Schwammflüssigkeiten eignen sich unter anderem für Tests mit ELISA, adenbasiertem Multiplex-Immunoassay und Proteinquantitation. Frühere Studien haben durch Zytokin- und Wachstumsfaktormessung gezeigt, dass die frühe Wundumgebung in der Natur entzündlich ist, mit einer schnellen Induktion von IL-6, TNF-, und IL-1" ab den Tagen 1–3. Die Wundumgebung übergeht dann in einen reparativen Zustand mit der späteren Induktion von pro-angiogenen und profibrotischen Wachstumsfaktoren, einschließlich VEGF und TGF-2222,23,25,26,30.

Während das PVA-Schwammimplantationsmodell vorteilhaft für die Untersuchung akuter Wundzell- und Zytokinreaktionen ist, ist eine seiner Einschränkungen die Unfähigkeit, die Rate oder den Grad der Heilung zu messen. Die Messung dieses Aspekts der Wundheilung kann erforderlich sein, wenn die Auswirkungen einer komorbiden Erkrankung auf verschiedene Aspekte der Wundheilungsreaktion30bewertet werden. Für diese Metrik werden biopsiebasierte Methoden bevorzugt. Hier wird das Schwanzhautexzisionsmodell vorgestellt. In diesem Modell wird ein vollständiger Dickenabschnitt der Schwanzhaut von der dorsalen Oberfläche des Schwanzes entfernt. Auch hier ist die Aufrechterhaltung eines sterilen Operationsfeldes wichtig, um eine Impfung des Wundbettes zu vermeiden. Die Verwendung eines Sprühbarrierefilms oder einer anderen Wundbedeckung wird ebenfalls empfohlen, um eine spätere Wundinfektion zu vermeiden. Ältere männliche Mäuse oder aggressive Stämme benötigen Solo-Gehäuse, um eine Störung der Wunde zu vermeiden. Ein besonderer Vorteil des Schwanzes als Ort für das Studium der Wundheilung ist, dass er mehr auf Reepithelisierung für Verschluss angewiesen ist, wie von anderenbeschrieben 27,32,33. Neben der Messung des Wundbettbereichs und der Durchführung histologischer Analysen haben andere berichtet, dass sie bei der Beurteilung der Wirksamkeit topischer Interventionen bei der Modulation der Heilungsprozesse33verwendet werden.

Jedes der in diesen Methoden beschriebenen Wundmodelle bietet deutliche Vorteile für das Verständnis von Wundreparaturprozessen im stationären Zustand und in Gegenwart von Komorbiditäten. Aufgrund der breiten Verfügbarkeit genetisch veränderter Stämme von inzuchten Mäusen ist es auch möglich, die Wundheilungsreaktionen zu manipulieren, um mechanistische Fragen über den Prozess zu beantworten. Darüber hinaus können diese Systeme in murinen Modellen von Erkrankungen im Zusammenhang mit schlechter Wundheilung einschließlich Diabetes, Alterung, sekundäre Infektion, und andere30,36,39,40implementiert werden. Die mechanistischen Erkenntnisse aus murinen Studien können dann die Grundlage für das Studium der Wundheilung in höherwertigen Tiermodellen bilden. Zusammen bieten die PVA-Schwammimplantations- und exzisionalen Schwanzhautwundmodelle begehbare und vielseitige Systeme zur Aufklärung von Wundheilungsprozessen unter stationären und pathologischen Bedingungen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Die Autoren danken Kevin Carlson von der Brown University Flow Cytometry and Sorting Facility für die Beratung und Unterstützung bei Flow Cytometry-Experimenten. Bilder in Abbildung 1B und C wurden mit BioRender erstellt. Kayla Lee und Gregory Serpa wird für ihre fotografische Unterstützung gedankt. Diese Arbeit wurde durch Stipendien von folgenden unterstützt: Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) YFAA15 D15AP00100, Dean es Areas of Emerging New Science Award (Brown University), National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) 1R01HL126887-01A1, National Institute of Environmental Science (NIES) T32-ES7272 (Training in Environmental Pathology) und der Brown University Research Seed Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific BP3991
15 mL centrifuge tubes, Olympus Genesee 28-103
1x HBSS (+Calcium, +Magnesium, –Phenol Red) ThermoFisher Scientific 14025076
5ml Syringe BD 309646
Anti-mouse CD45.2-APC Fire750 BioLegend 109852 Clone 104
Anti-mouse F4/80-eFluor660 ThermoFisher Scientific 50-4801-82 Clone BM8
Anti-mouse Ly6C-FITC BD Biosciences 553104 Clone AL-21
Anti-mouse Ly6G-PerCP-eFluor710 ThermoFisher Scientific 46-9668-82 Clone 1A8-Ly6g
Anti-mouse Siglec-F-APC-R700 BD Biosciences 565183 Clone E50-2440
Autoclip Stainless Steel Wound Clip Applier Braintree Scientific NC9021392
Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9mm Braintree Scientific NC9334081
Blender Bag, 80mL Fisher Scientific 14258201
Culture Tube, 16mL, 17x100 Genesee Scientific 21-130
Fetal Bovine Serum - Standard ThermoFisher Scientific 10437028
Fixable Viability Dye eFluor506 ThermoFisher Scientific 65-0866-14
Hepes Solution, 1M Genesee Scientific 25-534
ImageJ Software NIH
Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15070-063
Polyvinyl alcohol sponge - large pore size Ivalon/PVA Unlimited www.sponge-pva.com
Povidone-iodine solution, 10% Fisher Scientific 3955-16
Spray barrier film, Cavilon 3M 3346E
Stomacher 80 Biomaster, 110V Seward 0080/000/AJ

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References

  1. Gottrup, F., Agren, M. S., Karlsmark, T. Models for use in wound healing research: a survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 8, (2), 83-96 (2000).
  2. Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. A Modeling Conundrum: Murine for Cutaneous Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138, (4), 736-740 (2018).
  3. Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: Mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6, (265), (2014).
  4. Huber-Lang, M., Lambris, J. D., Ward, P. A. Innate immune responses to trauma. Nature Immunology. 19, (4), 327-341 (2018).
  5. Novak, M. L., Koh, T. J. Phenotypic Transitions of Macrophages Orchestrate Tissue Repair. The American Journal of Pathology. 183, (5), 1352-1363 (2013).
  6. Martins-Green, M., Petreaca, M., Wang, L. Chemokines and Their Receptors Are Key Players in the Orchestra That Regulates Wound Healing. Advances in Wound Care. 2, (7), 327-347 (2013).
  7. Guerrero-Juarez, C. F., et al. Single-cell analysis reveals fibroblast heterogeneity and myeloid-derived adipocyte progenitors in murine skin wounds. Nature Communications. 10, (1), 650 (2019).
  8. Shook, B. A., et al. Myofibroblast proliferation and heterogeneity are supported by macrophages during skin repair. Science. 362, (6417), 2971 (2018).
  9. Davidson, J. M., et al. Accelerated wound repair, cell proliferation, and collagen accumulation are produced by a cartilage-derived growth factor. The Journal of Cell Biology. 100, (4), 1219-1227 (1985).
  10. Buckley, A., Davidson, J. M., Kamerath, C. D., Wolt, T. B., Woodward, S. C. Sustained release of epidermal growth factor accelerates wound repair. Proceedings of the National Academy of Sciences. 82, (21), 7340-7344 (1985).
  11. Peterson, J. M., Barbul, A., Breslin, R. J., Wasserkrug, H. L., Efron, G. Significance of T-lymphocytes in wound healing. Surgery. 102, (2), 300-305 (1987).
  12. Efron, J. E., Frankel, H. L., Lazarou, S. A., Wasserkrug, H. L., Barbul, A. Wound healing and T-lymphocytes. Journal of Surgical Research. 48, (5), 460-463 (1990).
  13. Schäffer, M. R., Tantry, U., Thornton, F. J., Barbul, A. Inhibition of nitric oxide synthesis in wounds: pharmacology and effect on accumulation of collagen in wounds in mice. The European Journal of Surgery = Acta Chirurgica. 165, (3), 262-267 (1999).
  14. Opalenik, S. R., Davidson, J. M. Fibroblast differentiation of bone marrow-derived cells during wound repair. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 19, (11), 1561-1563 (2005).
  15. Järveläinen, H., et al. A role for decorin in cutaneous wound healing and angiogenesis. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 14, (4), 443-452 (2006).
  16. Luckett, L. R., Gallucci, R. M. Interleukin-6 (IL-6) modulates migration and matrix metalloproteinase function in dermal fibroblasts from IL-6KO mice. The British Journal of Dermatology. 156, (6), 1163-1171 (2007).
  17. Daniel, T., et al. Regulation of the postburn wound inflammatory response by gammadelta T-cells. Shock. 28, (3), 278-283 (2007).
  18. MacLauchlan, S., et al. Macrophage fusion, giant cell formation, and the foreign body response require matrix metalloproteinase 9. Journal of Leukocyte Biology. 85, (4), 617-626 (2009).
  19. Schwacha, M. G., Thobe, B. M., Daniel, T., Hubbard, W. J. Impact of thermal injury on wound infiltration and the dermal inflammatory response. Journal of Surgical Research. 158, (1), 112-120 (2010).
  20. Ganesh, K., et al. Prostaglandin E2 Induces Oncostatin M Expression in Human Chronic Wound Macrophages through Axl Receptor Tyrosine Kinase Pathway. The Journal of Immunology. 189, (5), 2563-2573 (2012).
  21. Deskins, D. L., et al. Human mesenchymal stromal cells: identifying assays to predict potency for therapeutic selection. Stem Cells Translational Medicine. 2, (2), 151-158 (2013).
  22. Daley, J. M., Brancato, S. K., Thomay, A. A., Reichner, J. S., Albina, J. E. The phenotype of murine wound macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 87, (1), 59-67 (2010).
  23. Thomay, A. A., et al. Disruption of Interleukin-1 Signaling Improves the Quality of Wound Healing. The American Journal of Pathology. 174, (6), 2129-2136 (2009).
  24. Brancato, S. K., et al. Toll-like receptor 4 signaling regulates the acute local inflammatory response to injury and the fibrosis/neovascularization of sterile wounds. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 21, (4), 624-633 (2013).
  25. Daley, J. M., et al. Modulation of macrophage phenotype by soluble product(s) released from neutrophils. Journal of Immunology. 174, (4), 2265-2272 (2005).
  26. Crane, M. J., et al. The monocyte to macrophage transition in the murine sterile wound. PloS One. 9, (1), 86660 (2014).
  27. Falanga, V., et al. Full-thickness wounding of the mouse tail as a model for delayed wound healing: accelerated wound closure in Smad3 knock-out mice. Wound Repair and Regeneration. 12, (3), 320-326 (2004).
  28. Li, J., et al. Molecular mechanisms underlying skeletal growth arrest by cutaneous scarring. Bone. 66, 223-231 (2014).
  29. Zhou, S., et al. A Novel Model for Cutaneous Wound Healing and Scarring in the Rat. Plastic and Reconstructive Surgery. 143, (2), 468-477 (2019).
  30. Crane, M. J., et al. Pulmonary influenza A virus infection leads to suppression of the innate immune response to dermal injury. PLOS Pathogens. 14, (8), 1007212 (2018).
  31. Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research Techniques Made Simple: Animal Models Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138, (10), 2095-2105 (2018).
  32. Rittié, L. Cellular mechanisms of skin repair in humans and other mammals. Journal of Cell Communication and Signaling. 10, (2), 103-120 (2016).
  33. Falanga, V., et al. Autologous Bone Marrow-Derived Cultured Mesenchymal Stem Cells Delivered in a Fibrin Spray Accelerate Healing in Murine and Human Cutaneous Wounds. Tissue Engineering. 13, (6), 1299-1312 (2007).
  34. Lucas, T., et al. Differential Roles of Macrophages in Diverse Phases of Skin Repair. The Journal of Immunology. 184, (7), 3964-3977 (2010).
  35. Wang, J., et al. Visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair. Science. 358, (6359), 111-116 (2017).
  36. Mirza, R. E., Koh, T. J. Contributions of cell subsets to cytokine production during normal and impaired wound healing. Cytokine. 1-4 (2014).
  37. Mirza, R., DiPietro, L. A., Koh, T. J. Selective and Specific Macrophage Ablation Is Detrimental to Wound Healing in Mice. The American Journal of Pathology. 175, (6), 2454-2462 (2010).
  38. DiPietro, L. A., Burdick, M., Low, Q. E., Kunkel, S. L., Strieter, R. M. MIP-1alpha as a critical macrophage chemoattractant in murine wound repair. Journal of Clinical Investigation. 101, (8), 1693-1698 (1998).
  39. Wetzler, C., Kämpfer, H., Stallmeyer, B., Pfeilschifter, J., Frank, S. Large and Sustained Induction of Chemokines during Impaired Wound Healing in the Genetically Diabetic Mouse: Prolonged Persistence of Neutrophils and Macrophages during the Late Phase of Repair. Journal of Investigative Dermatology. 115, (2), 245-253 (2000).
  40. Kim, D. J., Mustoe, T., Clark, R. A. Cutaneous wound healing in aging small mammals: a systematic review. Wound Repair and Regeneration. 23, (3), 318-339 (2015).

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