Vurdering af akut sårheling ved hjælp af Dorsale subkutane Polyvinyl Alkohol Sponge Implantation og Excisional Tail Hud Sår Modeller.

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her er to murine sårhelingsmodeller beskrevet, den ene designet til at vurdere cellulære og cytokinsårhelingsreaktioner og den anden til at kvantificere hastigheden af sårlukning. Disse metoder kan bruges med komplekse sygdomsmodeller såsom diabetes til at bestemme mekanismer i forskellige aspekter af dårlig sårheling.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Crane, M. J., Henry Jr, W. L., Tran, H. L., Albina, J. E., Jamieson, A. M. Assessment of Acute Wound Healing using the Dorsal Subcutaneous Polyvinyl Alcohol Sponge Implantation and Excisional Tail Skin Wound Models.. J. Vis. Exp. (157), e60653, doi:10.3791/60653 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Sårheling er en kompleks proces, der kræver en velordnet progression af inflammation, granulering væv dannelse, fibrose, og opløsning. Murine modeller giver værdifuld mekanistisk indsigt i disse processer; men ingen enkelt model fuldt ud omhandler alle aspekter af sårheling svar. I stedet er det ideelt at bruge flere modeller til at løse de forskellige aspekter af sårheling. Her er to forskellige metoder, der omhandler forskellige aspekter af sårheling svar beskrevet. I den første model, er polyvinyl alkohol svampe subkutant implanteret langs musen dorsum. Efter svamp hentning, celler kan isoleres ved mekanisk forstyrrelse, og væsker kan udvindes ved centrifugering, hvilket giver mulighed for en detaljeret karakterisering af cellulære og cytokin reaktioner i det akutte sår miljø. En begrænsning af denne model er den manglende evne til at vurdere antallet af sårlukning. Til dette, en hale hud excision model udnyttes. I denne model, en 10 mm x 3 mm rektangulære stykke hale hud er fjernet langs rygoverfladen, nær bunden af halen. Denne model kan let fotograferes til planimetrisk analyse for at bestemme helbredende satser og kan fjernes for histologisk analyse. Begge beskrevne metoder kan anvendes i genetisk ændrede musestammer, eller i forbindelse med modeller af comorbide tilstande, såsom diabetes, aldring, eller sekundær infektion, med henblik på at belyse sårheling mekanismer.

Introduction

Der er mange murine model systemer til rådighed til at undersøge sårheling processer, hver besidder specifikke fordele og begrænsninger1,2. Følgende metoder præsenterer to murine sår modeller, som hver især omhandler et bestemt aspekt af sårheling svar, og som kan bruges til at identificere årsag og virkning af forstyrrelser i reaktionen på skade. Processen med sårheling forekommer i forskellige faser. Den første fase er inflammatorisk, karakteriseret ved den hurtige tilstrømning af blodplader, neutrofiler, og monocytter / makrofager, samt produktion af proinflammatoriske cytokiner og chemokiner. Efter opløsning af inflammation, miljøet overgange til en mere reparativ tilstand med induktion af profibrotiske og proangiogenic cytokiner og vækstfaktorer. Granuleringvæv deponeres og neofartøjer dannes med migration af myofibroblaster, fibroblaster, epitelceller og endotelceller. I de afsluttende faser ombygges den foreløbige ekstracellulære matrix , og ardannelse og sårlukning fortsætter2,3,4,5,6,7,8.

Ingen enkelt murine model giver et system til at studere alle stadier af sårheling2. Her er to kirurgiske sårmodeller beskrevet: den ene belyser akutte cellulære og cytokinsårhelingsreaktioner, og den anden giver mulighed for vurdering af sårlukning samt histologiske analyser. Disse to metoder kan anvendes på en supplerende måde til at vurdere virkningerne af en uro eller comorbiditet på forskellige aspekter af sårhelingsresponsen. Den dorsale subkutane implantation af polyvinyl alkohol (PVA) svampe er et system, der har været anvendt i gnavere modeller i årtier til at belyse en lang række aspekter af cellulære og granulering væv svar9,10,11,12,13,14,15,,16,17,18,19,20 ,21,22,23,24. Denne fremgangsmåde giver mulighed for hentning af cytokin-rige sårvæsker og cellulære infiltrerer. I denne model, 1 cm x 1 cm x 0,5 cm stykker PVA svamp er placeret i subkutane lommer gennem en 2 cm snit lavet på den bageste ryg midterlinjen. Snittet lukkes med kirurgiske clips, og svampene kan hentes på senere tidspunkter for celle- og væskeisolering. Den cellulære og cytokin miljø af isolerede svampe afspejler de normale stadier af akut sårheling op til omkring 14 dage efterimplantation. På senere tidspunkter er modellen mere fordelagtig til at studere granuleringsvævsdannelse og fremmedlegemets respons1. Med dette system er det muligt at isolere > 106 celler, hvilket giver en klar fordel for fænotypiske og funktionelle analyser og RNA-isolation, over isolering af celler fra andre biopsibaserede metoder1,22,23,25,26.

Hastigheden af sårlukning bestemmes ved hjælp af hale huden excision model. I denne model, som oprindeligt beskrevet af Falanga et al. og rapporteret af andre27,28,29,30, en 1 cm x 0,3 cm fuld tykkelse del af hale huden fjernes nær bunden af halen. Sårområdet kan let visualiseres og kan måles over tid. Alternativt kan halevæv isoleres til histologisk analyse. Denne fremgangsmåde kan bruges som et alternativ til eller i forbindelse med den veletablerede dorsale punch biopsi metode. De primære sondringer mellem disse to modeller er hastigheden af sårlukning, tilstedeværelse eller fravær af pels, og hudenstruktur2,31,32. Hale hudsår tilbyder en længere tidsramme til at vurdere sårlukning, da det tager cirka 21 dage for fuld lukning at forekomme. Dette er imod unsplinted dorsal punch biopsier, som heler meget hurtigere (~ 7-10 dage), primært ved sammentrækning på grund af virkningen af panniculus carnosus. Splintrede dorsale punch biopsier helbrede langsommere og mindske virkningerne af kontraktile healing, men stole på tilstedeværelsen af et fremmedlegeme til at begrænse kontraktile-baserede mekanismer1,2,27,30,31,33.

De beskrevne sårmodeller er informative til at forstå normale sårhelingsprocesser i mangel af forstyrrelser. Mens heling af gnaver hud adskiller sig i meget betydelige måder fra menneskers hud, herunder løs struktur, afhængighed af kontraktile healing, og andre anatomiske forskelle, murine systemet tilbyder visse fordele for mekanistiske og screening undersøgelser. Først og fremmest blandt disse er tilgængeligheden af indavlede stammer og genetiske mutanter, genetiske tractability, og lavere omkostninger. Mekanistisk indsigt fra murine undersøgelser kan oversættes til komplekse dyremodeller, der i højere grad efterligner menneskers hud heling, såsom svin system2,31.

Ud over at undersøge sårhelingsreaktioner i steady state, kan disse modeller kombineres med comorbide betingelser for at forstå grundlaget for sårhelingsdefekter på cellulære, cytokin, og brutto væv niveau. Det er i denne særlige indstilling, at de to modeller kan bruges i fællesskab til at vurdere virkningerne af en bestemt comorbid tilstand, såsom postoperativ lungebetændelse, på både den akutte cellulære sårheling respons og hastigheden af sårlukning30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg, der er beskrevet her, blev godkendt af Brown University Institutional Animal Care and Use Committee og udført i overensstemmelse med vejledningen for pleje og brug af dyr fra National Institutes of Health.  BEMÆRK: I videoen er den kirurgiske drapere blevet udeladt med henblik på demonstration.

1. Subkutan implantation af PVA svampe

  1. Brug en saks til at skære plader af PVA svamp i 8 mm x 8 mm x 4 mm stykker. Rehydrere stykker af PVA svamp ved nedsænkning dem i sterile 1x PBS i et bægerglas.
  2. Autoklave svampene i 1x PBS til sterilisere og afkøles helt. Opbevar autoklamerede svampe i steril 1x PBS ved 4 °C.
  3. Før kirurgisk implantation udføres, aliquot det nødvendige antal svampe i en steril kultur skål under sterile forhold i en laminar flow hætte. Opbevar de ekstra svampe i steril 1x PBS ved 4 °C til fremtidig brug. Sørg for, at svampene svulmer op til 1 cm x 1 cm x 0,5 cm efter rehydrering. Et billede af dehydrerede PVA svampe er vist i figur 1A.
    BEMÆRK: For at opretholde steriliteten af det kirurgiske sted, PVA svamp implantation procedure kræver en person til at håndtere musen og forberede det kirurgiske sted, og en anden person til at udføre implantationen.
  4. Bedøve en 8-12 uger gammel mandlig C57BL/6J mus ved intraperitoneal injektion af 80 mg/kg ketamin. Administreres 40 mg/kg xylazine intraperitoneally for analgesi.  Bekræft dybden af anæstesi ved tab af en pedal refleks. Forbered det kirurgiske sted ved at fjerne håret langs dorsum med klippere. Ved hjælp af steril gaze, anvende povidon-jod opløsning til barbering område 2x, efterfulgt af 70% ethanol.
  5. Placer musen på sterile kirurgiske gardiner. Placer en opvarmet pude under de kirurgiske gardiner for at opretholde musens kernetemperatur.
  6. Bær sterile kirurgiske handsker til udførelse af operationen. Træk ryghuden væk fra det underliggende væv med pincet, og ved hjælp af sterilkirurgisk saks, lave en 2 cm snit langs dorsale midterlinjen ca 2 cm anterior til bunden af halen. Mens du holder snittet åbent med sterile pincet, skal du bruge sterile buede, stumpe-tippet kirurgisk saks til at danne en subkutan lomme langs dorsum i en af de positioner, der er angivet i figur 1B.
  7. Fortsæt med at bruge pincet til at løfte huden væk fra det underliggende væv. Brug steril kirurgisk saks, forsigtigt klemme en PVA svamp i kulturskålen for at fjerne overskydende PBS. Saml PVA svampen op i det ene hjørne ved hjælp af steril kirurgisk saks, og før med hjørnet holdt af saksen, placere svampen i den subkutane lomme dannet i trin 1.4.
  8. Gentag denne proces 5x, idet i alt seks svampe i subkutane lommer som vist i figur 1B.
  9. Klem den indsnittede ryghud sammen med sterile pincet, og luk snittet med to sårclips i rustfrit stål.
  10. Brug et nyt sæt sterile kirurgiske instrumenter til hver mus. Alternativt kan du bruge en perle sterilisator til at sterilisere instrumenter mellem mus.

2. Isolering af væsker fra PVA svampe

  1. At vurdere den akutte sår cytokin miljø, isolere svampe mellem 1-14 dage efterimplantation.
  2. Forbered et væskeopsamlingsrør ved at indlejre tønden af en 5 ml sprøjte i et 16 ml dyrkningsrør.
  3. Euthaniser en mus med implanterede PVA svampe ved CO2 kvælning efterfulgt af cervikal dislokation.
  4. Fjern de kirurgiske hæfteklammer og åbne snittet med tandede pincet. Brug en saks til at forlænge snittet langs dorsal midterlinjen.
  5. Brug pincet, udtrække en svamp fra sin subkutane lomme og overføre den til den forberedte sprøjte tønde, være omhyggelig med at minimere presset til svampen. Fjern enhver bindevæv, der forbliver klæbet til overfladen af svampen. Brug saks til at dissekere svampen fra det omgivende væv, hvis det er nødvendigt. Gentag svampen fjernelse proces med de resterende svampe. Anbring røret med svampene på is.
  6. For at isolere sårvæsken centrifugeres dyrkningsrøret, der indeholder 5 ml sprøjten, med svampene ved 700 x g i 10 min.
  7. Efter centrifugering kasseres sprøjten og svampene. Sårvæsken vil have samlet sig i 16 ml dyrkningsrøret. Et repræsentativt billede af væske indsamlet fra en dag 7 sår er vist i figur 1D. Sårvæsken overføres til et rent rør til langtidsopbevaring ved -80 °C.

3. Isolering af celler fra PVA svampe

  1. At vurdere den akutte sårheling cellulære miljø, indsamle svampe mellem 1-14-dage post-svamp implantation. Svampe fremstillet af et sår 7 dage efter implantation en er vist i figur 1E.
  2. Forbered indsamling medium, der indeholder 1x HBSS (+calcium/+magnesium/-phenol rød) suppleret med 1% FBS, 1% HEPES, og 1% penicillin-streptomycin.
  3. Aliquot 5 ml HBSS opsamlingsmedium i et konisk 15 ml rør.
  4. Pva-svampene udvindes af euthaniserede mus som beskrevet i 2.2-2.4. Anbring svampene i det koniske rør med 5 ml HBSS-opsamlingsmedium.
  5. Overfør svampene og HBSS opsamlingsmediet til en 80 ml blenderpose ved at hælde. Hæng blenderposen fra lugen af pagajen blenderen, placeret således at padlerne rammer svampe og medier. Juster indstillingerne for padleblenderen til at køre højt i 60 s. Tryk start.
  6. Overfør mediet fra blenderposen tilbage til det koniske 15 ml rør med en pipette, så svampene efterlades i posen. Klem svampene for at frigøre mediet grundigt. Juster indstillingerne for padle blendertilen til at køre i 30 s på høj. Tilsæt 5 ml medier til blenderposen, og gentag maveprocessen 2x for i alt tre svampevask.
  7. Konisk rør centrifugeres ved 250 x g i 5 min. En rød pellet af celler og røde blodlegemer vil være synlig i bunden af det koniske rør efter centrifugering.
  8. Supernatanten kasseres, og der udføres en rød blodcellelyse: Der tilsættes 900 μL dH2O til cellepellet og pipetten for at blande. Neutraliseres med 100 μL 10x PBS. Der tilsættes 4 ml 1x PBS til røret for at neutralisere lysisen helt, og centrifuger derefter ved 250 x g i 5 min.
    BEMÆRK: Lysistrinnet skal være kort. hvis vandet efterlades i kontakt med cellerne i mere end 3-5 s, kan det resultere i lysis af ikke-røde blodlegemer.
  9. Efter centrifugering vil en hvid cellepellet indeholdende sårceller uden røde blodlegemer være til stede i bunden af det koniske rør. Supernatanten kasseres, og cellepelletsen suspenderes igen i det ønskede medium til nedstrømsanalyser.

4. Valgfri flow cytometri analyse af medfødte leukocytter isoleret fra PVA svamp sår

  1. Resuspender 0,5-1 x 106 sårceller i 25 μL af et 2x opløsning af blokerende antistof indeholdende 10 μg/ml anti-CD16/CD32 FcRγII/III antistof fortyndet i 1x PBS + 1% BSA.
    BEMÆRK: Alle antistoffer bør titreres for at bestemme optimale koncentrationer til flowcytometrianalyse.
  2. Cellerne inkuberes med blokerende antistof i 10 minutter på is.
  3. Lav en 2x master blanding af antistoffer, der indeholder 2,5 mg/ml af PerCP-eFluor710-Ly6G, 5 mg/ml FITC-Ly6C, APC-Fire750-CD45.2, APC-R700-Siglec-F, og 10 mg/ml af eFluor660-F4-80 fortyndet i 1x PBS + 1% BSA. Direkte tilsættes 25 μL af antistofcocktailen til de celler, der inkuberer i blokerende antistof.
  4. Inkubercellerne i 20 minutter på is, beskyttet mod lys.
  5. Cellerne vaskes 2x med 1x PBS.
  6. Lav en master blanding af amin-reaktiv fixable levedygtighed dye-eFluor506 fortyndet 1:1,000 i 1x PBS. Resuspender cellepelletsen i 50 μL af levedygtighedsfarveopløsningen.
    BEMÆRK: Serum skal udelukkes fra det fikserbare levedygtighedstrin, da det vil forhindre binding af farvestoffet til endogene proteiner. Inkubercellerne i 20 minutter på is, beskyttet mod lys.
  7. Cellerne vaskes 2x med 1x PBS. Resuspender cellepelletien i 50 μL 1% paraformaldehyd.
  8. Inkubercellerne med 1% paraformaldehyd i 15 minutter på is, beskyttet mod lys.
  9. Cellerne 1x vaskes med 1x PBS, og pelletsen suspenderes igen i 1x PBS til flowcytometrisk analyse.

5. Hale hud excision

  1. Bedøve en 8-12 uger gammel mandlig C57BL/6J mus ved intraperitoneal injektion af 80 mg/kg ketamin. Administreres 40 mg/kg xylazine intraperitoneally for analgesi. Bekræft dybden af anæstesi ved tab af en pedal refleks.
  2. Forbered det kirurgiske sted på halen af den bestøvede mus ved hjælp af steril gaze til at anvende povidon-jod opløsning 2x, efterfulgt af en ansøgning af 70% ethanol.
  3. Der defineres en 10 mm x 3 mm sektion på halens rygoverflade, 10 mm fra halens bund (figur 1C), ved hjælp af en permanent markør til sporing fra en færdiglavet skabelon.
  4. Placer bedøvet musen på sterile kirurgiske gardiner.
  5. Bær sterile kirurgiske handsker til at udføre de kirurgiske procedurer. Med en steril skalpel klinge, lave en fuld tykkelse snit langs højre, nederste og venstre kanter af sårområdet.
  6. Brug sterile pincet, skræl den punktafgifterede hud væk fra halen, og bruge sterilkirurgisk saks til at skære væk den øverste kant af sårområdet.
  7. Tryk med steril gaze for at stoppe blødningen.
  8. Påfør en spraybarriere film til sårsengen.
  9. Fotografer sårene fra en fast afstand med jævne tidsintervaller. Analysér fotografier ved planimetrisk analyse for at bestemme målinger af sårområdet. Alternativt kan du bruge calipre til at opnå sårlængde og bredde målinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Systemisk inflammatorisk respons efter PVA svamp implantation
PVA svamp implantation kirurgi genereret en systemisk inflammatorisk respons, som det fremgår af induktion af IL-6 i plasma 1 dag efter at have såret (Figur 2A). Andre proinflammatoriske cytokiner, herunder TNF-α og IL-1β, samt en række chemokiner, herunder CCL2 og CXCL1, blev induceret systemisk i de første 7 dage efter PVA svampeimplantation og er blevet beskrevet andetsteds26,30.

Isolering af celler og væsker fra PVA svamp sår
Den primære fordel ved PVA svamp sår model er evnen til at inddrive nok celler til fænotypiske og funktionelle analyser af den akutte cellulære sårheling svar. Antallet af celler, der kan inddrives fra PVA svamp sår stiger over tid, fra ca 2 x 106 celler pr seks svampe på sårdag 1 x 106 til 8 x 106 celler på såret dag 7 (Figur 2B). Celletallet fortsætter med at stige ud over dag 7. Det anbefales ikke at fortsætte denne model ud over ~ 14 dage, fordi svampene bliver fuldt indkapslet af kollagen og systemet overgange fra modellering en akut sårheling reaktion til modellering et fremmed legeme granulom1,22,23,25,26. Neutrofiler, monocytter, og makrofager var den primære cellulære infiltrere i PVA svamp sår. Neutrofiler dominerede det sårcellulære miljø en dag efter at have såret, vurderet ved flowcytometrisk analyse (figur 2C). Monocytter og monocyt-afledte makrofager akkumuleret inden for 3 dage efter svampe implantation, og de tre cellepopulationer steg i antal over tid (Figur 2C). En repræsentativ flow cytometri gating strategi til at identificere neutrofile, monocyt, og makrofag populationer er vist i figur 2D. Efter at have ekskluderet celledoublet ser ud til at have fsc-h- og SSC-H-parametre (figur 2D, i og ii) blev ikke-levedygtige celler udelukket ved hjælp af et aminrereaktivt fixable levedygtighedsfarvestof (vist her) eller et nukleinsyrefarvestof (f.eks. sytox eller propidiumiodid) (figur 2D, iii). Resterende cellulære rester, der ikke blev fjernet ved de foregående gatingtrin, blev derefter udelukket ved hjælp af FSC-A- og SSC-A-parametre (Figur 2D, iv). Hæmatopoietiske celler bestod af størstedelen af PVA svamp sårceller og blev identificeret ved CD45 udtryk (Figur 2D, v). Neutrofiler blev identificeret som Ly6G+Siglec-F(Figur 2D, vi). Siglec-F+ celler var primært eosinofile (Figur 2D, vii). Gating på Ly6GSiglec-F celler, monocytter/makrofager blev identificeret som F4/80+ celler (Figur 2D, viii). F4/80+ celler kan yderligere fraktioneres med Ly6C-udtryk for at skelne mellem ly6C-hiinflammatoriske monocytter (Figur 2D, ix) og Ly6Clave monocytafledte makrofager (Figur 2D, x)26.

Evnen til at måle cytokiner og andre såropløselige faktorer er en anden fordel for PVA svamp sår model. Det er muligt at udvinde op til 100 μL væske pr. svamp. Ekstraherede væsker er velegnede til en række downstream-analyser. Påvisning af cytokiner og chemokiner i tidlige og sene sårvæsker ved ELISA eller perlebaserede multiplex-immunassays er blevet rapporteret andetsteds26,30. Det er muligt at få både celler og væsker fra samme sår. For at gøre dette anbefales det at isolere tre svampe fra den ene side af rygmidterlinjen til celleisolering og 3 svampe fra den modsatte side af rygmidterlinjen til væskeekstraktion.

Vurdering af sårlukning ved hjælp af modellen til udskillelse af halehuden
Den excisional hale hud model giver et alternativ til den dorsale hud punch biopsi metode til at studere langsom sårlukning i fast hud mangler tæt pels. Eksempel billeder af hale hud sår på 1, 7, og 15 dage efter excision er vist i figur 3A. Sårlukning kan kvantificeres ved at måle arealet af sårlejet over tid. Dag 7 og dag 15 sårsenge områder var ca 70% og 35%, henholdsvis af dag 1 sår område (Figur 3B). Fuld sårlukning krævede ca. 28 dage. Halen hudsår kunne også observeres i tværsnit ved histologisk analyse. Figur 3C og Figur 3D viser repræsentative billeder af henholdsvis H&E og Massons Trichrome-farvede haletværsnit. Den laterale margener af den punktafgifterede hud er angivet med pilespidser på rygoverfladen af halen.

Figure 1
Figur 1: Skematisk af murine sårhelingsmodeller. (A) Side (venstre) og øverste (højre) visning af dehydrerede PVA svampe, der måler 8 mm x 8 mm x 0,4 mm. (B) Illustration af en mus, der viser placeringen af den dorsale midterlinie snit (central rød linje) og seks 1 cm x 1 cm x 0,5 cm PVA svampe i subkutane lommer. (C) Skematisk, der viser størrelsen og placeringen af et ekstusionssår (10 mm x 3 mm rødt rektangel) på halens rygoverflade. (D) Sårvæske isoleret fra tre svampe, der blev hentet fra det subkutane rum 7 dage efter implantation. (E) Udseendet af svampe hentet fra såret 7 dage efter implantation. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Den systemiske og cellulære reaktion på PVA svamp implantation. (A) Et tidsforløb med IL-6-niveauer i plasmaet viser, at PVA-svampeimplantation induceret et systemisk inflammatorisk respons. Koncentrationen af IL-6 blev målt ved hjælp af et multiplex perlebaseret immunassay. (B) Antallet af celler isoleret fra PVA svampe sår steg over tid. (C) Et tidsforløb viser akkumulering af neutrofiler, monocytter og monocytafledte makrofager i PVA-svampesår over tid. (D) En repræsentativ gatingstrategi for celler, der er isoleret fra PVA-svampesår, viser, hvordan delmængderne leukocyte identificeres ved flowcytometrisk analyse. Gates defineres som følger: (i og ii) dobbeltudelukkelse, (iii) dødcelleudelukkelse ved hjælp af et aminreaktivt fixable levedygtighedsfarvestofiv) udelukkelse af affald af FSC-A og SSC-A,(v) CD45+ hæmatopoietiske celler, (vi) Ly6G+ neutrofiler, (vii) Siglec-F+ eosinofile, (viii) Ly6GSiglec-F F4/80+ monocytter/makrofager, (ix) F4/80+ Ly6Chi monocytter og (x) F4/80+Ly6Clave makrofager. Gates blev placeret i henhold til fluorescens-minus en (FMO) kontrol. De data, der er vist i AC, er middelværdien ± SEM, n = 6-10 mus pr. gruppe i (A), n = 8-9 mus i (B) og n = 6-8 mus i (C). Alle data kombineres fra 2-3 uafhængige eksperimenter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Vurdering af ekskrementer i sårheingen af huden. (A) Repræsentative fotografier af ekskrementer i sårene i halehuden taget 1, 7 og 15 dage efter såret. bB) Lukning af ekskrementer i haleshud. Sår blev fotograferet hver anden dag. Billedbehandlingssoftware blev brugt til at spore sårsengemargenerne og beregne sårområdet på angivne tidspunkter. Sårområdet præsenteres som en brøkdel af sårområdet målt på dag 1. Repræsentative billeder af hale tværsnit, der var paraffin-indlejret, sektionsopdelt, og farves med (C) H & E eller (D) Masson's Trichrome. Såret var placeret på rygoverfladen af halen tværsnit; sidesidede sårmargener indikeres med pilespidser. De data, der er vist i (B), er middelværdien ± SEM, n = 8 mus pr. gruppe. Data kombineres fra to uafhængige eksperimenter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne artikel beskriver to tractable murine sår modeller, der giver mulighed for vurdering af den akutte sårheling svar. Den første metode indebærer kirurgisk implantation af PVA svampe i den dorsale subkutane rum. Denne tilgang giver en klar fordel i forhold til biopsi-baserede sårmodeller til undersøgelse af den cellulære sårhelingsrespons på grund af det store antal celler og mængden af sårvæsker fra de isolerede svampe. For en vellykket udførelse af denne procedure, opretholde en steril kirurgisk felt ved grundigt at rense huden omkring snittet er bydende nødvendigt, som translokation af bakterier i såret vil væsentligt ændre løbet af heling. Ved hjælp af den celleisolationsmetode, der er beskrevet her, er det muligt at isolere mindst 1-10 x 106 celler fra PVA svampene, afhængigt af tidspunktet for svampeekstraktion. Størstedelen af cellerne isoleret fra PVA svamp sår er levedygtige (Figur 2D). Men fordi det er muligt for døde celler at udgøre op til ~ 20% af isolerede sårceller efter mekanisk afbrydelse, anbefales det stærkt at bruge en levedygtighed plet, når du fortsætter med flow cytometri-baserede analyser. Celler isoleret fra PVA svamp sår er primært af hæmatopoietisk oprindelse som bestemt af CD45 positivitet (Figur 2D). Den hurtige akkumulering af neutrofiler efterfulgt af monocytter og makrofager er i overensstemmelse med de akutte stadier af sårreparation3,4,34,35,36,37,38. Isolerede celler er velegnede til downstream-analyser, herunder immunophenotypebestemmelse, cellesortering, dyrkning, RNA-ekstraktion og en række funktionelle analyser.

PVA svamp sår model giver også mulighed for isolering af væsker, som er ideel til vurdering af cytokin og vækstfaktor reaktioner i det akutte sår miljø. PVA svamp væsker er egnet til test af ELISA, perle-baserede multiplex immunoassay, og protein kvantificering, blandt andre. Tidligere undersøgelser har gennem cytokin- og vækstfaktormåling vist, at det tidlige sårmiljø er inflammatorisk i naturen med hurtig induktion af IL-6, TNF-α og IL-1β fra dag 1-3. Sårmiljøet overgår derefter til en reparativ tilstand med senere induktion af pro-angiogene og pro-fibrotiske vækstfaktorer, herunder VEGF og TGF-β22,23,25,26,30.

Mens PVA svamp implantation model er fordelagtigt for at studere akut sårcellulære og cytokin reaktioner, en af dens begrænsninger er den manglende evne til at måle hastigheden eller graden af healing. Måling af dette aspekt af sårheling kan være nødvendig ved vurdering af virkningerne af en comorbidet tilstand på forskellige aspekter af sårhelingsresponsen30. For denne måling foretrækkes biopsibaserede metoder. Her er halen hud excision model præsenteret. I denne model, en fuld tykkelse del af hale hud er fjernet fra rygoverfladen af halen. Igen, opretholde en steril kirurgisk felt er vigtigt at undgå at vaccinere sårbunden. Brugen af en spraybarriere film eller andre sår, der dækker anbefales også for at undgå senere sårinfektion. Ældre hanmus eller aggressive stammer kræver soloboliger for at undgå forstyrrelser af såret. En særlig fordel ved halen som et sted for at studere sårheling er, at det er mere afhængig af re-epithelialization for lukning, som beskrevet af andre27,32,33. Ud over at måle sårbundsområdet og udføre histologiske analyser har andre rapporteret om dets anvendelse ved vurderingen af effekten af aktuelle indgreb i moduleringen af helingsprocessen33.

Hver af de sårmodeller, der er beskrevet i disse metoder, giver klare fordele ved at forstå sårreparationsprocesser i steady state og i nærvær af comorbiditeter. På grund af den brede tilgængelighed af genetisk ændrede stammer af indavlede mus, er det også muligt at manipulere sårheling svar til at besvare mekanistiske spørgsmål om processen. Endvidere, disse systemer kan gennemføres i murine modeller af betingelser forbundet med dårlig sårheling herunder diabetes, aldring, sekundær infektion, og andre30,,36,39,40. Den mekanistiske indsigt er opnået fra murine undersøgelser kan derefter danne grundlag for at studere sårheling i højere orden dyremodeller. Sammen giver PVA svamp implantation og excisional hale hud sår modeller tractable og alsidige systemer til at belyse sårheling processer under steady state og patologiske forhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Kevin Carlson fra Brown University Flow Cytometri og Sortering Facility for høring og bistand med flow cytometri eksperimenter. Billeder i figur 1B og C blev skabt med BioRender. Kayla Lee og Gregory Serpa takkes for deres fotografiske hjælp. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra følgende: Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) YFAA15 D15AP00100, Dean's Areas of Emerging New Science Award (Brown University), National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) 1R01HL126887-01A1, National Institute of Environmental Science (NIES) T32-ES7272 (Uddannelse i miljøpatologi), og Brown University Research Seed Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific BP3991
15 mL centrifuge tubes, Olympus Genesee 28-103
1x HBSS (+Calcium, +Magnesium, –Phenol Red) ThermoFisher Scientific 14025076
5ml Syringe BD 309646
Anti-mouse CD45.2-APC Fire750 BioLegend 109852 Clone 104
Anti-mouse F4/80-eFluor660 ThermoFisher Scientific 50-4801-82 Clone BM8
Anti-mouse Ly6C-FITC BD Biosciences 553104 Clone AL-21
Anti-mouse Ly6G-PerCP-eFluor710 ThermoFisher Scientific 46-9668-82 Clone 1A8-Ly6g
Anti-mouse Siglec-F-APC-R700 BD Biosciences 565183 Clone E50-2440
Autoclip Stainless Steel Wound Clip Applier Braintree Scientific NC9021392
Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9mm Braintree Scientific NC9334081
Blender Bag, 80mL Fisher Scientific 14258201
Culture Tube, 16mL, 17x100 Genesee Scientific 21-130
Fetal Bovine Serum - Standard ThermoFisher Scientific 10437028
Fixable Viability Dye eFluor506 ThermoFisher Scientific 65-0866-14
Hepes Solution, 1M Genesee Scientific 25-534
ImageJ Software NIH
Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15070-063
Polyvinyl alcohol sponge - large pore size Ivalon/PVA Unlimited www.sponge-pva.com
Povidone-iodine solution, 10% Fisher Scientific 3955-16
Spray barrier film, Cavilon 3M 3346E
Stomacher 80 Biomaster, 110V Seward 0080/000/AJ

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gottrup, F., Agren, M. S., Karlsmark, T. Models for use in wound healing research: a survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 8, (2), 83-96 (2000).
  2. Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. A Modeling Conundrum: Murine for Cutaneous Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138, (4), 736-740 (2018).
  3. Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: Mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6, (265), (2014).
  4. Huber-Lang, M., Lambris, J. D., Ward, P. A. Innate immune responses to trauma. Nature Immunology. 19, (4), 327-341 (2018).
  5. Novak, M. L., Koh, T. J. Phenotypic Transitions of Macrophages Orchestrate Tissue Repair. The American Journal of Pathology. 183, (5), 1352-1363 (2013).
  6. Martins-Green, M., Petreaca, M., Wang, L. Chemokines and Their Receptors Are Key Players in the Orchestra That Regulates Wound Healing. Advances in Wound Care. 2, (7), 327-347 (2013).
  7. Guerrero-Juarez, C. F., et al. Single-cell analysis reveals fibroblast heterogeneity and myeloid-derived adipocyte progenitors in murine skin wounds. Nature Communications. 10, (1), 650 (2019).
  8. Shook, B. A., et al. Myofibroblast proliferation and heterogeneity are supported by macrophages during skin repair. Science. 362, (6417), 2971 (2018).
  9. Davidson, J. M., et al. Accelerated wound repair, cell proliferation, and collagen accumulation are produced by a cartilage-derived growth factor. The Journal of Cell Biology. 100, (4), 1219-1227 (1985).
  10. Buckley, A., Davidson, J. M., Kamerath, C. D., Wolt, T. B., Woodward, S. C. Sustained release of epidermal growth factor accelerates wound repair. Proceedings of the National Academy of Sciences. 82, (21), 7340-7344 (1985).
  11. Peterson, J. M., Barbul, A., Breslin, R. J., Wasserkrug, H. L., Efron, G. Significance of T-lymphocytes in wound healing. Surgery. 102, (2), 300-305 (1987).
  12. Efron, J. E., Frankel, H. L., Lazarou, S. A., Wasserkrug, H. L., Barbul, A. Wound healing and T-lymphocytes. Journal of Surgical Research. 48, (5), 460-463 (1990).
  13. Schäffer, M. R., Tantry, U., Thornton, F. J., Barbul, A. Inhibition of nitric oxide synthesis in wounds: pharmacology and effect on accumulation of collagen in wounds in mice. The European Journal of Surgery = Acta Chirurgica. 165, (3), 262-267 (1999).
  14. Opalenik, S. R., Davidson, J. M. Fibroblast differentiation of bone marrow-derived cells during wound repair. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 19, (11), 1561-1563 (2005).
  15. Järveläinen, H., et al. A role for decorin in cutaneous wound healing and angiogenesis. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 14, (4), 443-452 (2006).
  16. Luckett, L. R., Gallucci, R. M. Interleukin-6 (IL-6) modulates migration and matrix metalloproteinase function in dermal fibroblasts from IL-6KO mice. The British Journal of Dermatology. 156, (6), 1163-1171 (2007).
  17. Daniel, T., et al. Regulation of the postburn wound inflammatory response by gammadelta T-cells. Shock. 28, (3), 278-283 (2007).
  18. MacLauchlan, S., et al. Macrophage fusion, giant cell formation, and the foreign body response require matrix metalloproteinase 9. Journal of Leukocyte Biology. 85, (4), 617-626 (2009).
  19. Schwacha, M. G., Thobe, B. M., Daniel, T., Hubbard, W. J. Impact of thermal injury on wound infiltration and the dermal inflammatory response. Journal of Surgical Research. 158, (1), 112-120 (2010).
  20. Ganesh, K., et al. Prostaglandin E2 Induces Oncostatin M Expression in Human Chronic Wound Macrophages through Axl Receptor Tyrosine Kinase Pathway. The Journal of Immunology. 189, (5), 2563-2573 (2012).
  21. Deskins, D. L., et al. Human mesenchymal stromal cells: identifying assays to predict potency for therapeutic selection. Stem Cells Translational Medicine. 2, (2), 151-158 (2013).
  22. Daley, J. M., Brancato, S. K., Thomay, A. A., Reichner, J. S., Albina, J. E. The phenotype of murine wound macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 87, (1), 59-67 (2010).
  23. Thomay, A. A., et al. Disruption of Interleukin-1 Signaling Improves the Quality of Wound Healing. The American Journal of Pathology. 174, (6), 2129-2136 (2009).
  24. Brancato, S. K., et al. Toll-like receptor 4 signaling regulates the acute local inflammatory response to injury and the fibrosis/neovascularization of sterile wounds. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 21, (4), 624-633 (2013).
  25. Daley, J. M., et al. Modulation of macrophage phenotype by soluble product(s) released from neutrophils. Journal of Immunology. 174, (4), 2265-2272 (2005).
  26. Crane, M. J., et al. The monocyte to macrophage transition in the murine sterile wound. PloS One. 9, (1), 86660 (2014).
  27. Falanga, V., et al. Full-thickness wounding of the mouse tail as a model for delayed wound healing: accelerated wound closure in Smad3 knock-out mice. Wound Repair and Regeneration. 12, (3), 320-326 (2004).
  28. Li, J., et al. Molecular mechanisms underlying skeletal growth arrest by cutaneous scarring. Bone. 66, 223-231 (2014).
  29. Zhou, S., et al. A Novel Model for Cutaneous Wound Healing and Scarring in the Rat. Plastic and Reconstructive Surgery. 143, (2), 468-477 (2019).
  30. Crane, M. J., et al. Pulmonary influenza A virus infection leads to suppression of the innate immune response to dermal injury. PLOS Pathogens. 14, (8), 1007212 (2018).
  31. Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research Techniques Made Simple: Animal Models Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138, (10), 2095-2105 (2018).
  32. Rittié, L. Cellular mechanisms of skin repair in humans and other mammals. Journal of Cell Communication and Signaling. 10, (2), 103-120 (2016).
  33. Falanga, V., et al. Autologous Bone Marrow-Derived Cultured Mesenchymal Stem Cells Delivered in a Fibrin Spray Accelerate Healing in Murine and Human Cutaneous Wounds. Tissue Engineering. 13, (6), 1299-1312 (2007).
  34. Lucas, T., et al. Differential Roles of Macrophages in Diverse Phases of Skin Repair. The Journal of Immunology. 184, (7), 3964-3977 (2010).
  35. Wang, J., et al. Visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair. Science. 358, (6359), 111-116 (2017).
  36. Mirza, R. E., Koh, T. J. Contributions of cell subsets to cytokine production during normal and impaired wound healing. Cytokine. 1-4 (2014).
  37. Mirza, R., DiPietro, L. A., Koh, T. J. Selective and Specific Macrophage Ablation Is Detrimental to Wound Healing in Mice. The American Journal of Pathology. 175, (6), 2454-2462 (2010).
  38. DiPietro, L. A., Burdick, M., Low, Q. E., Kunkel, S. L., Strieter, R. M. MIP-1alpha as a critical macrophage chemoattractant in murine wound repair. Journal of Clinical Investigation. 101, (8), 1693-1698 (1998).
  39. Wetzler, C., Kämpfer, H., Stallmeyer, B., Pfeilschifter, J., Frank, S. Large and Sustained Induction of Chemokines during Impaired Wound Healing in the Genetically Diabetic Mouse: Prolonged Persistence of Neutrophils and Macrophages during the Late Phase of Repair. Journal of Investigative Dermatology. 115, (2), 245-253 (2000).
  40. Kim, D. J., Mustoe, T., Clark, R. A. Cutaneous wound healing in aging small mammals: a systematic review. Wound Repair and Regeneration. 23, (3), 318-339 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics