الاعلية الجلدية الجلدية الأنسجة الدهنية البيضاء (ISWAT) نموذج زرع الجزر المورين

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

في هذا البروتوكول ، يتم وصف طريقة عزل الجزر التورانية وزرعها في الأنسجة الدهنية البيضاء تحت الجلد الجلدية. يتم زرع الجزر التورينية المعزولة في متلقي المورين باستخدام هيدروجيل غشاء الطابق السفلي. يتم مراقبة مستوى السكر في الدم من المتلقين، ويتم إجراء تحليل الأنسجة من الطعوم السبوة.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Peng, Y., Zou, Z., Chen, J., Zhang, H., Lu, Y., Bittino, R., Fu, H., Cooper, D. K. C., Lin, S., Cao, M., Dai, Y., Cai, Z., Mou, L. Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue (ISWAT) Transplantation Model of Murine Islets. J. Vis. Exp. (156), e60679, doi:10.3791/60679 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

زرع زلاب البنكرياس هو علاج علاجي راسخ لمرض السكري من النوع 1. كبسولة الكلى هو الموقع الأكثر استخداما لزرع الجزر في نماذج القوارض. ومع ذلك ، فإن كبسولة الكلى الضيقة تحد من زرع جزر كافية في الحيوانات الكبيرة والبشر. تم العثور على الأنسجة الدهنية البيضاء تحت الجلد الجلدية (ISWAT) ، وهي مساحة جديدة تحت الجلد ، لتكون موقعًا قيمًا محتملًا لزرع الجزر. هذا الموقع لديه إمدادات الدم أفضل من المساحات الأخرى تحت الجلد. وعلاوة على ذلك، فإن ISWAT يستوعب كتلة أكبر من الجزر كبسولة الكلى، وزرع في ذلك هو بسيط. تصف هذه المخطوطة إجراء عزل الجزر وزراعة الفئران في موقع ISWAT لمتلقي فأرالسكري المنسّج. باستخدام هذا البروتوكول، تم عزل الجزر البنكرياس ية المورين من قبل هضم الكولاجين القياسية واستخدمت هيدروجيل مصفوفة غشاء الطابق السفلي لتحديد الجزر المنقى في موقع ISWAT. تم رصد مستويات السكر في الدم للفئران المتلقية لأكثر من 100 يوم. تم استرداد الطعوم الجليسية في اليوم 100 بعد زرعها للتحليل النسيجي. بروتوكول زرع الجزلات في موقع ISWAT الموصوف في هذه المخطوطة بسيط وفعال.

Introduction

ارتفاع معدل انتشار وانتشار مرض السكري من النوع 1 (T1DM) في جميع أنحاء العالم بسرعة ، وفقًا للبيانات الإحصائية للاتحاد الدولي للسكري (IDF)1. زرع الجزر هي واحدة من النهج الواعدة لعلاج T1DM4. منذ اختراق كبير المحرز في زرع جزيرة سريرية باستخدام بروتوكول ادمونتون2 تم الإبلاغ عنها، يعمل البقاء على قيد الحياة الكسب غير المشروع الجزيرة في المتلقين T1DM بعد 5 سنوات الآن تصل إلى حوالي 50٪3.

في الماضي ، تم استكشاف العديد من مواقع زرع الأعضاء ، مثل الكبد ، كبسولة الكلى ، الطحال ، المنطقة العضلية ، الفضاء تحت الجلد ، نخاع العظام ، والحقيبة omental لزرع الجزر التجريبية5،6،7. وقد تم اختبار بعض المواقع المذكورة أعلاه في البيئات السريرية8. على الرغم من أن زرع الجليسفيت في الكبد لا يزال الأسلوب الأكثر استخداما في التطبيق السريري في الوقت الحاضر9، وهناك العديد من المشاكل الهامة لمعالجة عند استخدام هذا الموقع. على سبيل المثال، كيفية الحد من فقدان مبكر للجزر المزروعة الناجمة عن رد فعل التهابي الفورية بوساطة الدم (IBMIR) وضعف الأوكسجين العرض10،11 وكيفية استرداد الطعوم الجزر إذا لزم الأمر ، لأنها تنتشر محليا في الكبد. قد تكون الكبسولة الكلوية موقعًا مثاليًا لمتلقي القوارض. ومع ذلك ، فإن كبسولة الكلى الضيقة تحد من زرع جزيرات الوجينية الكافية في البشر ، على الرغم من أنها قد تكون مناسبة بشكل أفضل لزرع الجزيرات بسبب مستحضرات جزيرة بورسين عالية النقاء المستخدمةسريرياً 5،12. لذلك ، فإن البحث عن موقع أكثر ملاءمة لزرع الجزلات قيد التقدم.

ويمكن استخدام المساحة تحت الجلد كموقع قابل للتطبيق سريرياً لزرع الجزلات بسبب إمكانية الوصول إليها. ومع ذلك ، فإن كفاءة زرع الجزيرات في الفضاء تحت الجلد منخفضة للغاية ، مما يتطلب عددًا كبيرًا نسبيًا من الجزر لعكس ارتفاع السكر في الدم13. في الآونة الأخيرة ، وجد فريق بحث ياباني ISWAT ، وهو موقع حديث تحت الجلد متفوق ًا على زرع الجزر في نموذج مورين بالمقارنة مع الكبد14. يحتوي ISWAT على الشريان والوريد شرسوفي ، لذلك قد تضمن إمدادات الدم الغنية إعادة الأوعية الدموية للجسّاب. في هذه المخطوطة، نقترح طريقة زراعة سهلة باستخدام هيدروجيل مصفوفة غشاء الطابق السفلي لإصلاح جزر مورين المتجانسة في ISWAT. هذا البروتوكول يثبت فعالية لزرع الجزر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

اتبعت جميع الإجراءات الواردة في هذا البروتوكول مبادئ رعاية الحيوان من لجنة مراجعة الأخلاقيات في مستشفى الشعب الثاني في شنتشن. كان متلقو الكسب غير المشروع والمتبرعين من بين 8 إلى 10 أسابيع من العمر C57BL/6 فئران ذكر تم شراؤها من مركز الحيوانات الطبية في مقاطعة قوانغدونغ. تم إجراء عملية الحصاد أو العزلة أو الثقافة أو إدارة الخلايا التي تم حصادها في ظروف معقمة.

1- إعداد السُيب

  1. إعداد حل الكولاجين نوع الخامس العمل. وزن الكولاجين نوع الخامس وتذوب مع العازلة D-هانك إلى تركيز نهائي من 1 ملغ / مل، تصفية باستخدام وحدة تصفية 0.22 ميكرومتر المحاقن يحركها وحقنة 60 مل وprecool في الجليد. مطلوب حجم 5 مل لكل متلقي من المانحين.
  2. القتل الرحيم 10 أسابيع من العمر C57BL/6 فأر الذكور (23 ± 2 غرام) عن طريق خلع عنق الرحم ورذاذ الجزء الخارجي من الماوس مع الإيثانول 75٪ لبضع ثوان. وفي الوقت نفسه، ملء حقنة 5 مل مع محلول الكولاجين وتغيير إبرة الحقنة مع إبرة الانحناء حادة مدببة (32 G).
  3. وضع الماوس المانحة في موقف supine على كيس من الثلج تحت نطاق تشريح، وقطع فتح عرضية باستخدام مقص العين مدببة على التوالي في الجلد من منطقة العانة، واستئصال الجلد تماما نحو الرأس. ثم فتح البطن تماما عن طريق شق V من منطقة العانة إلى عملية xiphoid.
  4. كشف المرارة وطول القناة الصفراوية المشتركة عن طريق إعادة وضع الكبد. ثم قم بتضييق الفتحة الاثني عشرية للقناة الصفراوية الشائعة مع مشبك الأوعية الدموية وقطع فتحة صغيرة في المرارة.
    ملاحظة: إن وضع الإبرة الأمثل مهم لمنع التدفق الخلفي إلى الكبد والمرارة.
  5. قم بحقن القناة الصفراوية الشائعة من فتحة المرارة باستخدام إبرة التروية في الخطوة 1.2 ، ثم حقن ~ 2 مل من محلول الكولاجين في البنكرياس. بعد ذلك ، فصل البنكرياس المشبع من الأمعاء والمعدة والطحال باستخدام اثنين من أزواج من microtweezers غير الغازية ، ووضعها في أنبوب مخروطي 50 مل على الجليد.
    ملاحظة: كرر العملية لجميع الفئران المانحة. يمكن دمج ثلاثة بنكرياس متتالية (لا تزيد عن 40 دقيقة عن بعضها البعض) في أنبوب مخروطي 50 مل مملوء مسبقًا بـ 3 مل من محلول الكولاجين لكل بنكرياس.
  6. أضف 100 ميكرولتر DNase I (10 ملغم/مل) لكل بنكرياس إلى الأنابيب المخروطية سعة 50 مل، وهضم البنكرياس في حمام مائي عند درجة حرارة 37 درجة مئوية عن طريق هز الأنابيب المخروطية لمدة 3-5 دقيقة.
    ملاحظة: هز الأنابيب بقوة 40x في فترات 10 s إلى فصل الأنسجة قبل الهضم في حمام الماء، ومن ثم يهز الأنابيب باعتدال أثناء الهضم.
  7. إضافة حل إيقاف (2.5 ملغ /مل BSA-HBSS الحل) تصل إلى حجم نهائي من 50 مل لمنع الهضم، ونبض الطرد المركزي الأنابيب إلى سرعة 750 × ز في 4 درجة مئوية ووقف بسرعة.
  8. صب قبالة supernatant وغسل الكريات 2x عن طريق إعادة تعليق بلطف في 15-25 مل من BSA-HBSS. نبض الطرد المركزي أنبوب مع نفس ظروف السرعة على النحو المبين في الخطوة 1.7 لمدة 1 دقيقة.
  9. صب قبالة supernatant وتجميع الكريات من الأنابيب المخروطية الثلاثة في أنبوب مخروطي 50 مل. إعادة تعليق الكريات في حجم إجمالي قدره 10 مل من histopaque-1119. مزيج متجانس، وإضافة بالتسلسل 5 مل من histopaque-1077 و 5 مل من HBSS عن طريق الأنابيب ببطء على طول الجانب من الأنبوب.
  10. قم بتدوير العينات في جهاز الطرد المركزي عند 750 × ز عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقيقة بدون فرامل.
  11. اسشق الجزر من واجهة HBSS/histopaque-1077 إلى أنبوب مخروطي 50 مل باستخدام ماصة مكرونة 5 مل، أضف BSA-HBSS إلى حجم نهائي يبلغ 50 مل، ونبض الطرد المركزي عند 750 × ز عند 4 درجات مئوية.
  12. صب قبالة supernatant وغسل الجزر باستخدام 30 مل من BSA-HBSS. الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة عند 750 × ز عند 4 درجات مئوية.
  13. إعادة تعليق الجزر باستخدام 30 مل من وسط الثقافة (10٪ FBS-1٪ P/ S-CMRL-1066) لكل أنبوب وصب في 10 سم قطرها طبق ثقافة ضيق ة الضوء. تحت المجهر، وذلك باستخدام 200 ميكرولتر هلام تحميل الأنابيب نصائح، واختر الجزر من الحل على أساس مورفولوجيا بهم (أي كرويويدال، أبيض). وضعت في طبق ثقافة الخلايا غير المعالجة مع 10 مل من وسط الثقافة.
    ملاحظة: يمكن إجراء انتقاء يدوي ثاني إذا لم يكن نقاء الجزر المنقى أولاً هو الأمثل بعد الانتقاء الأول.
  14. تحقق من نقاء الجزر المختارة عن طريق تلطيخ dithizone تحت المجهر الخفيف واكتشاف قابلية الجزر على البقاء عن طريق الفلورسين دياستيت (FDA) - اليود (PI) تلطيخ تحت المجهر الفلوري.
  15. ثقافة الجزر المعزولة في وسط الثقافة (كما هو الحال في الخطوة 1.13) في حاضنة في 37 درجة مئوية، 95٪ الهواء-5٪ CO2 قبل الزرع.

2. ISWAT زرع الجزر

  1. حث مرض السكري في الفئران C57BL/6 الذكور البالغ من العمر 8 أسابيع (22 ± 2 غرام) عن طريق حقنة واحدة من ستريبتوزوتوسين (STZ). في اليوم -4 ، قم بصوم الفئران لـ ~ 4-6 ساعة ، ثم قم بإعداد محلول STZ بنسبة 2٪ باستخدام 0.1 M مخزن الكتر المؤقت (درجة الحموضة 4.4). وزن, إعادة تعليق في العازلة, وحقن الفئران داخل الانضد بجرعة 180 ملغ/كغ.
    ملاحظة: يجب إعداد محلول STZ حديثًا قبل الاستخدام وتغطيته برقائق الألومنيوم نظرًا لحساسيته الخفيفة. يجب استخدامه على الفور ، لأنه سيفقد النشاط في غضون 15-20 دقيقة.
  2. ثقب الأوردة caudal من الفئران التي حقنت STZ لجمع بعض الدم في حوالي 10 صباحا من اليوم -1 واليوم 0 وقياس مستوى السكر في الدم غير الصيام باستخدام شريط اختبار وأداة مراقبة السكر في الدم الأساسية. سيتم استخدام الفئران كمستلمين لزرع الجليسإذا إذا كانت مستويات السكر في الدم في يومين اختبار متتاليين لا تقل عن 20 ملليمول/لتر.
  3. في اليوم 0، وزن ووضع علامة على جميع الفئران المتلقي. تحقن كل مستلم عن طريق حقن 60 ملغ/كغ من البنتوباربيتال الصوديوم داخل البابيتونية.
    ملاحظة: قم بإدارة قرصة إصبع القدم للتحقق من عمق التخدير. إذا كان الفأر المتلقي لا يوجد لديه منعكس الانسحاب، ومستوى التخدير يكفي لعملية جراحية. إذا لم يكن كذلك، وإعطاء إضافية 10 ملغ/كغ الصوديوم بنتوباربيتال. تم تخفيف الصوديوم pentobarbital المستخدمة في المالحة الفسيولوجية العقيمة في تركيز 2٪ (م / v).
  4. أخرج الهيدروجيل من ثلاجة -20 درجة مئوية وأبقه على الجليد للسماح بالذوبان. الهيدروجيل هو السائل في 4-10 درجة مئوية وسوف تصلب في درجة حرارة أعلى.
  5. اختر مكافئات الجزر 450-500 لكل مستلم في أنبوب طرد مركزي معقم 1.5 مل تحت المجهر (كما هو الحال في الخطوة 1.13) مع 200 ميكرولتر من متوسط الثقافة والاحتفاظ على الجليد حتى يصبح جاهزًا للزرع.
  6. مسحة المنطقة الانجية اليسرى من المتلقي باستخدام الإيثانول 75٪. وضعه في موقف supine وإصلاح الأطراف الأربعة باستخدام الشريط الجراحي. حلاقة الشعر حول موقع الجراحية مع القصاصات الكهربائية ومسحة المنطقة مع Iodophor.
  7. قم بعمل شق جلدي عمودي في هذه المنطقة باستخدام مقص العيون والميكرووايزر غير الباضع، وتحديد الشريان المناقفي السفلي والوريد في ISWAT، وإنشاء جيب صغير فوق الأوعية.
  8. قم بتدوير أنبوب الجزر لمدة 30 s عند 200 × g وأزل الـ supernatant قدر الإمكان. يستنشق 20 ميكرولتر من هيدروجيل مذاب تماما وتحميله في أنبوب مع الجزر. إعادة تعليق الجزر بلطف، وتجنب فقاعات.
  9. تسليم كامل خليط الهيدروجيل islet في أنبوب في جيب (الخطوة 2.7) من المتلقي مع 200 ميكرولتر ماصة تلميح.
    ملاحظة: تتطلب هذه العملية اثنين من الفنيين، أحدهما لالتقاط حواف الجيب باستخدام ميكروتوازر غير باضع، والآخر لتسليم خليط الززير في الجيب.
  10. أضف 20 ميكرولتر من السيفالوسبورين (~ 5-10 ملغ) إلى موقع الزرع بعد أن يتم ترسيخ خليط الجزر هيدروجيل بالكامل ، ثم استخدم غرزة جراحية 5-0 لإغلاق العضلات والجلد باستخدام طريقة الخياطة المستمرة.
    ملاحظة: يحتاج الهيدروجيل حوالي 3 دقيقة لترسيخ بسبب درجة حرارة الجسم.
  11. ضع المستلم في قفص نظيف وابق دافئًا باستخدام وسادة حرارية. استمر في المراقبة حتى يتعافى المستلم تمامًا ويبدأ في التحرك بشكل مستقل. ثم إدارة 0.03 ملغ/مل Buprenorphine مع محلول مسيل فسيولوجي معقم داخل الصفاجذريا, وفقا لجرعة 0.1 ملغ/كغ.
  12. كرر الخطوات 2.3-2.11 لكل فأرة مستلم.
  13. قياس مستويات السكر في الدم غير الصيام من الفئران المتلقية (كما هو الحال في الخطوة 2.2) 3-4x في الأسبوع للشهر الأول، و 1x في الأسبوع بعد ذلك.
  14. في نهاية المتابعة (100 يوم بعد الزرع) ، تحت التخدير (الذي تم تنفيذه كما في الخطوة 2.3) يُخرج ISWAT الذي يحمل الكسب غير المشروع من المستلمين بعد الخطوات المعقمة الموصوفة في الخطوة 2.6. إصلاح الأنسجة في الفورمالين وparaformaldehyde وفقا للبروتوكولات النسيجية لهيماتوكسيلين وإيوسين (H & E) تلطيخ ومثبط اتمناج الأنسولين والجلوكاجون.
  15. إضافة السيفالوسبورين وإغلاق شق من المتلقين كما هو الحال في الخطوة 2.10، ثم الاستعداد للانتعاش كما هو الحال في الخطوة 2.11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتم إدخال إجراءين في هذا البروتوكول: إعداد الجزر المورين وزرع الجزر في موقع ISWAT. في الإجراء الأول ، بعد التجانب والهضم مع محلول الكولاجين من النوع الخامس ، والتنقية باستخدام Histopaque-1119 و Histopaque-1077 وخطوة إضافية لانتقاء اليد ، ستكون الجزر التورينة المعزولة نقية بما فيه الكفاية للزرع (كما هو موضح في الشكل 1)وسيتم استخدام الجزر المعزولة التي لديها قابلية صلاحية عالية للزرع (كما هو موضح في الشكل 2). في الإجراء الثاني ، يكون تحريض مرض السكري مع مادة STZ الكيميائية أمرًا بالغ الأهمية. تعتمد الجرعة المثلى من STZ على سلالة الماوس والعمر ، ويتم تعريف الحث الناجح لمرض السكري من خلال مستويات السكر في الدم غير السريعة لأكثر من 16.7 ملليمول / لتر في نفس الوقت في يومين متتاليين. يمكن للفئران السكري البقاء على قيد الحياة دون زرع الجزر لبضعة أسابيع. يجب أن يتم خلط الطعوم بشكل كامل مع الهيدروجيل قبل زرعها في موقع ISWAT ، وتحتاج بضع دقائق إلى تمرير الطعوم ليتم إصلاحها في IWSAT(الشكل 3). عند زرعها في ISWAT ، عكست الطعوم الإسلاطية فرط السكر في الدم لمدة شهر واحد ، وزاد وزن جسم الفئران المتلقية تدريجيًا(الشكل 4). في 100 يوما بعد زرع، تم استرداد الطعوم الجزر لتحليل الHISTOLOGICAL(الشكل 5). كما هو مبين في الشكل 4، ارتفع الدم غير الصيام في ~ 10 صباحا في أيام الاختبار بسرعة بعد إزالة الطعوم. وقد أظهرت تلطيخ H&E أن الطعوم التي تُزرع في السُيب ظلت سليمة. أظهر تلطيخ الأنسولين والغلوكاجون المناعي للجزر المزروعة تعمل بشكل جيد(الشكل 5).

Figure 1
الشكل 1: تقحام البنكرياس والهضم وتنقية الإسبليس. (أ)عملية التروية البنكرياس(A1A6). (ب)نقطة النهاية لهضم البنكرياس، مع الجسيمات المعلقة. (C)الجزر النقية التي لوحظت تحت المجهر الضوئي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: نقاء وقابلية بقاء الجزر المنقى. (أ)نقاء الزُيب يحددها تلطيخ dithizone. إمكانية صلاحية الهيئة التي تم تقييمها بواسطة تلطيخ مزدوج من قبل إدارة الأغذية والعقاقير-PI. (ب)صورة المجهر الخفيفة من الجزر. (C)ادارة الاغذية والعقاقير تلطيخ يظهر خلايا قابلة للحياة باللون الأخضر. (D)PI الفلورسينس الأحمر يشير إلى الخلايا الميتة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: زرع الجزر. (أ)بعد التخدير، قم بحلاقة الشعر في موقع الزرع بشفرة حلاقة وأصلح الأطراف المتلقية في وضع ية البطن التصاعدية بشريط جراحي. (ب)بعد عملية التنظير، يتعرض موقع زراعة الخلايا الإسواتة. (ج)يتم زرع الجزر المختلطة في هيدروجيل ببطء في موقع ISWAT. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: مستويات السكر في الدم وزراعة ما بعد الزرع في وزن الجسم. مستويات السكر في الدم غير الصائمة (الخط الأحمر) وأوزان الجسم (الخط الأزرق) للفئران المتلقية المزروعة بالجزر المتجانسة (n = 7). يشير السهم الأسود إلى أن الطعوم تمت إزالتها بعد 100 يوم من زرعها. ولوحظت بعض الاختلافات في مستويات السكر في الدم مقارنة مختلف المتلقين، مما يعكس الاختلافات في نوعية ووظيفة الزلاق. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: علم الأنسجة والفلور المناعي. كانت أقسام الكسب غير المشروع ملطخة بـ H & E ، DAPI (النوى) ، الأجسام المضادة للأنسولين المضادة للفأرة ، والأجسام المضادة المضادة للغلوكاغون المضادة للفأرة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

زرع البنكرياس الجسّة هو علاج واعد لعلاج T1DM. يتأثر تأثير هذا العلاج بالعديد من العوامل واختيار موقع مثالي لزرع الزلاق أمر مهم للغاية. يجب أن يكون الموقع التشريحي المثالي لزرع الجزلات الخصائص التالية: إمكانية الوصول إلى عمليات الزرع البسيطة والخزعة وإجراءات استرجاع الكسب غير المشروع؛ انخفاض المضاعفات؛ ارتفاع معدل النجاح في السيطرة على السكر في الدم؛ والبقاء على قيد الحياة على المدى الطويل من الطعوم الجزيرة15،16.

وصف فريقنا سابقًا بروتوكولًا لزراعة الجزل في الأوم في نموذج مورين17. في الأومنتوم ، تم تحقيق جلوكوز الدم الطبيعي في وقت لاحق مقارنة بزرع الجزر تحت كبسولة الكلى. ونتيجة لذلك، تم استكشاف مواقع أخرى لزرع الجزر.

تم الإبلاغ عن ISWAT كموقع بديل للكبد ، حيث يحتاج إلى عدد أقل من الجزر لعكس ارتفاع السكر في الدم من المستلمين مقارنة بالزرع في الكبد14. وعلاوة على ذلك ، فإن زرع الجزر أمر سهل ، كما هو تصور واسترجاع الطعوم14. في دراستنا، خفضت الفئران المتلقية ارتفاع السكر في الدم في غضون شهر واحد بعد زرع الجزر، مما يشير إلى أن ISWAT يتطلب وقتا أطول من كبسولة الكلى لإنتاج الأنسولين كافية. ولذلك تشير هذه النتائج إلى أن موقع ISWAT قد لا يوفر ظروفًا أفضل لنشر الأكسجين والمواد المغذية وإعادة الأوعية الدموية للطعم.

النقاء والنشاط العالي من الجزر المعزولة هي ذات أهمية حيوية لعكس ارتفاع السكر في الدم من المتلقين لمرضى السكري في إعداد زرع allo-islet، وبروتوكولات العزل جزيرة ليست هي نفسها بين مختلف الباحثين18،19،20. وقت الهضم أمر بالغ الأهمية للحصول على الجزر ذات جودة عالية. في تجربتنا ، يجب ألا تتجاوز 5 دقيقة. يمكن استزراع الجزر المعزولة في حاضنة 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها للسماح بالشفاء من الإجهاد الميكانيكي لإجراء الهضم21.

الهيدروجيل المستخدمة هنا هو مصفوفة غشاء الطابق السفلي الذي يحتوي على اللامينين، والكولاجين الرابع، وعوامل النمو17. فإنه يقوي عندما تصل إلى درجة حرارة الجسم ويساعد على الحفاظ على الطعوم إيسليت في موقع ISWAT. في حين أنها ليست سامة للجزر الصغيرة، ما إذا كان وجود الهيدروجيل يؤثر على تطعيم الجزر ووظيفة لا يزال يتعين تحديدها.

تؤخذ بشكل جماعي، وISWAT هو الفضاء تحت الجلد رواية لزرع الجزر في نماذج القوارض ويحتمل للاستخدام السريري. لإجراء تقييم كامل، يلزم إجراء دراسات إضافية باستخدام نماذج الثدييات الأكبر قبل السريرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يبلغ المؤلفون عن أي تضارب في المصالح.

   

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من خلال منح من البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2017YFC1103704) صناديق خاصة لبناء مستشفيات عالية المستوى في مقاطعة قوانغدونغ (2019)، مشروع سانمينغ للطب في شنتشن (SZSM201412020)، صندوق المستوى العالي بناء الانضباط الطبي في شنتشن (2016031638)، مؤسسة شنتشن للعلوم والتكنولوجيا (JCJY20160229204849975، GJHZ20170314171357556)، مؤسسة شنتشن للجنة الصحة وتنظيم الأسرة (SZXJ2017021SZXJ2018059)، طبي مؤسسة البحث العلمي في مقاطعة قوانغدونغ الصينية (A2019218)، المؤسسة الصينية لعلوم ما بعد الدكتوراه (2018M633218).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm Syringe-driven Filter Unit Merck Millipore SLHV033RB
1.5 mL centrifuge tube Axygen MCT-150-C
5 mL Pasteur pipette JingAn Biological, China J00085
5 mL syringe Szboon, China 20170829
50 mL conical tube Corning 430829
5-0 surgical suture sh-Jinhuan, China CR537
60 mL syringe Szboon, China 20170623
75% Ethanol LIRCON, China 9180527
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG(H+L) Invitrogen A21202 Dilution (1:200)
anti-mouse Glucagon antibody Abcam ab10988 Dilution (1:100)
anti-mouse insulin antibody Cell Signaling Technology 3014s Dilution (1:100)
blunt-pointed perfusion needle Oloey, China 005 32G, yellow
BSA Meilune, China MB4219
C57BL/6 Mice Medical Animal Center of Guangdong Province 8~10 weeks
cell culture dish BIOFIL, China TCD000100 General,Non-treated,87.8 mm diameter
centrifuge Thermo Scientific ST16R
cephalosporin Lukang medical, China 150303
CMRL-1066 Sigma-Aldrich C0422
Codos Pet Clipper Szcodos, China CP-8000
collagenase Type V Sigma C9262
DAPI Thermo Fisher D1306
D-hank's buffer Coolaber, China PM5140-10
dithizone Sigma-Aldrich D5130
Dnase I Sigma-Aldrich D4263
Eosin staining media Beyotime Biotech, China C0109
FBS GE Healthcare Life Sciences SH30084
fluorescein diacetate (FDA) Thermo Fisher F1303
fluorescent microscope Leica DMIL
gel-loading pipet tips Corning CLS4884
HBSS Coolaber, China PM5150-10
hematoxylin staining media Cell Signaling Technology 14166S
HISTOPAQUE-1077 Sigma-Aldrich RNBG0522
HISTOPAQUE-1119 Sigma-Aldrich RNBG0536
Hydrogel BD Biosciences 356234 Basement Membrane Matrix
Iodophor LIRCON, China 5190313
light-tight culture dish DVS, China AN-5058548 self-made, glass dish sprayed with black paint
Medical Adhesive Tape Cofoe, China K12001
non-invasive microtweezers RWD Life Science F11033-11 and F12016-15
One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system Johnson & Johnson 33391713
ophthalmic scissors RWD Life Science S12012-12 and S11001-08
P/S (penicillin / streptomycin) Gibco 15140-122
pentobarbital sodium Sigma-Aldrich P-010
Propidium iodide Sigma-Aldrich P4864
STZ (streptozotocin) Sigma-Aldrich S0130
Test Strip GenUltimate 100-50
TRITC-conjugated Goat anti-Rabbit IgG(H+L) proteintech SA00007-2 Dilution (1:200)
vascular clamp RWD Life Science R31006-04

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cho, N. H., et al. IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
  2. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. New England Journal of Medicine. 343, (4), 230-238 (2000).
  3. McCall, M., Shapiro, A. M. Update on islet transplantation. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2, (7), 007823 (2012).
  4. Pathak, V., Pathak, N. M., O'Neill, C. L., Guduric-Fuchs, J., Medina, R. J. Therapies for Type 1 Diabetes: Current Scenario and Future Perspectives. Clinical Medicine Insights: Endocrinology and Diabetes. 12, 1179551419844521 (2019).
  5. Bottino, R., Knoll, M. F., Knoll, C. A., Bertera, S., Trucco, M. M. The Future of Islet Transplantation Is Now. Frontiers in Medicine (Lausanne). 5, 202 (2018).
  6. Stokes, R. A., et al. Transplantation sites for human and murine islets. Diabetologia. 60, (10), 1961-1971 (2017).
  7. van der Windt, D. J., Echeverri, G. J., Ijzermans, J. N., Cooper, D. K. The choice of anatomical site for islet transplantation. Cell Transplantation. 17, (9), 1005-1014 (2008).
  8. Addison, P., Fatakhova, K., Rodriguez Rilo, H. L. Considerations for an Alternative Site of Islet Cell Transplantation. Journal of Diabetes Science and Technology. (2019).
  9. Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. Clinical islet transplantation: is the future finally now. Current Opinion in Organ Transplantation. 23, (4), 428-439 (2018).
  10. Bellin, M. D., et al. Similar islet function in islet allotransplant and autotransplant recipients, despite lower islet mass in autotransplants. Transplantation. 91, (3), 367-372 (2011).
  11. Bruni, A., Gala-Lopez, B., Pepper, A. R., Abualhassan, N. S., Shapiro, A. J. Islet cell transplantation for the treatment of type 1 diabetes: recent advances and future challenges. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 7, 211-223 (2014).
  12. Smood, B., Bottino, R., Hara, H., Cooper, D. K. C. Is the renal subcapsular space the preferred site for clinical porcine islet xenotransplantation? Review article. International Journal of Surgery and Medicine. 69, 100-107 (2019).
  13. Luan, N. M., Iwata, H. Long-term allogeneic islet graft survival in prevascularized subcutaneous sites without immunosuppressive treatment. American Journal of Transplantation. 14, (7), 1533-1542 (2014).
  14. Yasunami, Y., et al. A Novel Subcutaneous Site of Islet Transplantation Superior to the Liver. Transplantation. 102, (6), 945-952 (2018).
  15. Rajab, A. Islet transplantation: alternative sites. Current Diabetes Reports. 10, (5), 332-337 (2010).
  16. Ekser, B., Vagefi, P. A. Search for the best site in islet xenotransplantation. International Journal of Surgery and Medicine. 70, 106-107 (2019).
  17. Lu, Y., et al. A Method for Islet Transplantation to the Omentum in Mouse. Journal of Visualized Experiments. (143), e57160 (2019).
  18. Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of Visualized Experiments. (88), e50374 (2014).
  19. Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments. (50), e2096 (2011).
  20. Khatri, R., Hussmann, B., Rawat, D., Gurol, A. O., Linn, T. Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model. Journal of Visualized Experiments. (135), e57559 (2018).
  21. Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics