Cuantificación de los niveles de etanol en embriones de pez cebra mediante cromatografía de gases del espacio de cabeza

Developmental Biology

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Summary

Este trabajo describe un protocolo para cuantificar los niveles de etanol en un embrión de pez cebra utilizando cromatografía de gases del espacio de la cabeza a partir de métodos de exposición adecuados para el procesamiento de embriones y el análisis de etanol.

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Lovely, C. B. Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography. J. Vis. Exp. (156), e60766, doi:10.3791/60766 (2020).

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Abstract

Los Trastornos del Espectro Alcohólico Fetal (TEAF) describen un continuo muy variable de defectos del desarrollo inducidos por etanol, incluyendo dismorfologías faciales y deficiencias neurológicas. Con una patología compleja, el TEAF afecta aproximadamente a 1 de cada 100 niños nacidos en los Estados Unidos cada año. Debido a la naturaleza altamente variable del FASD, los modelos animales han demostrado ser críticos en nuestra comprensión mecanicista actual de los defectos de desarrollo inducidos por etanol. Un número cada vez mayor de laboratorios se ha centrado en el uso de peces cebra para examinar defectos de desarrollo inducidos por etanol. Los peces cebra producen un gran número de embriones translúcidos, genéticamente traficados y fertilizados externamente. Esto permite a los investigadores controlar con precisión el tiempo y la dosis de la exposición al etanol en múltiples contextos genéticos y cuantificar el impacto de la exposición al etanol embrionario a través de técnicas de imagen en vivo. Esto, combinado con el alto grado de conservación tanto de la genética como del desarrollo con los seres humanos, ha demostrado que el pez cebra es un modelo potente en el que estudiar la base mecanicista de la teratogenicidad del etanol. Sin embargo, los regímenes de exposición al etanol han variado entre diferentes estudios de pez cebra, lo que ha confundido la interpretación de los datos del pez cebra a través de estos estudios. Este es un protocolo para cuantificar las concentraciones de etanol en embriones de pez cebra utilizando cromatografía de gases del espacio de la cabeza.

Introduction

Los Trastornos del Espectro Alcohólico Fetal (TEAF) describen una amplia gama de deficiencias neurológicas y dismorfologías craneofaciales asociadas con la exposición al etanol embrionario1. Múltiples factores, incluyendo el momento y la dosis de la exposición al etanol y los antecedentes genéticos, contribuyen a la variación del TEAF2,3. En los seres humanos, la compleja relación de estas variables hace que estudiar y entender la etiología del TEAF sea un reto. Los modelos animales han demostrado ser cruciales en el desarrollo de nuestra comprensión de la base mecanicista de la teratogenicidad del etanol. Se ha utilizado una amplia variedad de sistemas de modelos animales para estudiar múltiples aspectos del TEAF y los resultados han sido notablemente consistentes con lo que se encuentra en la exposición en humanos4. Los sistemas de modelos de roedores se utilizan para examinar muchos aspectos del FASD, siendo los ratones los5,6,7más comunes. La mayor parte de este trabajo se ha centrado en defectos de desarrollo a la exposición temprana al etanol8, aunque se ha demostrado que la exposición posterior al etanol causa anomalías en el desarrollo también9. Además, las capacidades genéticas de los ratones han ayudado en gran medida en nuestra capacidad de sondear los fundamentos genéticos del TEAF10,11. Estos estudios en ratones sugieren fuertemente que hay interacciones gene-etanol con la vía sónica de erizo, señalización de ácido retinoico, Superóxido dismutasa, óxido nítrico sintasa I, Aldh2 y Fancd28,10,11,12,13,14,15,16,17,18, 19,20,21. Estos estudios muestran que los modelos animales son fundamentales para avanzar en nuestra comprensión del TEAF y sus mecanismos subyacentes.

El pez cebra ha surgido como un potente sistema modelo para examinar muchos aspectos de la teratogénesis del etanol22,23. Debido a su fertilización externa, alta fecundidad, capacidad genética de tractificación y capacidad de imagen en vivo, el pez cebra es ideal para estudiar factores como el momento, la dosificación y la genética de la teratogénesis del etanol. El etanol se puede administrar a embriones escenificados con precisión y los embriones pueden ser imágenados para examinar el impacto directo del etanol durante los procesos de desarrollo. Este trabajo puede estar relacionado directamente con los seres humanos, ya que los programas genéticos de desarrollo están altamente conservados entre los peces cebra y los seres humanos y, por lo tanto, pueden ayudar a guiar los estudios en humanos del TEAF24. Mientras que el pez cebra se ha utilizado para examinar la teratogénesis del etanol, la falta de consenso en la notificación de concentraciones de etanol embrionario hace que la comparación con los seres humanos sea difícil25. En los sistemas de mamíferos, los niveles de alcohol en sangre se correlacionan directamente con los niveles de etanol tisular26. Muchos de los estudios de pez cebra tratan embriones antes de la formación completa de su sistema circulatorio. Sin una muestra materna que examinar, se requiere un proceso para evaluar las concentraciones de etanol para cuantificar los niveles de etanol dentro del embrión. Aquí describimos un proceso para cuantificar las concentraciones de etanol en un embrión de pez cebra en desarrollo utilizando cromatografía de gases del espacio de la cabeza.

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Protocol

Todos los embriones de pez cebra utilizados en este procedimiento fueron criados y criados siguiendo los protocolos establecidos de la IACUC27. Estos protocolos fueron aprobados por la Universidad de Texas en Austin y la Universidad de Louisville.

NOTA: La línea de pez cebra Tg(fli1:EGFP)y1 se utilizó en este estudio28. Toda el agua utilizada en este procedimiento es agua estéril de ósmosis inversa. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando Graphpad Prism v8.2.1.

1. Fabricación de medios embrionarios

  1. Para hacer un stock de 20x de medios embrionarios, disolver 17,5 g de NaCl, 0,75 g de KCl, 2,9 g de CaCl2, 0,41 g de K2HPO4, 0,142 g de NA2HPO4y 4,9 g de MgSO4x 7H2O en 1 L de agua. Ignora el precipitado blanco que se forma; esto no afectará a los medios de comunicación. Filtrar esterilizar la solución de stock y almacenar a 4 oC.
  2. Para crear la solución de medios embrionarios de trabajo, disolver 1,2 g de NaHCO3 en 1 L de 20x material de medios embrionarios y añadir 19 L de agua. Mantener la solución de medios embrionarios de trabajo a 28 oC.

2. Medición del volumen embrionario mediante desplazamiento de agua

NOTA: En este protocolo, se utilizan embriones de postfertilización (hpf) de 24 h (Figura 1). Los embriones utilizados en las mediciones de volumen no se utilizan en el análisis de etanol.

  1. Colocar 10 embriones y fluido extraembrionario en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml marcado a un volumen de 250 ml(Figura 2A). Añadir agua a la línea de llenado de 250 l (ver muestra con agua teñida en la Figura 2B).
  2. Repita el paso 2.1 para configurar receptáculos para embriones a los que se les hayan extirpado los coros.
    1. Para extraer el coro, coloque los embriones en sus coros en una placa Petri de 100 mm con 2 mg/ml de cóctel de proteasa en medios embrionarios a temperatura ambiente (RT) durante 10 min. Cada pocos minutos, gire suavemente los embriones para romper el coro.
    2. Una vez que todos los embriones estén libres de su coro, retire los embriones desconuados de los medios de cóctel/embrión proteasa y colóquelos en una nueva placa Petri de 100 mm con medios embrionarios frescos para lavar los embriones. Repita este paso de lavado 1 vez más (para un total de 2 lavados). Transfiera los embriones a una nueva placa Petri de 100 mm.
  3. Usando la punta más pequeña posible y sin dañar los embriones, retire cuidadosamente todo el líquido de alrededor de los embriones usando un micropipetador p200 (Figura 2C) y pese el agua con una escala con una precisión de <0.1 mg. Para determinar el volumen de la muestra de 10 embriones, reste el peso/volumen del agua (1 ml de agua a 1 g de agua.) extraída de 250 ml. Para determinar el volumen de un solo embrión, divida la diferencia entre 250 ml y el peso del agua eliminada por 10.

Equation 1

Equation 2

3. Tratamiento de embriones con etanol

  1. Reúna embriones de tanques de apareamiento y colóquelos en una placa Petri estándar de 100 mm. No cuente más de 100 embriones por plato de Petri individual e incubar a 28,5 oC.
    NOTA: Si se va a retirar el coro (paso 2.2), es necesario retirarlo antes de añadir etanol.
  2. A 6 hpf, agregue hasta 100 embriones a una nueva placa Petri estándar de 100 mm, ya sea con medios embrionarios o medios embrionarios + 1% de etanol (v/v). Cubra, pero NO selle el plato Petri. Colocar los embriones en una incubadora de baja temperatura a 28,5 oC durante 18 h, o hasta que los embriones alcancen el punto de tiempo de desarrollo de 24 cv.

4. Preparación del flujo de trabajo antes de procesar los embriones para la cromatografía de gases del espacio de la cabeza

  1. Hacer una solución de 5 M NaCl en agua (se necesitarán 450 l por tubo de muestra) para desnaturalizar todas las proteínas y prevenir el metabolismo del etanol. Hacer el cóctel de proteasa(Tabla de Materiales)a una concentración de 2 mg/ml en medios embrionarios.
  2. Etiquete un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y un vial de cromatógrafo de gases de 2 ml para cada muestra. Etiquete viales de cromatógrafo de gas de 2 ml adicionales para las normas de etanol descritas a continuación, así como aire, agua y los espacios en blanco de cóctel es 5 M NaCl/proteasa.
  3. Configurar tres micropipetadores p200 dos ajustados a 50 l, y el tercero se establece en 200 l; un micropipetador p1000 ajustado a 450 l y un micropipetador p2 ajustado a 2 l. Para las pipetas de vidrio utilizadas para transferir embriones de los platos De Petri a los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, pase rápidamente la punta de la pipeta a través de una llama para suavizar los bordes para no dañar los embriones al llevarlos a la pipeta.

5. Procesamiento de embriones para cromatografía de gases del espacio de la cabeza

NOTA: Tanto los embriones en sus coros como los previamente retirados de sus coros son tratados de la misma manera para la consistencia en el cálculo de los factores de dilución.

  1. Usando los dos micropipetores p200 ajustados a 50 l, dibuje 50 ml de la solución de cóctel de proteasa en uno y extraiga 50 ml de agua en el segundo.
  2. Con la pipeta de vidrio y el micropipetador, coloque rápidamente 10 embriones (del paso 3.2) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y cierre la tapa (como se describe en la Figura 2A). Repita el procedimiento para que se prueben todas las muestras, controles y embriones tratados con etanol.
  3. Usando el micropipetador p200 ajustado a 200 l, abra rápidamente la tapa y retire todos los medios embrionarios residuales (como se describe en la Figura 2C). Coloque rápidamente la pipeta que contiene 50 ml de agua en el tubo y rápida pero suavemente (para no dañar los embriones) agregue, luego retire el agua. Agregue rápidamente 50 l de la solución de cóctel de proteasa desde el pipeteador en espera y cierre la tapa del tubo(Figura 2D).
    NOTA: Realice este proceso de una muestra a la vez.
  4. Deje que la muestra se sente a RT durante 10 minutos para permitir que el cóctel de proteasa degrade el coro. A continuación, agregue rápidamente 450 l de 5 M de NaCl y cierre la tapa del tubo(Figura 2E). Vortex las muestras durante 10 min. Para acelerar el proceso, configure el mezclador para vórtice varias muestras al mismo tiempo.
    NOTA: Agregue una pequeña cantidad (-100 l) de una mezcla de perlas de sílice (2 tamaños, 0,5 mm y 1 mm de perla) a cualquier tubo con embriones de más de 24 hpf. En embriones más antiguos, el notochord permanecerá intacto independientemente de cuánto tiempo estén homogeneizados.
  5. Después de homogeneizar durante 10 min, retire rápidamente 2 ml de sobrenadante embrionario homogeneizado y agréguelo a un vial de cromatógrafo de gases. Selle rápidamente el vial con la tapa de politetrafluoroetileno.

6. Preparación de los medios y las normas de etanol

  1. Para preparar los estándares de los medios, diluir los medios por un factor de 10 con una solución de cóctel de 5 M NaCl/proteasa. Añadir 2 ml de cada muestra a un vial de cromatógrafo de gases y sellar con una tapa de politetrafluoroetileno.
  2. Para preparar las normas de etanol, cree una dilución en serie de etanol 100% en solución de cóctel NaCl/proteasa de 5 M a las siguientes concentraciones: 0.3125, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 y 40 mM. Añadir 2 ml de cada estándar a un vial de cromatógrafo de gases y sellar con una tapa de politetrafluoroetileno.

7. Preparación del cromatógrafo de gases del espacio de la cabeza

NOTA: Es posible que sea necesario cambiar esta configuración y protocolo en función del cromatógrafo de gases utilizado. La cromatografía de gases del espacio de la cabeza se utiliza para cuantificar los niveles de etanol, no para la separación.

  1. Ajuste el calentador para el muestreador automático a 58 oC y enciéndalo. Permita que el calentador alcance los 58 oC y encienda las líneas de gas de aire e hidrógeno que alimentan el cromatógrafo de gases (para la ionización de llamas utilizada para cuantificar el etanol).
    NOTA: La psi debe ajustarse para que funcione correctamente el cromatógrafo de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Asegúrese de que la línea de helio esté encendida y configurada en la psi adecuada.
  2. Para el tabique, asegúrese de que el número de muestras inyectadas no es >100. Para la fibra de inyección, asegúrese de que el número de muestras inyectadas no es >500.
    NOTA: Si cualquiera de ellos supera la cantidad de inyecciones, deberá cambiarse antes de ejecutar las muestras de prueba.
  3. Encienda el software de análisis y asegúrese de que la estación de trabajo esté configurada correctamente. Almacene todos los datos de acuerdo con los estándares de laboratorio/departamento. Cree una nueva lista de ejemplo para los ejemplos que se van a ejecutar.
  4. Inicie el método de arranque y espere a que el detector de ionización de llama se estabilice antes de ejecutar las muestras. Una vez estable, ejecute el método de inicio del software para limpiar la fibra.

8. Mediciones de muestras mediante cromatografía de gases del espacio de la cabeza

  1. Una vez completado el método de inicio, cree 1 nueva línea por muestra en la lista de ejemplo. Desde el menú de métodos del software de análisis, carga 436 Actual spme ethanol 2013 3min absorb2_5min rg run. METH para cada muestra de la lista de muestras.
    1. Rellene la lista de muestras, comenzando con el aire, el agua, 5 M NaCl/proteasa de cócteles en blanco. A continuación, introduzca las normas en orden, de 0.3125 a 40 mM. Siga las normas con una segunda ronda de aire, agua y 5 M NaCl/proteasse cócteles en blanco.
    2. Introduzca todas las muestras de sobrenadantes embrionarios homogeneizados que se van a probar, desde la concentración de etanol pronosticada más baja hasta la más alta. Termine entrando en una tercera y última ronda del aire, el agua y 5 M NaCl/proteasa de cócteles en blanco.
  2. Añada los viales de cromatógrafo de gases al muestreador automático en el orden en que se introdujeron las muestras. Deje que las muestras se calienten durante 10-15 min. Inicie las ejecuciones de la muestra en el software.
  3. Después de que se hayan ejecutado todas las muestras y los espacios en blanco finales, active el método de apagado en el software agregando una muestra final en la lista de muestras y ejecutando standby. METH. Realice una copia de seguridad de todos los datos adquiridos durante las ejecuciones de ejemplo. Apague el equipo en el siguiente orden: calentador de automuestrador, tanque de hidrógeno y, sólo después de que la temperatura del cromatógrafo alcance los 30 oC, el tanque de aire. Deje el tanque de helio encendido para preservar la columna de cera.

9. Integración del pico de etanol de muestra sin salida y análisis de concentración de muestras

NOTA: Todos los valores de 9.3 en fueron calculados en un archivo de Excel que todas las ecuaciones se rellenaron previamente.

  1. Una vez completado el método de apagado, haga clic en Abrir cromatograma. Abra la carpeta que contiene los resultados. Las muestras se integran automáticamente en este programa.
  2. En los resultados, asegúrese de que se han integrado los picos correctos (picos de etanol entre 2 y 2,5). Una vez confirmadas todas las muestras, imprima o exporte los resultados.
  3. Trazar la altura máxima de los estándares de etanol en un gráfico. Calcule los valores de pendiente, intercepción Y y R2 para los estándares de etanol (R2 debe ser >0,99).
    NOTA: Estos valores se utilizarán para determinar la concentración de etanol a partir de la altura máxima de la muestra.
  4. Para cada muestra, reste la altura máxima de la muestra de la interceptación Y de los estándares de etanol. Divida este valor por la pendiente de las normas de etanol para obtener el valor de etanol para cada muestra en los viales GC.

Equation 3

  1. Para calcular la concentración de etanol en los embriones, primero calcule el factor de dilución para cada muestra. Tome la medida de volumen calculada en el paso 2.3 de este protocolo y divídala por la medida de volumen más 500 l. Esto representa la solución de cóctel de 5 M NaCl/proteasa añadida a cada muestra durante el procesamiento de embriones (pasos 5.3 y 5.4).

Equation 4

  1. Utilizando este factor de dilución de muestra, multiplique por el valor de etanol de muestra para cada muestra. Los resultados serán en concentración de mM. Calcule las muestras de referencia de medios multiplicando el valor de etanol de medios por el factor de dilución de 10.

Equation 5

Equation 6

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Representative Results

Los niveles de etanol en sangre no se pueden determinar en los primeros peces cebra embrionarios, porque carecen de un sistema circulatorio completamente formado. Para determinar el nivel de concentración de etanol en los embriones de pez cebra, los niveles de etanol se miden directamente a partir del tejido embrionario homogeneizado. Para medir adecuadamente las concentraciones de etanol embrionario, debe tenerse en cuenta el volumen embrionario. El embrión (yema unida) se encuentra dentro del coro (cáscara de huevo) rodeado de líquido extraembrionario(Figura 1). Cualquier medida de volumen del embrión debe hacerse en embriones en el momento de la exposición, porque el volumen embrionario cambiará con el tiempo de desarrollo a medida que el embrión aumente de tamaño. Además, hay que tener en cuenta la forma en que se procesa el embrión, así como el volumen embrionario, ya que ambos elementos crean factores de dilución utilizados para calcular los niveles de etanol embrionario.

Debido a que el embrión no es una esfera perfecta, especialmente después de 10 hpf, el desplazamiento del agua se utilizó para evaluar el volumen embrionario. Este estudio utilizó embriones a 24 hpf. Se midió el volumen de embriones tanto en su coro como en los extraídos de su coro. Estos volúmenes fueron de 1,97 (a 0,4 SD) para el embrión con fluido extraembrionario, y 1,1 (0,22 SD) para el embrión solo(Tabla 1). Esta diferencia entre el embrión con fluido extraembrionario y el embrión por sí solo es el volumen del fluido extraembrionario, que rodea el embrión dentro del coro(Figura 1). Esta diferencia es fundamental para determinar la concentración de etanol del embrión solo en las muestras. A partir del análisis, el embrión comprendía el 56% del volumen total del embrión con líquido extraembrionario dentro del coro(Tabla 1). A medida que el embrión creció, el volumen embrionario aumentó con el tiempo, lo que resultó en una disminución en el volumen del fluido extraembrionario25. Al medir las concentraciones de etanol de embriones aún en su coro, debe tenerse en cuenta el contenido de agua tanto en el embrión como en el líquido extraembrionario.

El trabajo publicado anteriormente ha demostrado que la fracción de agua en el embrión es del 73,6%29. Este resultado se obtuvo utilizando una combinación de medidas de volumen, espectroscopia de resonancia de espín de electrones y microscopía de resonancia magnética. Para confirmar este resultado, los embriones se pesaron solos antes y después de hornear a 70 oC, como se describió anteriormente25. Este proceso elimina toda el agua del embrión. El cambio de peso representa la cantidad de agua en el embrión. A partir de este análisis, un embrión de 24 hpf contenía un 72% de agua, mientras que un embrión de 48 hpf contenía un 76%. Ambos valores son extremadamente similares al volumen de agua embrionario del 73,6% calculado anteriormente29. Esto sugiere que el volumen de agua del embrión cambia poco a lo largo del desarrollo temprano.

Sobre la base del trabajo publicado utilizando múltiples enfoques para calcular el volumen de agua en el embrión, el 73,6% se utilizó como contenido de agua embrionaria para todos los análisis presentados. Esto dio lugar a un agua que comprende 0,82 ml de los 1,1 ml de volumen embrionario (Tabla 1). A partir de esto, el volumen del fluido extraembrónico se calculó como 0,86 l. Del volumen total de agua del embrión con fluido extraembrionario, el 49% está contenido en el embrión y el 51% está en el fluido extraembrionario(Tabla 1).

Para el análisis de cromatografía de gases, sólo se utilizaron 24 embriones hpf todavía en su coro(Figura 1). En este régimen de etanol, los embriones fueron tratados con una concentración de medios de etanol del 1% (171 mM) de 6 a 24 hpf, aunque se pueden utilizar diferentes concentraciones de etanol y ventanas de tiempo de exposición dependiendo del diseño experimental. Se analizaron dos grupos de 15 muestras (10 embriones por muestra) y los medios con los que fueron tratados durante 2 días experimentales diferentes(Tabla 2). Los niveles de medios pueden variar de un experimento a un experimento. Para ello, los niveles de etanol de los medios de comunicación se midieron 5 veces por grupo experimental. En este análisis, los niveles de medios fueron de 143,6 mM para el grupo 1 y 133,6 mM para el grupo 2. Estos valores son significativamente diferentes mediante una prueba t no emparejada (p a 0.0002). Los embriones con fluido extraembrónico promediaron 63,5 mM y 53,1 mM para los grupos 1 y 2, respectivamente. Sin embargo, la concentración no fue significativamente diferente entre los 2 grupos de embriones con líquido extraembrionario (prueba t no emparejada, p a 0,07). Los embriones de control no tratados se midieron a 0 mM. Debido a la variación en los niveles de medios, se calculó una proporción de niveles de etanol/concentración de etanol embrionario para cada muestra. El grupo 1 tenía el 44% de los niveles de etanol de los medios, mientras que el grupo 2 tenía el 40% de los niveles de etanol de los medios(Figura 3 y Tabla 2).

Figure 1
Figura 1: Una imagen de un embrión a 24 h de postfertilización (hpf) dentro del coro. El embrión y la yema están rodeados por el líquido extraembrionario, todos ubicados dentro del coro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Protocolo para medir el volumen embrionario y procesar los embriones para su análisis. (A) Diez embriones de 24 hpf transferidos a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml marcado en un volumen de 250 ml. (B) El tubo de microcentrífuga con embriones llenos de agua (el agua se titula para que sea más fácil de ver en la marca de 250 l). (C) Toda el agua se retira del tubo y se pesa. (D) Diez embriones transferidos a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. El agua se retiró como en (C) y se reemplazó con 50 l de cóctel de proteasa. (E) Después de 10 min, se añadieron 450 ml de NaCl de 5 M al tubo desde (D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Caja y bigote de la relación de concentración de etanol de muestras a medios. La concentración de etanol para cada grupo se dividió por la media de las muestras de medios de ese grupo. El grupo 1 contenía el 44% de los niveles de medios, mientras que el grupo 2 contenía el 40%. En ambos grupos, n a 15; 10 embriones por muestra. Los grupos se compararon utilizando un ANOVA unidireccional con el análisis post hoc de un Tukey (****p < 0.0001). Los bigotes representan de mínimo a máximo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Volúmenes de agua de embriones y embriones + extraembriones (L)
Aguaa
Volumen totalb % del volumen total (V) Volumen embrionario (W) Volumen extraembrionario (X) % de agua en Embryo (Y) % agua en extraembrionión (Z)
Embryo + Extraembrionario (EE)c 1,97 á 0,4
Embryo 24 hpf (E)c 1,11 a 0,22 56% 0.82 0.86 49% 51%
Cálculos
V Embryo % del volumen total - Volumen total de E - Volumen total de EE
W Volumen de Agua Embrionaria - V - 73,6%
X Volumen de agua extraembrionario - W – Volumen total de EE
Y% de agua en Embryo (W + X)/W á 100
Z% de agua en extraembrionario s 100 – Y
a El volumen de agua embrionaria se calculó a partir de Hagedorn et al.29.
b Los valores se notifican como desviación estándar (SD).
cn a 13; 10 embriones por muestra

Tabla 1: Cálculo del volumen de agua para los embriones con fluido extraembrionario. El volumen se calculó a partir de 13 muestras (10 embriones por muestra) a partir de 24 embriones hpf con líquido extraembrionario todavía en el coro y embriones extraídos de su coro. Los valores se notifican como la media de SD.

Etanol Concentración de embriones y medios (mM)a
Grupo 1 Grupo 2 Combinado
Medios (M)b 143,6 a 2,3 133,6 a 2,7 138,6 a 5,8
Embryo + Extraembrionario (EE)c 63,5 a 17,1 53,1 a 12,6 58,3 a 15,7
Relación de etanol - embrión a medios (1) 0,44 a 0,12 0,40 a 0,09 0,42 á 0,11
Cálculos
1 Relación de etanol - EE - M
a Los valores se notifican como SD.
bn a 5
cn a 15; 10 embriones por muestra
d Los valores son el promedio de los grupos 1 y 2.

Tabla 2: Cálculos de la concentración de etanol en embriones con fluido y medios extraembrionarios (mM). Las muestras de medios fueron medidas directas de los medios de comunicación (n 5 por grupo). La concentración de etanol embrionario se calculó a partir de 15 muestras (10 embriones por muestra) a partir de 24 embriones hpf con líquido extraembrionario. Se calculó la relación entre las concentraciones de etanol de los embriones con fluido extraembrionario y medios. Los valores se notifican como la media de SD.

Cálculo del etanol en el embrióna,b
Embryo (Y) Relación con los medios (Z)
32,7 x 8,8 mM 0,24 á 0,06
Cálculos
Y Etanol embrionario a 58,3 mM (Tabla 2) a 56% (Tabla 1)
Z Relación de etanol a Y a 138,6 mM (Tabla 2)
a Los valores son el promedio de los grupos 1 y 2.
b Los valores se notifican como SD.

Tabla 3: Cálculo del etanol en el embrión. La concentración de etanol embrionario se calculó como el 56% de la concentración total de etanol del embrión con líquido extraembrionario. Esto fue reportado entonces como una proporción de embrión a medios. Los valores se notifican como la media de SD.

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Discussion

Como sistema de modelo de desarrollo, el pez cebra es ideal para estudiar el impacto de los factores ambientales en el desarrollo. Producen un gran número de embriones fertilizados externamente, lo que permite paradigmas precisos de sincronización y dosificación en estudios de etanol. Esto, combinado con las capacidades de imagen en vivo y la conservación genética y del desarrollo con los seres humanos, hacen del pez cebra un poderoso sistema modelo para estudios de teratología. Descrito es un protocolo para medir las concentraciones de etanol embrionario en el desarrollo de embriones de pez cebra utilizando cromatografía de gases del espacio de la cabeza.

Determinar la concentración de etanol embrionario es fundamental para comprender el impacto del etanol en el embrión en desarrollo. En los modelos de roedores, las concentraciones de etanol en sangre se correlacionan con las concentraciones tisulares26. Sin embargo, no es posible evaluar los niveles de etanol en sangre en el desarrollo embrionario temprano en un pez cebra. La cromatografía de gases espaciales se ha utilizado para medir los niveles de etanol en diversos paradigmas experimentales, incluyendo pez cebra25,30,31,32,33,34,35. Sin embargo, este protocolo se puede utilizar para medir muchos factores ambientales diferentes, a pesar de que la volatilidad de estos diversos factores debe ser lo suficientemente alta como para medir cuantitativamente y una columna de cromatógrafo de gases debe elegirse en función de la polaridad de los compuestos en cuestión. Además, el pez cebra es el más adecuado para estudiar el impacto de los factores solubles en agua, ya que la exposición a factores hidrófobos es extremadamente difícil de analizar en los peces.

Este protocolo permitirá a los investigadores evaluar directamente las concentraciones de etanol en embriones de pez cebra. Sin embargo, deben abordarse varios factores para garantizar mediciones precisas de las concentraciones de etanol embrionario. Debido a que se midieron los niveles de etanol en el total de tejidos embrionarios, se tuvo que considerar el volumen embrionario. Después de 10 hpf el embrión comienza la somitogénesis (formación de somitas) y ya no es una esfera(Figura 1). Para evaluar el volumen embrionario, se utilizó el desplazamiento del agua en 10 embriones agrupados por muestra. Cada muestra consistía en 10 embriones por dos razones: en primer lugar, para reducir el error de pipeteo de volúmenes pequeños, y en segundo lugar, para promediar pequeñas fluctuaciones en los volúmenes de embriones. Al medir el volumen embrionario, es importante tener en cuenta la precisión del pipeteo y el pesaje. Incluso el uso de 10 embriones por muestra se encuentra en el límite inferior de precisión tanto para las pipetas como para la báscula utilizada para pesar los embriones. Con el equipo disponible, el uso de menos de 10 embriones habría afectado a los análisis. Esto no limita a los investigadores a utilizar menos embriones por muestra, siempre y cuando se considere la precisión del equipo.

El volumen embrionario es un factor que afecta al análisis de muestras. Un segundo factor clave es la velocidad de procesamiento embrionario, porque el etanol es volátil. Además, el etanol se equilibra rápidamente en múltiples estudios en animales25,36,37. Nuestro protocolo de lavado está diseñado para eliminar rápidamente cualquier etanol que se adhiera a la superficie exterior del coro. En este estudio este protocolo de lavado no afectó a los niveles de etanol embrionario, aunque lavados más largos o múltiples podrían afectar a las concentraciones de etanol embrionario25,38. Sin embargo, un tercer factor a tener en cuenta es la dilución del volumen embrionario durante el procesamiento. Este protocolo utiliza un cóctel de proteasa para degradar el coro, así como 5 M NaCl para desnaturalizar todas las proteínas, incluidas las enzimas de procesamiento de alcohol.

Por último, se han descrito una serie de análisis y métodos de presentación de informes en una amplia variedad de estudios de peces cebra. Debido a la variación dentro de diferentes muestras de un estudio o la comparación de diferentes estudios, la notificación adecuada de la concentración de etanol es crítica25,38. Los métodos que utilizan medidas indirectas (normalmente enzimáticas) se basan en el análisis de un metabolito secundario. En ese caso, la tasa de actividad enzimática puede variar e impedir el análisis preciso de la concentración de etanol. Este método mide directamente los niveles de etanol, y las concentraciones de etanol se notifican como una relación entre las concentraciones de embriones y medios. Nuestros resultados están en línea con un creciente consenso de un embrión de 24 hpf que contiene el 30 % de las concentraciones de medios(Tabla 3)25,38,39,40. Sorprendentemente, esta concentración de etanol embrionario del 30% es independiente de la concentración de medios, y no se entiende bien lo que crea este equilibrio25,38. Los embriones de más de 24 hpf muestran disminuciones en las concentraciones de etanol, con 48 hpf embriones que contienen casi la mitad del contenido de etanol de un embrión de 24 hpf25. Sin embargo, nuestros resultados no determinan el equilibrio entre etanol y agua. Dada la velocidad a la que el etanol se equilibra, así como la volatilidad del etanol, es increíblemente difícil evaluar los cambios en el volumen de agua en el propio embrión debido a la exposición al etanol. Tratar de medir el volumen de una muestra de embrión tratada con etanol utilizando desplazamiento de agua dará lugar a la pérdida de etanol del embrión durante la medición. Utilizando métodos de microscopía y espectroscopia más precisos que los descritos anteriormente, puede ser posible determinar el equilibrio etanol-agua en un embrión midiendo directamente ambos al mismo tiempo.

En general, el protocolo descrito aquí es una poderosa herramienta con la que evaluar las concentraciones de etanol embrionario en el desarrollo de embriones de pez cebra. Esta información es fundamental para estandarizar los estudios de FASD utilizando peces cebra. La capacidad de controlar con precisión los paradigmas de tratamiento del etanol y cuantificar directamente las concentraciones de etanol embrionario fortalece la funcionalidad del modelo de pez cebra para estudios de TEAF humanos. En última instancia, este trabajo mejorará en gran medida nuestra comprensión del TEAF.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

La investigación presentada en este artículo fue apoyada por subvenciones previas de los Institutos Nacionales de Salud/Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial (NIH/NIDCR) R01DE020884 a J.K.E. y Institutos Nacionales de Salud/Instituto Nacional sobre Abuso de Alcohol y Alcoholismo (NIH/NIAAA) F32AA021320 a C.B.L. y por la subvención actual de los Institutos Nacionales de Salud/Instituto Nacional sobre Abuso de Alcohol (NIH/NIAAA) R00AA023560 a C.B.L. Agradecemos a Rueben Gonzales por proporcionar y ayudar con el análisis de cromatógrafo de gases. Agradecemos a Tiahna Ontiveros y a la Dra. Gina Nobles la asistencia para escribir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Air Provided by contract to the university
Analytical Balance VWR 10204-962
AutoSampler, CP-8400 Varian Gas Chromatograph Autosampler
Calcium Chloride VWR 97062-590
Ethanol Decon Labs 2701
Gas chromatograph vial with polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap 2 mL Agilent 8010-0198 Can reuse the vials after cleaning, but not the caps/septa
Gas Chromatograph, CP-3800 Varian
Helium Provided by contract to the university
HP Innowax capillary column Agilent 19095N-123I 30 m x 0.53 mm x 1.0 μm film thick
Hyrdogen Provided by contract to the university
Magnesium Sulfate (Heptahydrate) Fisher Scientific M63-500
Microcentrifuge tube 1.5 mL Fisher Scientific 2682002
Micropipette tips 10 μL Fisher Scientific 13611106
Micropipette tips 1000 μL Fisher Scientific 13611127
Micropipette tips 200 μL Fisher Scientific 13611112
Petri dishes 100 mm Fisher Scientific FB012924
Pipetman L p1000L Micropipette Gilson FA10006M
Pipetman L p200L Micropipette Gilson FA10005M
Pipetman L p2L Micropipette Gilson FA10001M
Polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap Agilent 5190-7021 Replacement caps/septa for gas chromatograph vials
Potassium Chloride Fisher Scientific P217-500
Potassium Phosphate (Dibasic) VWR BDH9266-500G
Pronase VWR 97062-916
Silica Beads .5 mm Biospec Products 11079105z
Silica Beads 1.0 mm Biospec Products 11079110z
Sodium Bicarbonate VWR BDH9280-500G
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-500
Sodium Phosphate (Dibasic) Fisher Scientific S374-500
Solid-phase microextraction fiber assembly Carboxen/Polydimethylsiloxane Millipore Sigma 57343-U Replacement fibers
Star Chromatography Workstation Varian Chromatography software
Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa Millipore Sigma 23154 Replacement inlet septa

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