Kafa Uzayı Gaz Kromatografisi Kullanan ZebraBalığı Embriyolarında Etanol Düzeylerinin Ölçülmesi

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bu çalışma, uygun maruzkalma yöntemlerinden embriyo işleme ve etanol analizine kadar kafa uzayı gaz kromatografisi kullanarak zebra balığı embriyosundaki etanol düzeylerini ölçmek için bir protokol tanımlamaktadır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Lovely, C. B. Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography. J. Vis. Exp. (156), e60766, doi:10.3791/60766 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Fetal Alkol Spektrum Bozuklukları (FASD), yüz dismorfolojileri ve nörolojik bozukluklar da dahil olmak üzere etanol kaynaklı gelişimsel defektlerin son derece değişken bir sürekliliğini tanımlar. Karmaşık bir patoloji ile, FASD her yıl Amerika Birleşik Devletleri'nde doğan her 100 çocuktan yaklaşık 1'ini etkiler. FASD'nin son derece değişken doğası nedeniyle, hayvan modelleri etanol kaynaklı gelişim kusurları mevcut mekanistik anlayış kritik kanıtlamıştır. Laboratuvarların giderek artan sayıda etanol kaynaklı gelişimsel kusurları incelemek için zebra balığı kullanarak odaklanmıştır. Zebra balıkları çok sayıda dıştan döllenmiş, genetik olarak çıkarılabilir, yarı saydam embriyo üretirler. Bu araştırmacılar tam olarak zamanlaması ve birden fazla genetik bağlamda etanol maruziyetinin dozajını kontrol etmek ve canlı görüntüleme teknikleri ile embriyonik etanol maruziyetinin etkisini ölçmek için izin verir. Bu, insanlar ile hem genetik ve gelişme koruma yüksek derecede ile birlikte, hangi etanol teratojenite mekanistik temeli çalışma için güçlü bir model olduğu zebra balığı kanıtlamıştır. Ancak, etanol maruziyetrejimleri bu çalışmalar arasında zebra balığı verilerinin yorumlanması şaşırttı farklı zebra balığı çalışmaları arasında farklılık göstermiştir. Burada kafa uzayı gaz kromatografisi kullanarak zebra balığı embriyolarında etanol konsantrasyonları ölçmek için bir protokoldür.

Introduction

Fetal Alkol Spektrum Bozuklukları (FASD) nörolojik bozukluklar ve embriyonik etanol maruziyeti ile ilişkili kraniyofasiyal dismorfolojileri geniş bir dizi açıklar1. Birden fazla faktör, zamanlama ve etanol maruziyeti ve genetik arka plan dozajı da dahil olmak üzere, FASD varyasyonkatkıda2,3. İnsanlarda, bu değişkenlerin karmaşık ilişkisi, FASD'nin etyolojisini incelemeyi ve anlamayı zorlaştırır. Hayvan modelleri etanol teratojenite mekanistik temelanlayışımızı geliştirmede önemli olduğunu kanıtlamıştır. Hayvan modeli sistemleri geniş bir yelpazede FASD birden fazla yönünü incelemek için kullanılmıştır ve sonuçlar son derece insanlarda maruz kalma bulunan ne ile tutarlı olmuştur4. Kemirgen model sistemleri FASD birçok yönünü incelemek için kullanılır, fareler en yaygın olan5,6,7. Bu çalışmanın çoğunluğu erken etanol maruziyeti gelişimsel bozukluklar üzerinde duruldu8, daha sonra etanol maruz ilikal anomalilere neden olduğu gösterilmiştir rağmen9. Ayrıca, farelerin genetik yetenekleri büyük ölçüde FASD10,11genetik temelleri araştırmak için yeteneğimizi yardımcı olmuştur. Farelerde bu çalışmalar kuvvetle sonik kirpi yolu ile gen-etanol etkileşimleri olduğunu göstermektedir, retinoik asit sinyalizasyonu, Süperoksit dismutaz, Nitrik oksit synthase I, Aldh2 ve Fancd28,10,11,12,13,14,15,16,17,18, 19,20,21. Bu çalışmalar, hayvan modellerinin FASD ve onun altında yatan mekanizmaları anlamamızı ilerletmek için kritik öneme sahip olduğunu göstermektedir.

Zebra balığı etanol teratogenez22,23birçok yönünü incelemek için güçlü bir model sistemi olarak ortaya çıkmıştır. Dış döllenme, yüksek fecundity, genetik sedatability ve canlı görüntüleme yetenekleri nedeniyle, zebrabalığı ideal zamanlama, dozaj ve etanol teratogenez genetik gibi faktörlerir çalışma için uygundur. Etanol tam olarak sahnelenen embriyolar için uygulanabilir ve embriyolar daha sonra gelişimsel süreçler sırasında etanol doğrudan etkisini incelemek için görüntülenebilir. Bu çalışma doğrudan insanlarla ilgili olabilir, çünkü genetik gelişim programları zebra balığı ve insanlar arasında son derece korunur ve bu nedenle FASD insan çalışmaları24rehberlik yardımcı olabilir. Zebra balığı etanol teratogenezini incelemek için kullanılırken, embriyonik etanol konsantrasyonlarının raporlanmasında konsensüs eksikliği insanlara kıyasla zor25. Memeli sistemlerinde, kan-alkol düzeyleri doku etanol düzeyleri ile doğrudan ilişkilidir26. Zebra balıklarının çoğu, dolaşım sistemleri tam olarak oluşmadan önce embriyoları tedavi eder. İncelemek için hiçbir anne örneği ile, embriyo içinde etanol düzeylerini ölçmek için etanol konsantrasyonlarını değerlendirmek için bir süreç gereklidir. Burada kafa uzayı gaz kromatografisi kullanarak gelişmekte olan bir zebra balığı embriyosundaki etanol konsantrasyonlarını ölçmek için bir süreç anlatıyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu işlemde kullanılan tüm zebra balığı embriyoları, kurulan IACUC protokolleri27'yegöre yükseltildi ve yetiştirildi. Bu protokoller Austin'deki Texas Üniversitesi ve Louisville Üniversitesi tarafından onaylandı.

NOT: Bu çalışmada zebra balığı hattı Tg(fli1:EGFP)y1 kullanılmıştır28. Bu işlemde kullanılan tüm su steril ters ozmoz suyudur. Tüm istatistiksel analizler Graphpad Prism v8.2.1 kullanılarak yapılmıştır.

1. Embriyo ortamı nın yapılması

  1. Embriyo medya 20x stok yapmak için, NaCl 17.5 g, KCl 0.75 g, 2.9 g CaCl2, 0.41 g K2HPO4, 0.142 g NA2HPO4, ve 4.9 g MgSO4·7H2O 1 L su. Beyaz çökelti bu formları görmezden; bu medyayı etkilemez. Filtre stok çözeltisini sterilize edin ve 4 °C'de saklayın.
  2. Çalışan embriyo media çözümünün oluşturulması için, 1,2 g NaHCO3'ü 1 L'de 20x embriyo media stokuna eritin ve 19 L su ekleyin. Çalışan embriyo media çözeltisini 28 °C'de saklayın.

2. Su deplasmanı kullanarak embriyonik hacmin ölçülmesi

NOT: Bu protokolde 24 saat postfertilizasyon (hpf) embriyoları(Şekil 1)kullanılmaktadır. Hacim ölçümlerinde kullanılan embriyolar etanol analizinde kullanılmaz.

  1. 10 embriyoyu ve ekstraembriyonik sıvıyı 250 μL hacimde işaretlenmiş 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe yerleştirin(Şekil 2A). 250 μL dolgu hattına su ekleyin (Bkz. Şekil 2B'dekiboyalı su ile örnek).
  2. Koroları çıkarılmış embriyolar için reseptörleri kurmak için adım 2.1'i tekrarlayın.
    1. Chorion kaldırmak için, oda sıcaklığında embriyo medyada proteaz kokteyl 2 mg / mL ile 100 mm Petri çanak kendi korolarında embriyoyerleştirin (RT) oda sıcaklığında 10 dakika. Birkaç dakikada bir, embriyoları yavaşça döndürüp koroyu kırın.
    2. Bir kez tüm embriyolar kendi chorion ücretsiz, proteaz kokteyl / embriyo medya den dechorionated embriyolar kaldırmak ve yeni bir 100 mm Petri çanak taze embriyo medya ile embriyoları yıkamak için yerleştirin. Bu yıkama adımını 1 kez daha tekrarlayın (toplam 2 yıkama için). Embriyoları taze 100 mm Petri kabına aktarın.
  3. Mümkün olan en küçük ucu kullanarak ve embriyolara zarar vermeden, p200 mikropipettor(Şekil 2C)kullanarak embriyoların etrafındaki tüm sıvıyı dikkatlice çıkarın ve suyu <0.1 mg hassasiyetle tartın. 10 embriyodan oluşan numunenin hacmini belirlemek için, 250 μL'den çıkarılan suyun ağırlığını/hacmini (1 mL su = 1 g su.) çıkarın. Tek bir embriyonun hacmini belirlemek için, farkı 250°L ile çıkarılan suyun ağırlığı arasındaki 10'a bölün.

Equation 1

Equation 2

3. Embriyoların etanol ile tedavi

  1. Uzamış tanklardan embriyotop ve standart 100 mm Petri kabına yerleştirin. Tek petri kabı başına en fazla 100 embriyo sayma ve 28,5 °C'de kuluçkaya yatırın.
    NOT: Korrion kaldırılacaksa (adım 2.2), etanol eklemeden önce kaldırılması gerekir.
  2. 6 hpf'de, embriyo media veya embriyo media + %1 etanol (v/v) ile yeni bir standart 100 mm Petri kabına 100 embriyo ekleyin. Kapak, ama Petri çanak mühür YAPMAYIN. Embriyoları 18 saat boyunca 28,5 °C olarak ayarlanmış düşük sıcaklıklı bir kuluçka makinesine yerleştirin veya embriyolar 24 hpf gelişimsel zaman noktasına ulaşana kadar.

4. Kafa uzayı gaz kromatografisi için embriyoları işlemeden önce iş akışının hazırlanması

  1. Tüm proteinleri dentabiate etmek ve etanol metabolizmasını önlemek için suda 5 M NaCl 'lik bir çözelti (numune tüpü başına 450°L gerekecektir). Proteaz kokteylini(Malzeme Tablosu)embriyo media'da 2 mg/mL konsantrasyonda yapın.
  2. Her numune için 1,5 mL mikrosantrifüj tüp ve 2 mL gaz kromatograf şişesini etiketlayın. Aşağıda açıklanan etanol standartlarının yanı sıra hava, su ve 5 M NaCl/proteaz kokteyl boşlukları için ek 2 mL gaz kromatograf şişelerini etiketleyin.
  3. Üç p200 mikropipettor iki set 50 μL ve üçüncü seti 200 μL ayarlayın; bir p1000 micropipettor 450 μL ve p2 micropipettor 2 μL olarak ayarlayın. Petri yemeklerinden 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine embriyo aktarmak için kullanılan cam pipetler için, pipet ucunu hızlı bir şekilde bir alev geçirerek kenarları yumuşatmak için embriyolara pipetin içine çizerken zarar vermez.

5. Kafa uzayı gaz kromatografisi için embriyoların işlenmesi

NOT: Hem korolarındaki hem de daha önce korolarından çıkarılan embriyolar seyreltme faktörlerinin hesaplanmasında tutarlılık açısından aynı şekilde tedavi edilir.

  1. 50 μL'ye ayarlanmış iki p200 mikropipettorkullanarak, proteaz kokteyl çözeltisinin 50 μL'sini bir e tek bir e ve 50°L'lik suyu ikinciye çekin.
  2. Cam pipet ve mikropipettor kullanarak, hızlı bir şekilde 10 embriyo (adım 3.2) bir 1.5 mL microcentrifuge tüp yerleştirin ve kapağı kapatın (Şekil 2Aaçıklandığı gibi). Test edilecek tüm örnekler için tekrarlayın, kontroller, ve etanol tedavi embriyolar.
  3. 200 μL olarak ayarlanmış p200 mikropipettor kullanarak, hızlı bir şekilde kapağı açın ve tüm artık embriyo ortamı kaldırmak (Şekil 2C'deaçıklandığı gibi). Hızlı bir şekilde tüp ve hızlı ama yavaşça (embriyolar zarar vermemek için) su 50 μL su içeren pipet yerleştirin, sonra su kaldırın. Bekleyen pipettordan proteaz kokteyl çözeltisinin 50 μL'sini hızla ekleyin ve tüp kapağını kapatın(Şekil 2D).
    NOT: Bu işlemi her seferinde bir örnek gerçekleştirin.
  4. Proteaz kokteylinin chorion'u bozabilmesi için numunenin 10 dk rt'de oturmasını bekleyin. Daha sonra, hızlı bir şekilde 5 M NaCl 450 μL ekleyin ve tüp kapağını kapatın(Şekil 2E). 10 dk için örnekleri girdap. İşlemi hızlandırmak için mikseri aynı anda birden fazla numuneyi girdap lamak üzere ayarlayın.
    NOT: 24 hpf'den büyük embriyoları olan herhangi bir tüpe silika boncuk karışımından (2 beden, 0,5 mm ve 1 mm boncuk) az miktarda (~100 μL) ekleyin. Eski embriyolarda, notochord ne kadar homojenize olursa olsun bozulmadan kalacaktır.
  5. 10 dakika homojenleştikten sonra, hızlı bir şekilde homojenize embriyo supernatant 2 μL çıkarın ve bir gaz kromatograf şişe ekleyin. Şişeyi politetrafloroetilen kapakla hızlıbir şekilde kapatın.

6. Ortam ve etanol standartlarının hazırlanması

  1. Medya standartlarını hazırlamak için, 5 M NaCl/proteaz kokteyl çözeltisi ile medyayı 10 kat seyreltin. Her numuneden 2 μL'lik gaz kromatograf şişesine ekleyin ve politetrafloroetilen kapaklı mühürleyin.
  2. Etanol standartlarını hazırlamak için, 5 M NaCl/proteease kokteyl çözeltisinde %100 etanolün seri seyreltilmesini aşağıdaki konsantrasyonlara göre oluşturun: 0.3125, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 ve 40 mM. Bir gaz kromatograf şişesine her standarttan 2 μL ekleyin ve politetrafloroetilen kapaklı mühürleyin.

7. Baş uzay gazı kromatografı hazırlama

NOT: Bu kurulum ve protokolün kullanılan gaz kromatografına bağlı olarak değiştirilmesi gerekebilir. Kafa uzayı gaz kromatografisi etanol düzeylerini ölçmek için kullanılır, ayırma için değil.

  1. Otomatik numuneleyicinin ısıtıcısını 58 °C'ye ayarlayın ve açın. Isıtıcının 58 °C'ye ulaşmasına izin verin ve gaz kromatografisini besleyen hava ve hidrojen gazı hatlarını açın (etanolün ölçülmesinde kullanılan alev iyonizasyonu için).
    NOT: Psi, kromatografiyi üreticinin özelliklerine göre düzgün bir şekilde işletecek şekilde ayarlanmalıdır. Helyum hattı açık olduğundan emin olun ve uygun psi ayarlayın.
  2. Septum için enjekte edilen numune sayısının >100 olmadığından emin olun. Enjeksiyon lifi için enjekte edilen numune sayısının >500 olmadığından emin olun.
    NOT: Enjeksiyon miktarının üzerindeyse, test örneklerini çalıştırmadan önce bunların değiştirilmesi gerekir.
  3. Analiz yazılımını açın ve iş istasyonunun düzgün ayarlandıkdığından emin olun. Tüm verileri laboratuvar/departman standartlarına göre saklayın. Çalıştırılacak örnekler için yeni bir örnek listesi oluşturun.
  4. Başlatma yöntemini başlatın ve örnekleri çalıştırmadan önce alev iyonizasyon dedektöründen stabilize olmasını bekleyin. Kararlı bir kez, fiber temizlemek için yazılım başlangıç yöntemi çalıştırın.

8. Kafa uzayı gaz kromatografisi kullanılarak numune ölçümleri

  1. Başlatma yöntemi tamamlandıktan sonra, örnek listesinde örnek başına 1 yeni satır oluşturun. Analiz yazılımındaki yöntem menüsünden, 436 Güncel spme etanol 2013 3dk 2_5min rg çalıştırın. Örnek listedeki her örnek için METH.
    1. Hava, su, 5 M NaCl/proteease kokteyl boşlukları ile başlayan örnek listesini doldurun. Daha sonra 0,3125'ten 40 mM'ye kadar standartları sırayla girin. Hava, su ve 5 M NaCl/proteease kokteyl boşlukları ikinci tur ile standartları izleyin.
    2. Test edilecek tüm homojenize embriyo supernatant örneklerini girin, en düşükten en yüksek tahmin edilen etanol konsantrasyonuna kadar. Hava, su ve 5 M NaCl/proteease kokteyl boşluklarının üçüncü ve son turuna girerek sona erin.
  2. Numunelerin girildiği sırada gaz kromatograf şişelerini otoörnekleyiciye ekleyin. Örneklerin 10-15 dk. Yazılımda numune çalıştırmalarını başlatın.
  3. Tüm örnekler ve son boşluklar çalıştırdıktan sonra, örnek listesine son bir örnek ekleyerek ve bekleme de çalıştırarak yazılımdaki kapatma yöntemini etkinleştirin. METH. Örnek çalışır sırasında elde edilen tüm verileri yedekle. Ekipmanı aşağıdaki sırayla kapatın: otomatik numune ısıtıcı, hidrojen tankı ve ancak kromatograf sıcaklığı 30 °C'ye ulaştıktan sonra hava tankı. Balmumu sütunkorumak için helyum tankı bırakın.

9. Örnek etanol pik entegrasyonu ve numune konsantrasyon analizi

NOT: 9.3'teki tüm değerler, tüm denklemlerin önceden doldurulduğu bir excel dosyasında hesaplanmıştır.

  1. Kapatma yöntemi tamamlandıktan sonra Kromatogramı Aç'a tıklayın. Sonuçları içeren klasörü açın. Örnekler otomatik olarak bu programa entegre edilir.
  2. Sonuçlarda, doğru zirvelerin entegre olduğundan emin olun (etanol 2 ile 2,5 arasında zirveyapar). Tüm numuneler onaylandıktan sonra sonuçları yazdırın veya dışa aktarın.
  3. Bir grafikte etanol standartlarının en yüksek yüksek liğini çizin. Etanol standartları için eğim, Y kese ve R2 değerlerini hesaplayın (R2 >0.99 olmalıdır).
    NOT: Bu değerler, örnek tepe yüksekliğinden etanol konsantrasyonunu belirlemek için kullanılacaktır.
  4. Her örnek için, etanol standartlarının Y kesişme sinden numunenin en yüksek yüksekliğini çıkarın. GC şişelerinde her örnek için etanol değerini elde etmek için bu değeri etanol standartlarının eğimine bölün.

Equation 3

  1. Embriyolarda etanol konsantrasyonu hesaplamak için, ilk her örnek için seyreltme faktörü hesaplamak. Bu protokolün 2.3. Bu, embriyo işleme sırasında her bir örneğe eklenen 5 M NaCl/proteaz kokteyl çözeltisini temsil eder (5.3 ve 5.4. adımlar).

Equation 4

  1. Bu örnek seyreltme faktörlerini kullanarak, her numune için örnek etanol değeri ile çarpın. Sonuçlar mm konsantrasyonu olacaktır. Ortam etanol değerini 10'un seyreltme faktörüyle çarparak ortam referans örneklerini hesaplayın.

Equation 5

Equation 6

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kan etanol düzeyleri erken embriyonik zebra balıklarında belirlenemez, çünkü tam olarak oluşmuş bir dolaşım sistemi vardır. Zebra balığı embriyolarında etanol konsantrasyonu düzeyini belirlemek için, etanol düzeyleri doğrudan homojenize embriyonik doku dan ölçülür. Düzgün embriyonik etanol konsantrasyonları ölçmek için, embriyonik hacim dikkate alınmalıdır. Embriyo (sarısı ekli) ekstraembriyonik sıvı ile çevrili chorion (yumurta kabuğu) içinde oturur(Şekil 1). Embriyonun herhangi bir hacim ölçüsü maruz kalma sırasında embriyolar üzerinde yapılmalıdır, çünkü embriyonik hacim embriyo boyutu arttıkça gelişimsel zaman içinde değişecektir. Buna ek olarak, embriyonun nasıl işlendiği ve embriyonik hacim dikkate alınmalıdır, çünkü bu elementlerin her ikisi de embriyonik etanol düzeylerini hesaplamak için kullanılan seyreltme faktörleri oluşturur.

Embriyo mükemmel bir küre olmadığı için, özellikle 10 hpf'den sonra, embriyonik hacmi değerlendirmek için su deplasmanı kullanılmıştır. Bu çalışmada 24 hpf'de embriyo kullanılmıştır. Embriyoların hacmi hem korolarında hem de korrionlarından çıkarılanların hacmi ölçüldü. Bu hacimler ekstraembriyonik sıvılı embriyo için 1.97 (± 0.4 SD) μL, sadece embriyo için 1.1 (± 0.22 SD) μL idi(Tablo 1). Ekstraembriyonik sıvı ile embriyo arasındaki bu fark ve tek başına embriyo kolion içinde embriyo çevreleyen ekstraembriyonik sıvının hacmidir (Şekil 1). Bu fark, sadece örneklerde embriyonun etanol konsantrasyonunun belirlenmesinde önemlidir. Analizden, embriyo korrion içinde ekstraembriyonik sıvı ile embriyo hacminin toplam% 56'sını oluşturmaktadır(Tablo 1). Embriyo büyüdükçe, embriyonik hacim zamanla artarak ekstraembriyonik sıvı nın hacminde bir azalmaya neden oldu25. Embriyolardan gelen etanol konsantrasyonları ölçülürken, hem embriyodaki hem de ekstraembriyonik sıvıdaki su içeriği dikkate alınmalıdır.

Daha önce yayınlanan çalışma, sadece embriyosu su fraksiyonu 73.6%29olduğunu göstermiştir. Bu sonuç hacim ölçüleri, elektron spin rezonans spektroskopisi ve manyetik rezonans mikroskopisi kombinasyonu kullanılarak elde edildi. Bu sonucu doğrulamak için, embriyolar daha önce25açıklandığı gibi, 70 °C'de pişirmeden önce ve sonra tek başına tartıldı. Bu işlem embriyotüm su kaldırır. Ağırlık değişimi embriyodaki su miktarını temsil eder. Bu analizden 24 hpf embriyo ~%72 su, 48 hpf embriyosu ise ~%76 oranında su içeriyordu. Bu değerlerin her ikisi de son derece benzer 73.6% embriyonik su hacmi daha önce hesaplanan29. Bu embriyonun su hacmi erken gelişim boyunca çok az değişiklikler olduğunu göstermektedir.

Embriyodaki su hacmini hesaplamak için birden fazla yaklaşım kullanılarak yayınlanan çalışmalara dayanarak, sunulan tüm analizler için embriyonik su içeriği olarak %73,6'sı kullanılmıştır. Bu, embriyonik hacmin 1,1 μL'lik 0.82 μL'lik su ile sonuçlanmasına neden oldu(Tablo 1). Buradan ekstraembriyonik sıvının hacmi 0.86 μL olarak hesaplandı. Embriyonun ekstraembriyonik sıvıiçeren toplam su hacminin %49'u embriyoda, %51'i ise ekstraembriyonik sıvıda dır(Tablo 1).

Gaz kromatografisi analizi için, sadece 24 hpf embriyohala kendi chorion kullanılmıştır(Şekil 1). Bu etanol rejiminde embriyolar 6-24 hpf arasında %1 (171 mM) etanol media konsantrasyonu ile tedavi edildi, ancak deneysel tasarıma bağlı olarak farklı etanol konsantrasyonları ve maruz kalma süresi pencereleri kullanılabilir. 15 örnekten oluşan iki grup (örnek başına 10 embriyo) ve 2 farklı deney günü boyunca tedavi edildikleri ortam(Tablo 2)analiz edildi. Ortam düzeyleri denemeden denemeye değişebilir. Bunu hesaba katmak için, medya etanol düzeyleri deney grubu başına 5x olarak ölçüldü. Bu analizde medya düzeyleri grup 1 için 143.6 (± 2.3 SD) mM ve grup 2 için 133.6 (± 2.7 SD) mM idi. Bu değerler eşleşmemiş bir t testi (p = 0.0002) kullanılarak önemli ölçüde farklıdır. Ekstraembriyonik sıvıya sahip embriyolar grup 1 ve 2 için sırasıyla 63.5 (± 17.1 SD) mM ve 53.1 (± 12.6 SD) mM olarak gerçekleşmektedir. Ancak, ekstraembriyonik sıvı (eşleşmemiş t testi, p = 0.07) ile embriyoların 2 grubu arasında konsantrasyon önemli ölçüde farklı değildi. Tedavi edilmeyen kontrol embriyoları 0 mM olarak ölçüldü. Medya düzeylerindeki değişim nedeniyle, her örnek için embriyonik etanol konsantrasyonu/ortam etanol düzeyleri hesaplandı. Grup 1'de media etanol düzeylerinin %44'ü, grup 2'de ise media etanol düzeylerinin %40'ı bulunurken(Şekil 3 ve Tablo 2).

Figure 1
Şekil 1: Chorion içinde 24 saat postfertilizasyon (hpf) bir embriyo görüntüsü. Embriyo ve sarısı ekstraembriyonik sıvı ile çevrilidir, tüm chorion içinde bulunan. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Embriyonik hacmi ölçmek ve analiz için embriyoları işlemek için protokol. (A) On 24 hpf embriyo, 250 μL hacimde işaretlenmiş 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe aktarılır. (B) Embriyolar su ile dolu mikrosantrifüj tüp (su 250 μL işareti görmek daha kolay böylece boyalı). (C) Suyun tamamı tüpten çıkarılır ve tartılır. (D) On embriyo 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarılır. Su(C)olarak çıkarıldı ve 50 μL proteaz kokteyli ile değiştirildi. (E) 10 dk sonra tüpe 450 μL 5 M NaCl(D)eklenmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Örneklerin etanol konsantrasyonunun ortama oranının kutu ve bıyık çizimi. Her grup için etanol konsantrasyonu, o grubun medya örneklerinin ortalamasına bölündü. Grup 1 medya seviyelerinin %44'ünü, grup 2'de ise %40'ını içeriyordu. Her iki grupta da n = 15; Örnek başına 10 embriyo. Gruplar tek yönlü ANOVA ile Tukey sonrası hoc analizi (****p < 0.0001) ile karşılaştırıldı. Bıyıklar en az dan maksimuma kadar temsil. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Embriyo ve Embriyo + Ekstraembriyo Su Hacimleri (3L)
Subir
Toplam Hacimb Toplam Hacmin %'si (V) Embriyonik Hacim (W) Ekstraembriyonik Hacim (X) Embriyoda % Su (Y) % Ekstraembriyonik Su (Z)
Embriyo + Ekstraembriyonik (EE)c 1.97 ± 0.4
Embriyo 24 hpf (E)c 1.11 ± 0.22 56% 0.82 0.86 49% 51%
Hesaplama
V Toplam hacmin Embriyo % = E ' nin Toplam Hacmi • EE'nin Toplam Hacmi
W Embriyonik Su Hacmi = V × %73.6
X Ekstraembriyonik Su Hacmi = W – EE Toplam Hacmi
Embriyoda Y% Su = (W + X)/W × 100
Ekstraembriyonikte Z% Su = 100 – Y
bir Embriyonik su hacmi Hagedorn ve ark.29'dan hesaplanmıştır.
b Değerler ± standart sapma (SD) olarak raporlanır.
cn = 13; Örnek başına 10 embriyo

Tablo 1: Ekstraembriyonik sıvı ile embriyolar için su hacminin hesaplanması. Hacim, 24 hpf embriyodan 13 örnekten (örnek başına 10 embriyo) hesaplandı ve hala koroda ekstraembriyonik sıvı vardı ve embriyolar korrionlarından çıkarıldı. Değerler ortalama ± SD olarak raporedilir.

Embriyo ve medianın Etanol Konsantrasyonu (mM)a
Grup 1 Grup 2 Kombine
Medya (M)b 143,6 ± 2,3 133,6 ± 2,7 138,6 ± 5,8
Embriyo + Ekstraembriyonik (EE)c 63.5 ± 17.1 53.1 ± 12.6 58.3 ± 15.7
Etanol oranı - embriyonun medyaya oranı (1) 0,44 ± 0,12 0,40 ± 0,09 0,42 ± 0,11
Hesaplama
1.1.2 Etanol oranı = EE ÷ M
bir Değerler ± SD olarak raporlanır.
bn = 5
cn = 15; Örnek başına 10 embriyo
d Değerler 1 ve 2 gruplarının ortalamasıdır.

Tablo 2: Embriyolarda ekstraembriyonik sıvı ve media (mM) ile etanol konsantrasyonu hesaplamaları. Medya örnekleri medyadan doğrudan alınan önlemlerdi (grup başına n = 5). Embriyonik etanol konsantrasyonu ekstraembriyonik sıvı içeren 24 hpf embriyodan 15 örnekten (numune başına 10 embriyo) hesaplandı. Embriyoların etanol konsantrasyonlarının ekstraembriyonik sıvı ile ortama oranı hesaplandı. Değerler ortalama ± SD olarak raporedilir.

Embriyoa,b'deki etanol hesaplaması
Embriyo (Y) Ortama oranı (Z)
32.7 ± 8.8 mM 0,24 ± 0,06
Hesaplama
Y Embriyonik Etanol = 58.3 mM (Tablo 2) × %56 (Tablo 1)
Z Etanol oranı = Y ÷ 138,6 mM (Tablo 2)
bir Değerler 1 ve 2 gruplarının ortalamasıdır.
b Değerler ± SD olarak raporlanır.

Tablo 3: Embriyoda etanol hesaplanması. Embriyonik etanol konsantrasyonu, embriyonun ekstraembriyonik sıvı ile toplam etanol konsantrasyonunun %56'sı olarak hesaplandı. Bu daha sonra medyaya embriyo oranı olarak bildirilmiştir. Değerler ortalama ± SD olarak raporedilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Gelişimsel bir model sistemi olarak, zebra balıkları çevresel faktörlerin gelişim üzerindeki etkisini incelemek için idealdir. Onlar etanol çalışmalarında kesin zamanlama ve dozaj paradigmaları sağlar dıştan döllenmiş embriyolar, çok sayıda üretmek. Bu, canlı görüntüleme yetenekleri ve insanlar ile genetik ve gelişimsel koruma ile birlikte, zebra balığı teratoloji çalışmaları için güçlü bir model sistemi yapmak. Açıklanan kafa uzayı gaz kromatografisi kullanarak zebra balığı embriyoları geliştirmede embriyonik etanol konsantrasyonları ölçmek için bir protokoldür.

Embriyonik etanol konsantrasyonunun belirlenmesi gelişmekte olan embriyo için etanol etkisini anlamak için önemlidir. Kemirgen modellerinde, kan etanol konsantrasyonları doku konsantrasyonları ile ilişkili26. Ancak zebra balığında erken embriyonik gelişimde kan etanol düzeylerini değerlendirmek mümkün değildir. Kafa uzay gaz kromatografisi zebra balığı25,30,31,32,33,34,35dahil olmak üzere çeşitli deneysel paradigmalarda etanol düzeylerini ölçmek için kullanılmıştır. Ancak, bu protokol birçok farklı çevresel faktörü ölçmek için kullanılabilir, bu çeşitli faktörlerin uçuculuk nicel ölçmek için yeterince yüksek olması gerekir rağmen ve söz konusu bileşiklerin polaritedayalı bir gaz kromatograf sütun seçilmelidir. Buna ek olarak, zebra balıkları suda çözünen faktörlerin etkisini incelemek için en uygun olan, hidrofobik faktörlere maruz kalma son derece balık analiz etmek zordur çünkü.

Bu protokol araştırmacıların zebra balığı embriyolarında etanol konsantrasyonlarını doğrudan değerlendirmelerine olanak sağlayacaktır. Ancak, embriyonik etanol konsantrasyonlarının doğru ölçümleri sağlamak için çeşitli faktörler ele alınması gerekir. Toplam embriyonik dokularda etanol düzeyleri ölçüldüğü için embriyonik hacim göz önünde bulundurulmalıdır. 10 hpf sonra embriyo somitogenez başlar (somite oluşumu) ve artık bir küre(Şekil 1). Embriyonik hacmi değerlendirmek için, su deplasmanı örnek başına 10 havuzlu embriyoüzerinde kullanıldı. Her örnek iki nedenden dolayı 10 embriyodan oluşuyordu: birincisi, küçük hacimleri pipetleme hatasını azaltmak için, ve ikinci, embriyo hacimlerinde küçük dalgalanmalar ortalama. Embriyonik hacim ölçerken, pipetleme ve tartma hassasiyetini göz önünde bulundurmak önemlidir. Örnek başına 10 embriyo nun kullanımı bile hem pipetler hem de embriyoları tartmak için kullanılan ölçek için en düşük hassasiyet sınırındadır. Mevcut ekipmanla, 10'dan az embriyo kullanmak analizleri etkilenebilmiştir. Bu, ekipman hassasiyeti düşünülderken araştırmacıların numune başına daha az embriyo kullanmasını sınırlamaz.

Embriyonik hacim örnek analizini etkileyen faktörlerden biridir. İkinci bir önemli faktör embriyonik işlem hızı, etanol uçucu olduğu için. Buna ek olarak, etanol hızlı bir şekilde birden fazla hayvan çalışmalarında dengeler25,36,37. Yıkama protokolümüz, korrion dış yüzeyine yapışan etanolleri hızlı bir şekilde çıkarmak için tasarlanmıştır. Bu çalışmada bu yıkama protokolü embriyonik etanol düzeylerini etkilemedi, daha uzun veya birden fazla yıkar embriyonik etanol konsantrasyonları etkileyebilir rağmen25,38. Ancak dikkate almak için üçüncü bir faktör işleme sırasında embriyonik hacmin seyreltilmesidir. Bu protokol, alkol işleme enzimleri de dahil olmak üzere tüm proteinleri dentabiatasyon atürlemek için chorion yanı sıra 5 M NaCl düşürmek için bir proteaz kokteyl kullanır.

Son olarak, çok çeşitli zebra balıkları çalışmalarında çeşitli analizler ve raporlama yöntemleri tanımlanmıştır. Bir çalışmanın farklı örnekleri içinde varyasyon nedeniyle veya farklı çalışmalar karşılaştırarak, etanol konsantrasyonu doğru raporlama kritik25,38. Dolaylı (genellikle enzimatik ölçümler) kullanan yöntemler ikincil bir metabolitin analizine dayanır. Bu durumda, enzimatik aktivite oranı değişebilir ve etanol konsantrasyonu kesin analizini engelleyebilir. Bu yöntem doğrudan etanol düzeylerini ölçer ve etanol konsantrasyonları medya konsantrasyonları için embriyo oranı olarak bildirilmiştir. Sonuçlarımız, medya konsantrasyonlarının ~%30'unu içeren 24 hpf embriyonun artan konsensüsile uyumludur(Tablo 3)25,38,39,40. Şaşırtıcı, Bu 30% embriyonik etanol konsantrasyonu medya konsantrasyonu bağımsızdır, ve iyi bu denge25oluşturur ne anlaşılamamıştır,38. 24 hpf'den büyük embriyolar etanol konsantrasyonlarında azalma gösterir, 48 hpf embriyosu 24 hpf embriyonun etanol içeriğinin yaklaşık yarısını içerir 24 hpf embriyo25. Ancak, sonuçlarımız etanol-su dengesini belirlemez. Etanol dengehızı göz önüne alındığında, etanol volatilite yanı sıra, etanol maruziyeti nedeniyle embriyo kendisi su hacmi değişiklikleri değerlendirmek için inanılmaz zordur. Su deplasmanı kullanarak etanol le tedavi edilen embriyo numunesinin hacmini ölçmeye çalışmak, ölçüm sırasında embriyodan etanol kaybına neden olacaktır. Yukarıda açıklanandan daha hassas mikroskopi ve spektroskopi yöntemleri kullanılarak, embriyodaki etanol-su dengesini niçin aynı anda doğrudan ölçerek belirlemek mümkün olabilir.

Genel olarak, burada açıklanan protokol ile zebrabalığı embriyoları gelişmekte embriyonik etanol konsantrasyonları değerlendirmek için güçlü bir araçtır. Bu bilgiler, zebra balığı kullanarak FASD çalışmalarının standartlaştırılmasında çok önemlidir. Etanol tedavi paradigmalarını tam olarak kontrol etme ve embriyonik etanol konsantrasyonlarını doğrudan ölçebilme yeteneği, insan FASD çalışmaları için zebra balığı modelinin işlevselliğini güçlendirir. Sonuçta, bu çalışma büyük ölçüde FASD anlayışımızı artıracaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu makalede sunulan araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri/Ulusal Diş ve Kraniyofasiyal Araştırma Enstitüsü (NIH/NIDCR) R01DE020884'ten J.K.E.'ye daha önce verilen hibelerle desteklenmiştir. ve Ulusal Sağlık Enstitüleri/Ulusal Alkol Bağımlılığı ve Alkolizm Enstitüsü (NIH/NIAAA) F32AA021320'den C.B.L.'ye ve Ulusal Sağlık Enstitüleri/Ulusal Alkol Bağımlılığı Enstitüsü'nden (NIH/NIAAA) R00AA023560'dan C.B.L'ye verilen hibe. Rueben Gonzales'e gaz kromatograf analizini sağladığı ve yardımcı olduğu için teşekkür ederiz. Tiahna Ontiveros ve Dr. Gina Nobles'a yardım da çok teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Air Provided by contract to the university
Analytical Balance VWR 10204-962
AutoSampler, CP-8400 Varian Gas Chromatograph Autosampler
Calcium Chloride VWR 97062-590
Ethanol Decon Labs 2701
Gas chromatograph vial with polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap 2 mL Agilent 8010-0198 Can reuse the vials after cleaning, but not the caps/septa
Gas Chromatograph, CP-3800 Varian
Helium Provided by contract to the university
HP Innowax capillary column Agilent 19095N-123I 30 m x 0.53 mm x 1.0 μm film thick
Hyrdogen Provided by contract to the university
Magnesium Sulfate (Heptahydrate) Fisher Scientific M63-500
Microcentrifuge tube 1.5 mL Fisher Scientific 2682002
Micropipette tips 10 μL Fisher Scientific 13611106
Micropipette tips 1000 μL Fisher Scientific 13611127
Micropipette tips 200 μL Fisher Scientific 13611112
Petri dishes 100 mm Fisher Scientific FB012924
Pipetman L p1000L Micropipette Gilson FA10006M
Pipetman L p200L Micropipette Gilson FA10005M
Pipetman L p2L Micropipette Gilson FA10001M
Polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap Agilent 5190-7021 Replacement caps/septa for gas chromatograph vials
Potassium Chloride Fisher Scientific P217-500
Potassium Phosphate (Dibasic) VWR BDH9266-500G
Pronase VWR 97062-916
Silica Beads .5 mm Biospec Products 11079105z
Silica Beads 1.0 mm Biospec Products 11079110z
Sodium Bicarbonate VWR BDH9280-500G
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-500
Sodium Phosphate (Dibasic) Fisher Scientific S374-500
Solid-phase microextraction fiber assembly Carboxen/Polydimethylsiloxane Millipore Sigma 57343-U Replacement fibers
Star Chromatography Workstation Varian Chromatography software
Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa Millipore Sigma 23154 Replacement inlet septa

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elliott, E. J., Payne, J., Morris, A., Haan, E., Bower, C. Fetal alcohol syndrome: a prospective national surveillance study. Archive of Diseases in Childhood. 93, (9), 732-737 (2008).
  2. Cudd, T. A. Animal model systems for the study of alcohol teratology. Experimental Biology and Medicine. 230, (6), 389-393 (2005).
  3. Williams, J. F., Smith, V. C. Committee on Substance Abuse. Fetal Alcohol Spectrum Disorders. Pediatrics. 136, (5), 1395-1406 (2015).
  4. Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).
  5. Petrelli, B., Weinberg, J., Hicks, G. G. Effects of prenatal alcohol exposure (PAE): insights into FASD using mouse models of PAE. Biochemistry and Cell Biology. 96, (2), 131-147 (2018).
  6. Mayfield, J., Arends, M. A., Harris, R. A., Blednov, Y. A. Genes and Alcohol Consumption: Studies with Mutant Mice. International Review Neurobiology. 126, 293-355 (2016).
  7. Marquardt, K., Brigman, J. L. The impact of prenatal alcohol exposure on social, cognitive and affective behavioral domains: Insights from rodent models. Alcohol. 51, 1-15 (2016).
  8. Sulik, K. K. Genesis of alcohol-induced craniofacial dysmorphism. Experimental Biology and Medicine. 230, (6), 366-375 (2005).
  9. Lipinski, R. J., et al. Ethanol-induced face-brain dysmorphology patterns are correlative and exposure-stage dependent. PLoS One. 7, (8), 43067 (2012).
  10. Eberhart, J. K., Parnell, S. The genetics of fetal alcohol spectrum disorders. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40, (6), 1154-1165 (2016).
  11. Becker, H. C., Diaz-Granados, J. L., Randall, C. L. Teratogenic actions of ethanol in the mouse: a minireview. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 55, (4), 501-513 (1996).
  12. Ahlgren, S. C., Thakur, V., Bronner-Fraser, M. Sonic hedgehog rescues cranial neural crest from cell death induced by ethanol exposure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, (16), 10476-10481 (2002).
  13. Loucks, E. J., Ahlgren, S. C. Deciphering the role of Shh signaling in axial defects produced by ethanol exposure. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 85, (6), 556-567 (2009).
  14. Hong, M., Krauss, R. S. Cdon mutation and fetal ethanol exposure synergize to produce midline signaling defects and holoprosencephaly spectrum disorders in mice. PLoSGenetics. 8, (10), 1002999 (2012).
  15. Aoto, K., Shikata, Y., Higashiyama, D., Shiota, K., Motoyama, J. Fetal ethanol exposure activates protein kinase A and impairs Shh expression in prechordal mesendoderm cells in the pathogenesis of holoprosencephaly. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 82, (4), 224-231 (2008).
  16. Deltour, L., Ang, H. L., Duester, G. Ethanol inhibition of retinoic acid synthesis as a potential mechanism for fetal alcohol syndrome. The FASEB Journal. 10, (9), 1050-1057 (1996).
  17. Wentzel, P., Eriksson, U. J. Ethanol-induced fetal dysmorphogenesis in the mouse is diminished by high antioxidative capacity of the mother. Toxicological Sciences. 92, (2), 416-422 (2006).
  18. Karacay, B., Mahoney, J., Plume, J., Bonthius, D. J. Genetic absence of nNOS worsens fetal alcohol effects in mice. II: microencephaly and neuronal losses. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 39, (2), 221-231 (2015).
  19. Bonthius, D. J. Jr, Winters, Z., Karacay, B., Bousquet, S. L., Bonthius, D. J. Importance of genetics in fetal alcohol effects: null mutation of the nNOS gene worsens alcohol-induced cerebellar neuronal losses and behavioral deficits. Neurotoxicology. 46, 60-72 (2015).
  20. Bonthius, D. J., et al. Deficiency of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) worsens alcohol-induced microencephaly and neuronal loss in developing mice. Brain Research. Developmental Brain Research. 138, (1), 45-59 (2002).
  21. Langevin, F., Crossan, G. P., Rosado, I. V., Arends, M. J., Patel, K. J. Fancd2 counteracts the toxic effects of naturally produced aldehydes in mice. Nature. 475, (7354), 53-58 (2011).
  22. Lovely, C. B., Fernandes, Y., Eberhart, J. K. Fishing for Fetal Alcohol Spectrum Disorders: Zebrafish as a Model for Ethanol Teratogenesis. Zebrafish. 13, (5), 391-398 (2016).
  23. Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96, (2), 88-97 (2018).
  24. McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140, (15), 3254-3265 (2013).
  25. Lovely, C. B., Nobles, R. D., Eberhart, J. K. Developmental age strengthens barriers to ethanol accumulation in zebrafish. Alcohol. 48, (6), 595-602 (2014).
  26. Harris, R. A., Trudell, J. R., Mihic, S. J. Ethanol's molecular targets. Science Signaling. 1, (28), (2008).
  27. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish Danio (Brachydanio) rerio. University of Oregon Press. Eugene, OR. (1993).
  28. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Developmental Biology. 248, (2), 307-318 (2002).
  29. Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. Water Distribution and permeability of zebrafish embryos, Brachydanio rerio. Journal of Experimental Zoology. 278, (6), 356-371 (1997).
  30. Lippi, G., et al. The alcohol used for cleansing the venipuncture site does not jeopardize blood and plasma alcohol measurement with head-space gas chromatography and an enzymatic assay. Biochemia Medica. 27, (2), 398-403 (2017).
  31. Poklis, J. L., Wolf, C. E., Peace, M. R. Ethanol concentration in 56 refillable electronic cigarettes liquid formulations determined by headspace gas chromatography with flame ionization detector (HS-GC-FID). Drug Testing and Analysis. 9, (10), 1637-1640 (2017).
  32. Heit, C., et al. Quantification of Neural Ethanol and Acetaldehyde Using Headspace GC-MS. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40, (9), 1825-1831 (2016).
  33. Chun, H. J., Poklis, J. L., Poklis, A., Wolf, C. E. Development and Validation of a Method for Alcohol Analysis in Brain Tissue by Headspace Gas Chromatography with Flame Ionization Detector. Journal of Analytical Toxicology. 40, (8), 653-658 (2016).
  34. Schlatter, J., Chiadmi, F., Gandon, V., Chariot, P. Simultaneous determination of methanol, acetaldehyde, acetone, and ethanol in human blood by gas chromatography with flame ionization detection. Human and Experimental Toxicology. 33, (1), 74-80 (2013).
  35. Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography. Journal of Visualized Experiments. (67), e4142 (2012).
  36. Adalsteinsson, E., Sullivan, E. V., Mayer, D., Pfefferbaum, A. In vivo quantification of ethanol kinetics in rat brain. Neuropsychopharmacology. 31, (12), 2683-2691 (2006).
  37. Quertemont, E., Green, H. L., Grant, K. A. Brain ethanol concentrations and ethanol discrimination in rats: effects of dose and time. Psychopharmacology. 168, (3), 262-270 (2003).
  38. Flentke, G. R., Klinger, R. H., Tanguay, R. L., Carvan, M. J., Smith, S. M. An evolutionarily-conserved mechanism of calcium-dependent neurotoxicity. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 38, (5), 1255-1265 (2014).
  39. Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish. Neurotoxicology and Teratology. 26, (6), 769-781 (2004).
  40. Zhang, C., Ojiaku, P., Cole, G. J. Forebrain and hindbrain development in zebrafish is sensitive to ethanol exposure involving agrin, Fgf, and sonic hedgehog function. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 97, (1), 8-27 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics