Kvantifisering av etanolnivåer i sebrafiskembryoer ved hjelp av hodeplassgasskromatografi

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Dette arbeidet beskriver en protokoll for å kvantifisere etanolnivåer i et sebrafiskembryo ved hjelp av hodeplassgasskromatografi fra riktige eksponeringsmetoder for embryobehandling og etanolanalyse.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Lovely, C. B. Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography. J. Vis. Exp. (156), e60766, doi:10.3791/60766 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Føtal alkoholspektrumforstyrrelser (FASD) beskriver et svært variabelt kontinuum av etanolinduserte utviklingsdefekter, inkludert ansiktsdysmorfologier og nevrologiske funksjonsnedsettelser. Med en kompleks patologi påvirker FASD ca. 1 av 100 barn født i USA hvert år. På grunn av FASDs svært variable natur har dyremodeller vist seg å være kritiske i vår nåværende mekanistiske forståelse av etanolinduserte utviklingsdefekter. Et økende antall laboratorier har fokusert på å bruke sebrafisk for å undersøke etanolinduserte utviklingsdefekter. Sebrafisk produserer et stort antall eksternt befruktede, genetisk tractable, gjennomsiktige embryoer. Dette gjør det mulig for forskere å nøyaktig kontrollere timing og dosering av etanoleksponering i flere genetiske sammenhenger og kvantifisere virkningen av embryonisk etanoleksponering gjennom levende bildeteknikker. Dette, kombinert med den høye graden av bevaring av både genetikk og utvikling med mennesker, har vist sebrafisk å være en kraftig modell for å studere mekanistisk grunnlag av etanol teratogenitet. Etanoleksponeringsregimer har imidlertid variert mellom ulike sebrafiskstudier, som har forvirret tolkningen av sebrafiskdata på tvers av disse studiene. Her er en protokoll for å kvantifisere etanolkonsentrasjoner i sebrafiskembryoer ved hjelp av hodeplassgasskromatografi.

Introduction

Føtal alkoholspektrumforstyrrelser (FASD) beskriver et bredt spekter av nevrologiske funksjonsnedsettelser og kraniofaciale dysmorfologier forbundet med embryonisk etanoleksponering1. Flere faktorer, inkludert timing og dosering av etanoleksponering og genetisk bakgrunn, bidrar til variasjonen av FASD2,3. Hos mennesker gjør det komplekse forholdet mellom disse variablene å studere og forstå etiologien til FASD utfordrende. Dyremodeller har vist seg avgjørende for å utvikle vår forståelse av det mekanistiske grunnlaget for etanolteratogenisitet. Et bredt utvalg av dyremodellsystemer har blitt brukt til å studere flere aspekter av FASD, og resultatene har vært bemerkelsesverdig konsistente med det som finnes i eksponering hos mennesker4. Gnagermodellsystemer brukes til å undersøke mange aspekter av FASD, med mus som den vanligste5,6,7. Mesteparten av dette arbeidet har fokusert på utviklingsdefekter til tidlig etanoleksponering8, men senere eksponering for etanol har vist seg å forårsake utviklingsavvik også9. Videre har de genetiske egenskapene til mus i stor grad hjulpet i vår evne til å undersøke de genetiske fundamentene til FASD10,11. Disse studiene hos mus tyder sterkt på at det er gen-etanol interaksjoner med sonic pinnsvin banen, retinsyre signalering, Superoxide dismutase, Nitrogenoksid synthase I, Aldh2 og Fancd28,10,11,12,13,14,15,16,17,18, 19,20,21. Disse studiene viser at dyremodeller er avgjørende for å fremme vår forståelse av FASD og dens underliggende mekanismer.

Sebrafisken har dukket opp som et kraftig modellsystem for å undersøke mange aspekter av etanol teratogenese22,23. På grunn av deres eksterne befruktning, høy fecundity, genetisk tractability, og levende bildebehandling evner, sebrafisk er ideelt egnet til å studere faktorer som timing, dosering, og genetikk av etanol teratogenese. Etanol kan administreres til nøyaktig iscenesatte embryoer, og embryoene kan deretter avbildet for å undersøke den direkte virkningen av etanol under utviklingsprosesser. Dette arbeidet kan være relatert direkte til mennesker, fordi de genetiske utviklingsprogrammene er høyt bevart mellom sebrafisk og mennesker og kan derfor bidra til å veilede FASD menneskelige studier24. Mens sebrafisk har blitt brukt til å undersøke etanol teratogenese, gjør mangel på konsensus i rapportering av embryonale etanolkonsentrasjoner sammenligning med mennesker vanskelig25. I pattedyrsystemer korrelerer blod-alkoholnivåer direkte med vevsetanolnivåer26. Mange av sebrafiskstudiene behandler embryoer før fullstendig dannelse av sirkulasjonssystemet. Uten maternal prøve å undersøke, er det nødvendig med en prosess for å vurdere etanolkonsentrasjoner for å kvantifisere etanolnivåer i embryoet. Her beskriver vi en prosess for å kvantifisere etanolkonsentrasjoner i et utviklende sebrafiskembryo ved hjelp av hodeplassgasskromatografi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle sebrafiskembryoer som ble brukt i denne prosedyren ble hevet og avlet etter etablerte IACUC-protokoller27. Disse protokollene ble godkjent av University of Texas i Austin og University of Louisville.

MERK: Sebrafisklinjen Tg(fli1:EGFP)y1 ble brukt i denne studien28. Alt vann som brukes i denne prosedyren er sterilt omvendt osmose vann. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av Graphpad Prism v8.2.1.

1. Lage embryomedier

  1. For å lage en 20x lager av embryo media, oppløse 17,5 g NaCl, 0,75 g KCl, 2,9 g caCl2, 0,41 g av K2HPO4,0.142 g NA2HPO4,og 4,9 g mgSO4·7H2O i 1 L vann. Ignorer den hvite utfellingen som dannes; dette vil ikke påvirke media. Filtrer steriliser lagerløsningen og oppbevar ved 4 °C.
  2. For å skape den arbeidende embryomedieløsningen, oppløs 1,2 g NaHCO3 i 1 L 20x embryomedia lager og tilsett 19 L vann. Vedlikehold arbeidsembryomedieoppløsningen ved 28 °C.

2. Måle det embryonale volumet ved hjelp av vannforskyvning

MERK: I denne protokollen brukes 24 h postfertilisering (hpf) embryoer (figur 1). Embryoene som brukes i volummålingene brukes ikke i etanolanalysen.

  1. Plasser 10 embryoer og ekstraembryonisk væske i 1,5 ml mikrocentrifugerør merket med et volum på 250 μL (figur 2A). Tilsett vann til 250 μL påfyllingslinjen (se prøve med movervann i figur 2B).
  2. Gjenta trinn 2.1 for å sette opp beholdere for embryoer som har fått sine chorions fjernet.
    1. For å fjerne koret, plasser embryoene i sine kor i en 100 mm Petri-tallerken med 2 mg / ml proteasecocktail i embryomedia ved romtemperatur (RT) i 10 min. Med noen få minutter, virvler embryoene forsiktig for å bryte koret.
    2. Når alle embryoene er fri for sitt kor, fjern de dechorionerte embryoene fra protease cocktail / embryo media og plasser i en ny 100 mm Petri parabolen med friske embryomedier for å vaske embryoene. Gjenta dette vasketrinnet 1 gang til (for totalt 2 vask). Overfør embryoene til en frisk 100 mm Petri-tallerken.
  3. Bruk den minste spissen mulig og uten å skade embryoene, fjern forsiktig all væske fra rundt embryoene ved hjelp av en p200 mikropipettor (Figur 2C)og vei vannet med en skala med <0,1 mg presisjon. For å bestemme volumet av prøven på 10 embryoer, trekk fra vekten/volumet av vannet (1 ml vann = 1 g vann.) fjernet fra 250 μL. For å bestemme volumet av et enkelt embryo, del forskjellen mellom 250 μL og vekten av vannet fjernet med 10.

Equation 1

Equation 2

3. Behandling av embryoer med etanol

  1. Samle embryoer fra parringstanker og legg i en standard 100 mm Petri-tallerken. Telle ut ikke mer enn 100 embryoer per enkelt Petri parabolen og inkubator ved 28,5 °C.
    MERK: Hvis koret skal fjernes (trinn 2.2), må den fjernes før du legger til etanol.
  2. Ved 6 hkf, legg til opptil 100 embryoer til en ny standard 100 mm Petriparabol enten med embryomedia eller embryomedia + 1% etanol (v/v). Dekk, men ikke forsegle Petri parabolen. Plasser embryoene i en lav vikarinkubator satt til 28,5 °C i 18 timer, eller til embryoene når utviklingstidspunktet på 24 hkf.

4. Klargjøre arbeidsflyt før du behandler embryoene for hodeplassgasskromatografi

  1. Lag en løsning på 5 M NaCl i vann (450 μL vil være nødvendig per prøverør) for å avnature alle proteiner og forhindre etanolmetabolisme. Lag proteasecocktailen (Materialtabell) ved en konsentrasjon på 2 mg/ml i embryomedier.
  2. Merk et mikrocentrifugerør på 1,5 ml og et 2 ml kromografhetteglass for hver prøve. Merk ytterligere 2 ml gasskromatografhetteglass for etanolstandardene beskrevet nedenfor, samt luft, vann og 5 M NaCl/protease cocktailblanks.
  3. Sett opp tre p200 mikropipettorer to satt til 50 μL, og det tredje settet til 200 μL; en p1000 mikropipettor satt til 450 μL og en p2 mikropipettor satt til 2 μL. For glasspipetter som brukes til å overføre embryoer fra Petri-retter til 1,5 ml mikrocentrifugerør, må du raskt pipettespissen gjennom en flamme for å glatte kantene for å ikke skade embryoene når du tegner dem inn i pipetten.

5. Behandling av embryoer for hodeplassgasskromatografi

MERK: Begge embryoene i sine kor og de som tidligere ble fjernet fra sine chorions, behandles på samme måte for konsistens i beregningen av fortynningsfaktorer.

  1. Bruk de to p200 mikropipettorene satt til 50 μL, trekk 50 μL av proteasecocktailoppløsningen i en og trekk 50 μL vann inn i den andre.
  2. Bruk glasspipetten og mikropipettoren til å plassere 10 embryoer (fra trinn 3.2) i et mikrocentrifugerør på 1,5 ml og lukk hetten (som beskrevet i figur 2A). Gjenta for at alle prøvene skal testes, kontrollerer og etanolbehandlede embryoer.
  3. Bruk p200 micropipettor satt til 200 μL, åpne hetten raskt og fjern alle gjenværende embryomedier (som beskrevet i figur 2C). Plasser pipetten raskt som inneholder 50 μL vann i røret og raskt, men forsiktig (for ikke å skade embryoene), tilsett, og fjern deretter vannet. Tilsett raskt 50 μL av proteasecocktailoppløsningen fra ventende pipettor og lukk rørhetten (figur 2D).
    MERK: Utfør denne prosessen én prøve om gangen.
  4. La prøven sitte ved RT i 10 min for å la proteasecocktailen forringe koret. Deretter legger du raskt til 450 μL 5 M NaCl og lukk rørhetten (Figur 2E). Vortex prøvene i 10 min. Hvis du vil øke hastigheten på prosessen, konfigurerer du mikseren til å virvle flere prøver samtidig.
    MERK: Tilsett en liten mengde (~ 100 μL) av en silikaperleblanding (2 størrelser, 0,5 mm og 1 mm perle) til et hvilket som helst rør med embryoer eldre enn 24 hkf. Hos eldre embryoer vil notochord forbli intakt uansett hvor lenge de er homogenisert.
  5. Etter homogenisering i 10 min, fjern raskt 2 μL homogenisert embryosupernatant og legg til et gasskromatografhetteglass. Forsegle hetteglasset raskt med polytetrafluoretylenhetten.

6. Klargjøre medie- og etanolstandarder

  1. For å forberede mediestandardene, fortynn med en faktor på 10 med en 5 M NaCl /protease cocktailløsning. Tilsett 2 μL av hver prøve til et gasskromatografhetteglass og tetning med polytetrafluoretylenhette.
  2. For å forberede etanolstandarder, lag en seriell fortynning på 100% etanol i 5 M NaCl / protease cocktailløsning til følgende konsentrasjoner: 0,3125, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 og 40 mM. Tilsett 2 μL av hver standard til et gasskromatografhetteglass og tetning med polytetrafluoretylenhette.

7. Klargjøre hodeplass gass kromatograf

MERK: Dette oppsettet og protokollen må kanskje endres avhengig av gasskromatografen som brukes. Hodeplass gasskromatografi brukes til å kvantifisere etanolnivåer, ikke for separasjon.

  1. Sett varmeren for autosampler en 58 °C og slå på. La varmeren nå 58 °C, og slå på luft- og hydrogengasslinjene som mater gasskromatografen (for flammeionisering som brukes til å kvantifisere etanol).
    MERK: Psi en riktig måte skal betjene kromatografen i henhold til produsentens spesifikasjoner. Kontroller at heliumlinjen er på og satt til riktig psi.
  2. For septum, kontroller at antall prøver injisert ikke er > 100. For injeksjonsfiber, sørg for at antall injeksjoner injisert ikke er > 500.
    MERK: Hvis enten er over antall injeksjoner, må de endres før du kjører testprøvene.
  3. Slå på analyseprogramvaren og kontroller at arbeidsstasjonen er riktig konfigurert. Lagre alle data i henhold til laboratorie-/avdelingsstandarder. Opprett en ny eksempelliste for prøvene som skal kjøres.
  4. Start oppstartsmetoden og vent til flammeioniseringsdetektoren stabiliserer seg før du kjører prøvene. Når stabil, kjøre programvaren oppstartsmetode for å rense fiber.

8. Prøvemålinger ved hjelp av hodeplassgasskromatografi

  1. Når oppstartsmetoden er fullført, oppretter du 1 ny linje per eksempel i eksempellisten. Fra metoder menyen i analyseprogramvaren, laste 436 Gjeldende spme etanol 2013 3min absorbere 2_5min rg kjøre. METH for hvert eksempel på eksempellisten.
    1. Fyll ut prøvelisten, som starter med luft, vann, 5 M NaCl/protease cocktail blanks. Deretter går inn i standardene i rekkefølge, fra 0,3125 til 40 mM. Følg standardene med en andre runde av luft, vann og 5 M NaCl / protease cocktail blanks.
    2. Skriv inn alle homogeniserte embryosupernatantprøver som skal testes, fra laveste til høyeste forventede etanolkonsentrasjon. Avslutt med å gå inn i en tredje og siste runde av luft, vann og 5 M NaCl / protease cocktail blanks.
  2. Tilsett gasskromatografhetteglassene til autosampler i den rekkefølgen prøvene ble angitt. La prøvene varme i 10–15 min. Start eksempelkjøringene i programvaren.
  3. Når alle prøvene og de siste tomrommene er kjørt, aktiverer du avslutningsmetoden i programvaren ved å legge til et endelig eksempel i eksempellisten og kjøre ventemodus. MEGTH. Sikkerhetskopier alle data som er anskaffet under eksempelkjøringene. Slå av utstyret i følgende rekkefølge: autosampler varmer, hydrogentank og, først etter at kromatograftemperaturen når 30 °C, lufttanken. La heliumtanken være på for å bevare vokssøylen.

9. Prøv etanol topp integrasjon og prøve konsentrasjonanalyse

MERK: Alle verdier fra 9.3 på ble beregnet i en Excel-fil som alle ligninger forhåndsutfylte.

  1. Når avslutningsmetoden er fullført, klikker du på Åpne kromatogram. Åpne mappen som inneholder resultatene. Eksempler integreres automatisk i dette programmet.
  2. I resultatene må du kontrollere at de riktige toppene er integrert (etanoltopper mellom 2 og 2,5). Når alle prøvene er bekreftet, skriver du ut eller eksporterer resultatene.
  3. Plott topphøyden på etanolstandardene på en graf. Beregn hellings-, Y-avskjærings- og R2-verdiene for etanolstandardene (R2 bør være >0,99).
    MERK: Disse verdiene vil bli brukt til å bestemme etanolkonsentrasjonen fra prøvetopphøyden.
  4. For hver prøve trekker du topphøyden på prøven fra Y-avskjæringen av etanolstandardene. Del denne verdien ved hellingen av etanolstandardene for å oppnå etanolverdien for hver prøve i GC-hetteglassene.

Equation 3

  1. For å beregne etanolkonsentrasjonen i embryoene, beregnførst fortynningsfaktoren for hver prøve. Ta volummålet beregnet i trinn 2.3 i denne protokollen og del det med volummålet pluss 500 μL. Dette representerer 5 M NaCl/protease cocktailoppløsning lagt til hver prøve under embryobehandling (trinn 5.3 og 5.4).

Equation 4

  1. Bruk denne prøvefortynningsfaktoren til å multiplisere med prøveetanolverdien for hver prøve. Resultatene vil være i mM konsentrasjon. Beregn mediereferanseprøver ved å multiplisere medieetanolverdien med fortynningsfaktoren på 10.

Equation 5

Equation 6

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Blodetanolnivåer kan ikke bestemmes i tidlig embryonale sebrafisk, fordi de mangler et fullt dannet sirkulasjonssystem. For å bestemme nivået av etanolkonsentrasjon i sebrafiskembryoene, måles etanolnivåene direkte fra homogenisert embryonalvev. For å måle de embryonale etanolkonsentrasjonene må det embryonale volumet tas i betraktning. Embryoet (eggeplomme festet) sitter inne i chorion (eggeskall) omgitt av ekstraembryonisk væske (Figur 1). Ethvert volummål på embryoet må gjøres på embryoer på eksponeringstidspunktet, fordi embryonale volum vil endres over utviklingstiden etter hvert som embryoet øker i størrelse. I tillegg må hvordan embryoet behandles tas i betraktning, så vel som det embryonale volumet, fordi begge disse elementene skaper fortynningsfaktorer som brukes til å beregne embryonale etanolnivåer.

Fordi embryoet ikke er en perfekt sfære, spesielt etter 10 hkf, ble vannforskyvning brukt til å vurdere embryonale volum. Denne studien brukte embryoer ved 24 hkf. Volumet av embryoer både i deres kor og de som ble fjernet fra deres chorion ble målt. Disse volumene var 1,97 (± 0,4 SD) μL for embryoet med ekstraembryonisk væske, og 1,1 (± 0,22 SD) μL for embryoet alene (Tabell 1). Denne forskjellen mellom embryoet med ekstraembryonisk væske og embryoet alene er volumet av den ekstraembryonale væsken, som omgir embryoet inne i koret (Figur 1). Denne forskjellen er avgjørende for å bestemme etanolkonsentrasjonen av embryoet alene i prøvene. Fra analysen utgjorde embryoet 56 % av det totale volumet av embryoet med ekstraembryonisk væske inne i koret (tabell 1). Etter hvert som embryoet vokste, økte det embryonale volumet over tid, noe som resulterte i en reduksjon i volumet av den ekstraembryonale væsken25. Ved måling av etanolkonsentrasjoner fra embryoer som fortsatt er i sitt kor, må vanninnholdet i både embryoet og den ekstraembryonale væsken tas i betraktning.

Tidligere publisert arbeid har vist at vannfraksjonen i embryoet alene er 73,6%29. Dette resultatet ble oppnådd ved hjelp av en kombinasjon av volummål, elektronspinn resonansspektroskopi og magnetisk resonansmikroskopi. For å bekrefte dette resultatet ble embryoer veid alene før og etter baking ved 70 °C, som tidligere beskrevet25. Denne prosessen fjerner alt vann fra embryoet. Endringen i vekt representerer mengden vann i embryoet. Fra denne analysen inneholdt et 24 hkfembryo ~72% vann mens et 48 hpf embryo inneholdt ~ 76%. Begge disse verdiene er svært lik 73,6% embryonale vannvolum tidligere beregnet29. Dette tyder på at vannvolumet av embryoet endres lite gjennom tidlig utvikling.

Basert på det publiserte arbeidet ved hjelp av flere tilnærminger for å beregne vannvolum i embryoet, ble 73,6% brukt som embryosyret vanninnhold for alle de presenterte analysene. Dette resulterte i vann bestående av 0,82 μL av 1,1 μL embryonale volum (Tabell 1). Fra dette ble volumet av ekstraembryonisk væske beregnet som 0,86 μL. Av det totale vannvolumet av embryoet med ekstraembryonisk væske finnes 49 % i embryoet og 51 % er i ekstraembryonisk væske (tabell 1).

For gasskromatografianalysen ble bare 24 hkfembryoer som fortsatt er i sitt kor brukt (figur 1). I dette etanolregimet ble embryoer behandlet med 1 % etanolkonsentrasjon fra 6–24 hkf, selv om ulike etanolkonsentrasjoner og eksponeringstidsvinduer kan brukes avhengig av eksperimentell design. To grupper på 15 prøver (10 embryoer per prøve) og mediet som de ble behandlet med over 2 forskjellige eksperimentelle dager (tabell 2)ble analysert. Medienivåer kan variere fra eksperiment til eksperiment. For å ta høyde for dette ble medieetanolnivåer målt 5x per eksperimentell gruppe. I denne analysen var medienivåene 143,6 (± 2,3 SD) mM for gruppe 1 og 133,6 (± 2,7 SD) mM for gruppe 2. Disse verdiene er betydelig forskjellige ved hjelp av en ikke-paret t-test (p = 0,0002). Embryoene med ekstraembryonisk væske var i gjennomsnitt 63,5 (± 17,1 SD) mM og 53,1 (± 12,6 SD) mM for henholdsvis gruppe 1 og 2. Konsentrasjonen var imidlertid ikke signifikant forskjellig mellom de 2 gruppene embryoer med ekstraembryonisk væske (ikke-parkoblet t test, p = 0,07). Ubehandlet kontroll embryoer ble målt ved 0 mM. På grunn av variasjonen i medienivåene ble et forhold mellom embryonal etanolkonsentrasjon/medienivåer av etanol for hver prøve beregnet. Gruppe 1 hadde 44 % av medieetanolnivåene, mens gruppe 2 hadde 40 % av medieetanolnivåene(figur 3 og tabell 2).

Figure 1
Figur 1: Et bilde av et embryo ved 24 timer etterbefruktning (hpf) inne i koret. Embryoet og eggeplommen er omgitt av den ekstraembryonale væsken, som alle ligger inne i koret. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Protokoll for å måle embryoer og behandle embryoene for analyse. (A) Ti 24 hkf embryoer overført til et 1,5 ml mikrocentrifugerør merket med et volum på 250 μL. (B) Mikrocentrifugerøret med embryoer fylt med vann (vann er myed slik at det er lettere å se ved 250 μL-merket). (C) Alt vannet fjernes fra røret og veies. (D) Ti embryoer overført til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Vannet ble fjernet som i (C) og erstattet med 50 μL protease cocktail. (E) Etter 10 min ble 450 μL 5 M NaCl lagt til røret fra (D). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Boks og whisker plott av forholdet mellom etanol konsentrasjon av prøver til media. Etanolkonsentrasjonfor hver gruppe ble delt på gjennomsnittet av medieprøvene i den gruppen. Gruppe 1 inneholdt 44 % av medienivåene, mens gruppe 2 inneholdt 40 %. I begge gruppene, n = 15; 10 embryoer per prøve. Grupper ble sammenlignet med en enveis ANOVA med en Tukeys post hoc-analyse (****p < 0,0001). Værhår representerer minimum til maksimum. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Embryo og embryo + Ekstraembryo vannvolumer (μL)
Vannog vann
Totalt volumb % av totalt volum (V) Embryonisk volum (W) Ekstraembryonisk volum (X) % Vann i Embryo (Y) % Vann i ekstraembryonisk (Z)
Embryo + Ekstraembryonisk (EE)c 1,97 ± 0,4
Embryo 24 hkf (E)c 1,11 ± 0,22 56% 0.82 0.86 49% 51%
Beregninger
V (andre) Embryo % av totalt volum = Totalt volum av E ÷ Totalt volum av EE
W (andre) Embryonisk vannvolum = V × 73,6%
X (andre) Ekstraembryonisk vannvolum = W – Totalt volum av EE
Y% Vann i embryo = (W + X)/W × 100
Z% Vann i Ekstraembryonic = 100 – Y
en Embryonisk vannvolum ble beregnet fra Hagedorn et al.29.
b (andre) Verdier rapporteres som ± standardavvik (SD).
cn = 13; 10 embryoer per prøve

Tabell 1: Beregning av vannvolum for embryoene med ekstraembryonisk væske. Volumet ble beregnet fra 13 prøver (10 embryoer per prøve) fra 24 hpf embryoer med ekstraembryonisk væske fortsatt i korog embryoer fjernet fra deres chorion. Verdier rapporteres som gjennomsnittlig ± SD.

Etanol Konsentrasjon av embryoer og medier (mM)en
Gruppe 1 Gruppe 2 Kombinert
Medier (M)b 143,6 ± 2,3 133,6 ± 2,7 138,6 ± 5,8
Embryo + Ekstraembryonisk (EE)c 63,5 ± 17,1 53,1 ± 12,6 58,3 ± 15,7
Forholdet mellom etanol - embryo til media (1) 0,44 ± 0,12 0,40 ± 0,09 0,42 ± 0,11
Beregninger
1.1 11 Forholdet mellom etanol = EE ÷ M
en Verdier rapporteres som ± SD.
bn = 5
cn = 15; 10 embryoer per prøve
d (andre) Verdier er gjennomsnittet av grupper 1 og 2.

Tabell 2: Beregninger av etanolkonsentrasjon i embryoer med ekstraembryonisk væske og media (mM). Medieeksempler var direkte tiltak fra media (n = 5 per gruppe). Embryonisk etanolkonsentrasjon ble beregnet fra 15 prøver (10 embryoer per prøve) fra 24 hpf embryoer med ekstraembryonisk væske. Forholdet mellom etanolkonsentrasjonene av embryoene med ekstraembryonisk væske og media ble beregnet. Verdier rapporteres som gjennomsnittlig ± SD.

Beregning av etanol i embryoeta,b
Embryo (Y) Forhold til medier (Z)
32,7 ± 8,8 mM 0,24 ± 0,06
Beregninger
Y (andre artilleri Embryonisk etanol = 58,3 mM (tabell 2) × 56% (tabell 1)
Z (andre) Forholdet mellom etanol = Y ÷ 138,6 mM (tabell 2)
en Verdier er gjennomsnittet av grupper 1 og 2.
b (andre) Verdier rapporteres som ± SD.

Tabell 3: Beregning av etanol i embryoet. Embryonisk etanolkonsentrasjon ble beregnet som 56 % av den totale etanolkonsentrasjonen av embryoet med ekstraembryonisk væske. Dette ble deretter rapportert som et forhold mellom embryo og media. Verdier rapporteres som gjennomsnittlig ± SD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Som et utviklingsmodellsystem er sebrafisk ideelt egnet til å studere virkningen av miljøfaktorer på utvikling. De produserer et stort antall eksternt befruktede embryoer, noe som gir presis timing og doseringparadigmer i etanolstudier. Dette, kombinert med live imaging evner og genetisk og utviklingsmessig bevaring med mennesker, gjør sebrafisk et kraftig modellsystem for teratologi studier. Beskrevet er en protokoll for måling av embryonale etanolkonsentrasjoner i utviklingen av sebrafiskembryoer ved hjelp av hodeplassgasskromatografi.

Å bestemme embryonaletanolkonsentrasjon er avgjørende for å forstå virkningen av etanol til det utviklende embryoet. I gnagermodeller korrelerer blodetanolkonsentrasjoner med vevskonsentrasjoner26. Det er imidlertid ikke mulig å vurdere blodetanolnivåer i tidlig embryonal utvikling i en sebrafisk. Head space gass kromatografi har blitt brukt til å måle etanol nivåer i ulike eksperimentelle paradigmer, inkludert sebrafisk25,30,31,32,33,34,35. Denne protokollen kan imidlertid brukes til å måle mange forskjellige miljøfaktorer, selv om volatiliteten til disse ulike faktorene må være høy nok til å måle kvantitativt og en gasskromatografkolonne må velges basert på polariteten til de aktuelle forbindelsene. I tillegg er sebrafisk best egnet til å studere virkningen av vannløselige faktorer, fordi eksponering for hydrofobe faktorer er ekstremt vanskelig å analysere i fisk.

Denne protokollen vil tillate forskere å direkte vurdere etanolkonsentrasjoner i sebrafiskembryoer. Imidlertid må flere faktorer tas opp for å sikre nøyaktige målinger av embryonale etanolkonsentrasjoner. Fordi etanolnivåer i totalt embryonale vev ble målt, måtte embryonale volum vurderes. Etter 10 hpf begynner embryoet somitogenesis (somitdannelse) og er ikke lenger en sfære (Figur 1). For å vurdere embryonale volum ble vannforskyvning brukt på 10 samlede embryoer per prøve. Hver prøve besto av 10 embryoer av to grunner: for det første for å redusere feil fra pipettering av små volumer, og for det andre, for å gjennomsnittlig ut små svingninger i embryovolumer. Ved måling av embryonalvolum er det viktig å vurdere presisjonen av pipettering og veiing. Selv bruk av 10 embryoer per prøve er på den nedre grensen for presisjon for både pipetter og vekten som brukes til å veie embryoene. Med utstyret tilgjengelig, ville bruk av færre enn 10 embryoer ha påvirket analysene. Dette begrenser ikke forskerne fra å bruke færre embryoer per prøve så lenge utstyrspresisjon vurderes.

Embryonisk volum er en faktor som påvirker prøveanalyse. En annen nøkkelfaktor er embryonisk behandlingshastighet, fordi etanol er flyktig. I tillegg, etanol raskt likevektier i flere dyrestudier25,36,37. Vår vaskeprotokoll er utformet for raskt å fjerne etanol som holder seg til den utvendige overflaten av koret. I denne studien påvirket denne vaskeprotokollen ikke embryonale etanolnivåer, selv om lengre eller flere vask kan påvirke embryonale etanolkonsentrasjoner25,38. Likevel er en tredje faktor å ta hensyn til er fortynningen av det embryonale volumet under behandlingen. Denne protokollen bruker en protease cocktail for å forringe chorion samt 5 M NaCl å denaturere alle proteiner, inkludert alkohol behandling enzymer.

Til slutt har en rekke analyser og rapporteringsmetoder blitt beskrevet i et bredt utvalg av sebrafiskstudier. På grunn av variasjon i ulike prøver av en studie eller sammenligning av ulike studier, er riktig rapportering av etanolkonsentrasjon kritisk25,38. Metoder ved hjelp av indirekte (vanligvis enzymatiske tiltak) er avhengige av analyse av en sekundær metabolitt. I så fall kan frekvensen av enzymatisk aktivitet variere og hindre presis analyse av etanolkonsentrasjon. Denne metoden måler direkte etanolnivåer, og etanolkonsentrasjoner rapporteres som et forhold mellom embryo- og mediekonsentrasjoner. Våre resultater er i tråd med en voksende konsensus av en 24 hpf embryo som inneholder ~ 30% av mediekonsentrasjoner (Tabell 3)25,38,39,40. Overraskende, denne 30% embryonale etanol konsentrasjonen er uavhengig av media konsentrasjon, og det er ikke godt forstått hva som skaper denne likevekt25,38. Embryoer eldre enn 24 hkf viser reduksjon i etanolkonsentrasjoner, med 48 hpf embryoer som inneholder nesten halvparten av etanolinnholdet i et 24 hkfembryo25. Resultatene våre bestemmer imidlertid ikke etanol-vannlikevekten. Gitt hastigheten som etanol likevekter, samt volatiliteten til etanol, er det utrolig vanskelig å vurdere vannvolumendringer i selve embryoet på grunn av etanoleksponering. Forsøk på å måle volumet av en etanolbehandlet embryoprøve ved hjelp av vannforskyvning vil føre til tap av etanol fra embryoet under målingen. Ved hjelp av mer presise mikroskopi- og spektroskopimetoder enn de som er beskrevet ovenfor, kan det være mulig å bestemme etanol-vannlikevekt i et embryo ved å måle begge direkte samtidig.

Samlet sett er protokollen beskrevet her et kraftig verktøy for å vurdere embryonale etanolkonsentrasjoner i utviklingen av sebrafiskembryoer. Denne informasjonen er avgjørende for å standardisere FASD-studier ved hjelp av sebrafisk. Evnen til å nøyaktig kontrollere etanolbehandling paradigmer og direkte kvantifisere embryonale etanol konsentrasjoner styrker funksjonaliteten til sebrafisk modellen for menneskelige FASD studier. Til syvende og sist vil dette arbeidet i stor grad forbedre vår forståelse av FASD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forskningen som presenteres i denne artikkelen ble støttet av tidligere tilskudd fra National Institutes of Health/National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIH/NIDCR) R01DE020884 til J.K.E. og National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (NIH/NIAAA) F32AA021320 til C.B.L. og ved dagens tilskudd fra National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse (NIH/NIAAA) R00AA023560 til C.B.L. Vi takker Rueben Gonzales for å gi og bistå med gasskromatografanalyse. Vi takker Tiahna Ontiveros og Dr. Gina Nobles skrive hjelp.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Air Provided by contract to the university
Analytical Balance VWR 10204-962
AutoSampler, CP-8400 Varian Gas Chromatograph Autosampler
Calcium Chloride VWR 97062-590
Ethanol Decon Labs 2701
Gas chromatograph vial with polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap 2 mL Agilent 8010-0198 Can reuse the vials after cleaning, but not the caps/septa
Gas Chromatograph, CP-3800 Varian
Helium Provided by contract to the university
HP Innowax capillary column Agilent 19095N-123I 30 m x 0.53 mm x 1.0 μm film thick
Hyrdogen Provided by contract to the university
Magnesium Sulfate (Heptahydrate) Fisher Scientific M63-500
Microcentrifuge tube 1.5 mL Fisher Scientific 2682002
Micropipette tips 10 μL Fisher Scientific 13611106
Micropipette tips 1000 μL Fisher Scientific 13611127
Micropipette tips 200 μL Fisher Scientific 13611112
Petri dishes 100 mm Fisher Scientific FB012924
Pipetman L p1000L Micropipette Gilson FA10006M
Pipetman L p200L Micropipette Gilson FA10005M
Pipetman L p2L Micropipette Gilson FA10001M
Polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap Agilent 5190-7021 Replacement caps/septa for gas chromatograph vials
Potassium Chloride Fisher Scientific P217-500
Potassium Phosphate (Dibasic) VWR BDH9266-500G
Pronase VWR 97062-916
Silica Beads .5 mm Biospec Products 11079105z
Silica Beads 1.0 mm Biospec Products 11079110z
Sodium Bicarbonate VWR BDH9280-500G
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-500
Sodium Phosphate (Dibasic) Fisher Scientific S374-500
Solid-phase microextraction fiber assembly Carboxen/Polydimethylsiloxane Millipore Sigma 57343-U Replacement fibers
Star Chromatography Workstation Varian Chromatography software
Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa Millipore Sigma 23154 Replacement inlet septa

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elliott, E. J., Payne, J., Morris, A., Haan, E., Bower, C. Fetal alcohol syndrome: a prospective national surveillance study. Archive of Diseases in Childhood. 93, (9), 732-737 (2008).
  2. Cudd, T. A. Animal model systems for the study of alcohol teratology. Experimental Biology and Medicine. 230, (6), 389-393 (2005).
  3. Williams, J. F., Smith, V. C. Committee on Substance Abuse. Fetal Alcohol Spectrum Disorders. Pediatrics. 136, (5), 1395-1406 (2015).
  4. Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).
  5. Petrelli, B., Weinberg, J., Hicks, G. G. Effects of prenatal alcohol exposure (PAE): insights into FASD using mouse models of PAE. Biochemistry and Cell Biology. 96, (2), 131-147 (2018).
  6. Mayfield, J., Arends, M. A., Harris, R. A., Blednov, Y. A. Genes and Alcohol Consumption: Studies with Mutant Mice. International Review Neurobiology. 126, 293-355 (2016).
  7. Marquardt, K., Brigman, J. L. The impact of prenatal alcohol exposure on social, cognitive and affective behavioral domains: Insights from rodent models. Alcohol. 51, 1-15 (2016).
  8. Sulik, K. K. Genesis of alcohol-induced craniofacial dysmorphism. Experimental Biology and Medicine. 230, (6), 366-375 (2005).
  9. Lipinski, R. J., et al. Ethanol-induced face-brain dysmorphology patterns are correlative and exposure-stage dependent. PLoS One. 7, (8), 43067 (2012).
  10. Eberhart, J. K., Parnell, S. The genetics of fetal alcohol spectrum disorders. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40, (6), 1154-1165 (2016).
  11. Becker, H. C., Diaz-Granados, J. L., Randall, C. L. Teratogenic actions of ethanol in the mouse: a minireview. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 55, (4), 501-513 (1996).
  12. Ahlgren, S. C., Thakur, V., Bronner-Fraser, M. Sonic hedgehog rescues cranial neural crest from cell death induced by ethanol exposure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, (16), 10476-10481 (2002).
  13. Loucks, E. J., Ahlgren, S. C. Deciphering the role of Shh signaling in axial defects produced by ethanol exposure. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 85, (6), 556-567 (2009).
  14. Hong, M., Krauss, R. S. Cdon mutation and fetal ethanol exposure synergize to produce midline signaling defects and holoprosencephaly spectrum disorders in mice. PLoSGenetics. 8, (10), 1002999 (2012).
  15. Aoto, K., Shikata, Y., Higashiyama, D., Shiota, K., Motoyama, J. Fetal ethanol exposure activates protein kinase A and impairs Shh expression in prechordal mesendoderm cells in the pathogenesis of holoprosencephaly. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 82, (4), 224-231 (2008).
  16. Deltour, L., Ang, H. L., Duester, G. Ethanol inhibition of retinoic acid synthesis as a potential mechanism for fetal alcohol syndrome. The FASEB Journal. 10, (9), 1050-1057 (1996).
  17. Wentzel, P., Eriksson, U. J. Ethanol-induced fetal dysmorphogenesis in the mouse is diminished by high antioxidative capacity of the mother. Toxicological Sciences. 92, (2), 416-422 (2006).
  18. Karacay, B., Mahoney, J., Plume, J., Bonthius, D. J. Genetic absence of nNOS worsens fetal alcohol effects in mice. II: microencephaly and neuronal losses. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 39, (2), 221-231 (2015).
  19. Bonthius, D. J. Jr, Winters, Z., Karacay, B., Bousquet, S. L., Bonthius, D. J. Importance of genetics in fetal alcohol effects: null mutation of the nNOS gene worsens alcohol-induced cerebellar neuronal losses and behavioral deficits. Neurotoxicology. 46, 60-72 (2015).
  20. Bonthius, D. J., et al. Deficiency of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) worsens alcohol-induced microencephaly and neuronal loss in developing mice. Brain Research. Developmental Brain Research. 138, (1), 45-59 (2002).
  21. Langevin, F., Crossan, G. P., Rosado, I. V., Arends, M. J., Patel, K. J. Fancd2 counteracts the toxic effects of naturally produced aldehydes in mice. Nature. 475, (7354), 53-58 (2011).
  22. Lovely, C. B., Fernandes, Y., Eberhart, J. K. Fishing for Fetal Alcohol Spectrum Disorders: Zebrafish as a Model for Ethanol Teratogenesis. Zebrafish. 13, (5), 391-398 (2016).
  23. Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96, (2), 88-97 (2018).
  24. McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140, (15), 3254-3265 (2013).
  25. Lovely, C. B., Nobles, R. D., Eberhart, J. K. Developmental age strengthens barriers to ethanol accumulation in zebrafish. Alcohol. 48, (6), 595-602 (2014).
  26. Harris, R. A., Trudell, J. R., Mihic, S. J. Ethanol's molecular targets. Science Signaling. 1, (28), (2008).
  27. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish Danio (Brachydanio) rerio. University of Oregon Press. Eugene, OR. (1993).
  28. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Developmental Biology. 248, (2), 307-318 (2002).
  29. Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. Water Distribution and permeability of zebrafish embryos, Brachydanio rerio. Journal of Experimental Zoology. 278, (6), 356-371 (1997).
  30. Lippi, G., et al. The alcohol used for cleansing the venipuncture site does not jeopardize blood and plasma alcohol measurement with head-space gas chromatography and an enzymatic assay. Biochemia Medica. 27, (2), 398-403 (2017).
  31. Poklis, J. L., Wolf, C. E., Peace, M. R. Ethanol concentration in 56 refillable electronic cigarettes liquid formulations determined by headspace gas chromatography with flame ionization detector (HS-GC-FID). Drug Testing and Analysis. 9, (10), 1637-1640 (2017).
  32. Heit, C., et al. Quantification of Neural Ethanol and Acetaldehyde Using Headspace GC-MS. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40, (9), 1825-1831 (2016).
  33. Chun, H. J., Poklis, J. L., Poklis, A., Wolf, C. E. Development and Validation of a Method for Alcohol Analysis in Brain Tissue by Headspace Gas Chromatography with Flame Ionization Detector. Journal of Analytical Toxicology. 40, (8), 653-658 (2016).
  34. Schlatter, J., Chiadmi, F., Gandon, V., Chariot, P. Simultaneous determination of methanol, acetaldehyde, acetone, and ethanol in human blood by gas chromatography with flame ionization detection. Human and Experimental Toxicology. 33, (1), 74-80 (2013).
  35. Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography. Journal of Visualized Experiments. (67), e4142 (2012).
  36. Adalsteinsson, E., Sullivan, E. V., Mayer, D., Pfefferbaum, A. In vivo quantification of ethanol kinetics in rat brain. Neuropsychopharmacology. 31, (12), 2683-2691 (2006).
  37. Quertemont, E., Green, H. L., Grant, K. A. Brain ethanol concentrations and ethanol discrimination in rats: effects of dose and time. Psychopharmacology. 168, (3), 262-270 (2003).
  38. Flentke, G. R., Klinger, R. H., Tanguay, R. L., Carvan, M. J., Smith, S. M. An evolutionarily-conserved mechanism of calcium-dependent neurotoxicity. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 38, (5), 1255-1265 (2014).
  39. Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish. Neurotoxicology and Teratology. 26, (6), 769-781 (2004).
  40. Zhang, C., Ojiaku, P., Cole, G. J. Forebrain and hindbrain development in zebrafish is sensitive to ethanol exposure involving agrin, Fgf, and sonic hedgehog function. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 97, (1), 8-27 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics