Quantificação dos níveis de etanol em embriões de zebrafish usando cromatografia de gás espacial da cabeça

Developmental Biology

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Summary

Este trabalho descreve um protocolo para quantificar os níveis de etanol em um embrião de zebrafish usando cromatografia de gás espacial da cabeça de métodos de exposição adequados ao processamento de embriões e análise de etanol.

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Lovely, C. B. Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography. J. Vis. Exp. (156), e60766, doi:10.3791/60766 (2020).

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Abstract

Distúrbios do Espectro Alcoólica Fetal (FASD) descrevem um contínuo altamente variável de defeitos de desenvolvimento induzidos por etanol, incluindo dismorfiologias faciais e prejuízos neurológicos. Com uma patologia complexa, a FASD afeta aproximadamente 1 em cada 100 crianças nascidas nos Estados Unidos a cada ano. Devido à natureza altamente variável da FASD, os modelos animais têm se mostrado críticos em nossa compreensão mecanicista atual de defeitos de desenvolvimento induzidos por etanol. Um número crescente de laboratórios se concentrou no uso de zebrafish para examinar defeitos de desenvolvimento induzidos por etanol. Os zebrafish produzem um grande número de embriões fertilizados externamente, geneticamente tráteis e translúcidos. Isso permite que os pesquisadores controlem precisamente o tempo e a dosagem da exposição ao etanol em múltiplos contextos genéticos e quantifiquem o impacto da exposição embrionária do etanol por meio de técnicas de imagem ao vivo. Isso, combinado com o alto grau de conservação da genética e do desenvolvimento com humanos, provou que os zebrafish são um modelo poderoso para estudar a base mecanicista da teratogenicidade do etanol. No entanto, os regimes de exposição ao etanol variaram entre diferentes estudos de zebrafish, o que confundiu a interpretação dos dados de zebrafish nesses estudos. Aqui está um protocolo para quantificar as concentrações de etanol em embriões de zebrafish usando cromatografia de gás espacial da cabeça.

Introduction

Os Distúrbios do Espectro Alcoólica Fetal (FASD) descrevem uma ampla gama de deficiências neurológicas e dismorfimias craniofaciais associadas à exposição embrionária do etanol1. Múltiplos fatores, incluindo tempo e dosagem de exposição ao etanol e fundo genético, contribuem para a variação do FASD2,3. Em humanos, a complexa relação dessas variáveis torna o estudo e a compreensão da etiologia do FASD desafiador. Os modelos animais têm se mostrado cruciais no desenvolvimento da nossa compreensão da base mecanicista da teratogenicidade do etanol. Uma grande variedade de sistemas de modelos animais tem sido usada para estudar múltiplos aspectos do FASD e os resultados têm sido notavelmente consistentes com o que é encontrado em exposição em humanos4. Os sistemas de modelos de roedores são usados para examinar muitos aspectos do FASD, sendo os camundongos os mais comuns5,6,7. A maior parte deste trabalho tem se concentrado em defeitos de desenvolvimento para a exposição precoce do etanol8, embora a exposição posterior ao etanol tenha sido demonstrada para causar anomalias de desenvolvimento também9. Além disso, as capacidades genéticas dos camundongos ajudaram muito em nossa capacidade de sondar os fundamentos genéticos do FASD10,11. Esses estudos em camundongos sugerem fortemente que existem interações gene-etanol com a via sônica de ouriço, sinalização de ácido retinóico, dismutase de superóxido, óxido nítrico sintetizador I, Aldh2 e Fancd28,10,11,12,13,14,15,16,17,18, 19,20,21. Esses estudos mostram que os modelos animais são fundamentais para avançar em nossa compreensão da FASD e seus mecanismos subjacentes.

O zebrafish emergiu como um poderoso sistema modelo para examinar muitos aspectos da teratogênese do etanol22,23. Devido à sua fertilização externa, alta fecundidade, tratério genético e capacidades de imagem ao vivo, os zebrafish são idealmente adequados para estudar fatores como tempo, dosagem e genética da teratogênese do etanol. O etanol pode ser administrado a embriões precisamente encenados e os embriões podem então ser imagem para examinar o impacto direto do etanol durante os processos de desenvolvimento. Este trabalho pode estar relacionado diretamente aos seres humanos, pois os programas genéticos de desenvolvimento são altamente conservados entre zebrafish e humanos e, portanto, podem ajudar a orientar os estudos humanos da FASD24. Embora os zebrafish tenham sido usados para examinar a teratogênese do etanol, a falta de consenso em relatar concentrações embrionárias de etanol torna difícil a comparação com os humanos25. Nos sistemas de mamíferos, os níveis de álcool no sangue correlacionam-se diretamente aos níveis de etanol tecidual26. Muitos dos estudos de zebrafish tratam embriões antes da formação completa de seu sistema circulatório. Sem amostra materna para examinar, é necessário um processo para avaliar as concentrações de etanol para quantificar os níveis de etanol dentro do embrião. Aqui descrevemos um processo para quantificar as concentrações de etanol em um embrião de zebrafish em desenvolvimento usando cromatografia de gás espacial da cabeça.

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Protocol

Todos os embriões de zebrafish utilizados neste procedimento foram levantados e criados seguindo protocolos estabelecidos da IACUC27. Esses protocolos foram aprovados pela Universidade do Texas em Austin e pela Universidade de Louisville.

NOTA: A linha de zebrafish Tg (fli1:EGFP)y1 foi utilizada neste estudo28. Toda a água utilizada neste procedimento é água de osmose reversa estéril. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o Graphpad Prism v8.2.1.

1. Fazendo mídia embrionária

  1. Para fazer um estoque de 20x de mídia embrionária, dissolva 17,5 g de NaCl, 0,75 g de KCl, 2,9 g de CaCl2, 0,41 g de K2HPO4, 0,142 g de NA2HPO4, e 4,9 g de MgSO4·7H2O em 1 L de água. Ignore o precipitado branco que se forma; isso não afetará a mídia. Filtrar esterilizar a solução de estoque e armazenar a 4 °C.
  2. Para criar a solução de mídia embrionária funcionando, dissolva 1,2 g de NaHCO3 em 1 L de 20x estoque de mídia embrionária e adicione 19 L de água. Mantenha a solução de mídia embrionária funcionando a 28 °C.

2. Medir o volume embrionário usando o deslocamento da água

NOTA: Neste protocolo, são utilizados embriões de pós-fertilização 24h (hpf)(Figura 1). Os embriões utilizados nas medições de volume não são utilizados na análise do etanol.

  1. Coloque 10 embriões e fluido extraembrionário em tubo de microcentrífuga de 1,5 mL marcado em um volume de 250 μL (Figura 2A). Adicione água à linha de enchimento de 250 μL (consulte amostra com água dyed na Figura 2B).
  2. Repita a etapa 2.1 para configurar recipientes para embriões que tiveram suas corions removidas.
    1. Para remover a corção, coloque os embriões em suas corions em uma placa de Petri de 100 mm com 2 mg/mL de coquetel protease em meios de embriões à temperatura ambiente (RT) por 10 min. A cada poucos minutos, gire suavemente os embriões para quebrar a corsão.
    2. Uma vez que todos os embriões estejam livres de sua corionria, remova os embriões descorionados da mídia protease coquetel/embrião e coloque em uma nova placa de Petri de 100 mm com mídia de embrião fresco para lavar os embriões. Repita esta etapa de lavagem 1 vez mais tempo (para um total de 2 lavhes). Transfira os embriões para uma placa de Petri fresca de 100 mm.
  3. Usando a menor ponta possível e sem danificar os embriões, remova cuidadosamente todo o líquido de todo o ambiente usando um micropipettor p200(Figura 2C) e pese a água com uma balança com precisão <0,1 mg. Para determinar o volume da amostra de 10 embriões, subtraia o peso/volume da água (1 mL de água = 1 g de água.) removido de 250 μL. Para determinar o volume de um único embrião, divida a diferença entre 250 μL e o peso da água removida por 10.

Equation 1

Equation 2

3. Tratar embriões com etanol

  1. Reúna embriões de tanques de acasalamento e coloque em uma placa de Petri padrão de 100 mm. Não conte mais do que 100 embriões por prato único de Petri e incuba a 28,5 °C.
    NOTA: Se a corção for removida (etapa 2.2), ela precisa ser removida antes de adicionar etanol.
  2. Às 6 hpf, adicione 100 embriões a uma nova placa de petri padrão de 100 mm, seja com mídia embrionária ou mídia embrionária + 1% de etanol (v/v). Cubra, mas NÃO seque a placa de Petri. Coloque os embriões em uma incubadora de temperatura baixa fixada em 28,5 °C por 18 h, ou até que os embriões atinjam o ponto de tempo de desenvolvimento de 24 hpf.

4. Preparar fluxo de trabalho antes de processar os embriões para cromatografia de gás espacial da cabeça

  1. Faça uma solução de 5 M NaCl na água (450 μL serão necessários por tubo de amostra) para desnaturar todas as proteínas e prevenir o metabolismo do etanol. Faça o coquetel protease (Tabela de Materiais) em uma concentração de 2 mg/mL em meios de embriões.
  2. Rotular um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e um frasco de cromatógrafo de gás de 2 mL para cada amostra. Rotular frascos adicionais de cromatógrafo de gás de 2 mL para os padrões de etanol descritos abaixo, bem como ar, água e os espaços em branco de 5 M NaCl/protease.
  3. Configure três micropipetres p200 dois conjuntos a 50 μL, e o terceiro conjunto para 200 μL; um micropipettor p1000 definido para 450 μL e um micropipettor p2 definido para 2 μL. Para as pipetas de vidro usadas para transferir embriões das placas de Petri para os tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, passe rapidamente a ponta da pipeta através de uma chama para suavizar as bordas para não danificar os embriões ao atraí-los para a pipeta.

5. Processamento de embriões para cromatografia de gás espacial da cabeça

NOTA: Tanto os embriões em suas corions quanto os anteriormente removidos de suas corions são tratados da mesma forma para consistência no cálculo de fatores de diluição.

  1. Usando os dois micropipetres p200 definidos para 50 μL, desenhe 50 μL da solução de coquetel protease em um e desenhe 50 μL de água para o segundo.
  2. Usando a pipetette de vidro e o micropipettor, coloque rapidamente 10 embriões (a partir da etapa 3.2) em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e feche a tampa (como descrito na Figura 2A). Repita para que todas as amostras sejam testadas, controles e embriões tratados com etanol.
  3. Usando o micropipettor p200 definido para 200 μL, abra rapidamente a tampa e remova todos os meios residuais de embriões (conforme descrito na Figura 2C). Coloque rapidamente a pipeta contendo 50 μL de água no tubo e rapidamente, mas suavemente (para não danificar os embriões) adicione, em seguida, remova a água. Adicione rapidamente 50 μL da solução de coquetel protease do pipettor de espera e feche a tampa do tubo(Figura 2D).
    NOTA: Realize este processo uma amostra de cada vez.
  4. Deixe a amostra sentar-se na RT por 10 min para permitir que o coquetel protease degrade a corion. Em seguida, adicione rapidamente 450 μL de 5 M NaCl e feche a tampa do tubo(Figura 2E). Vortex as amostras por 10 min. Para acelerar o processo, configure a batedeira para vórtice várias amostras ao mesmo tempo.
    NOTA: Adicione uma pequena quantidade (~100 μL) de uma mistura de tala de sílica (2 tamanhos, 0,5 mm e 1 mm) a qualquer tubo com embriões com mais de 24 hpf. Em embriões mais antigos, o notochord permanecerá intacto independentemente de quanto tempo eles são homogeneizados.
  5. Depois de homogeneizar por 10 min, remova rapidamente 2 μL de supernatante embrião homogeneizado e adicione a um frasco de cromatógrafo a gás. Selar rapidamente o frasco com o boné politetrafluoroethtileno.

6. Preparando padrões de mídia e etanol

  1. Para preparar os padrões de mídia, diluir a mídia por um fator de 10 com uma solução de coquetel 5 M NaCl/protease. Adicione 2 μL de cada amostra a um frasco de cromatógrafo a gás e veda com uma tampa de politetrafluoetileno.
  2. Para preparar as normas do etanol, crie uma diluição serial de 100% de etanol na solução de coquetel 5 M NaCl/protease para as seguintes concentrações: 0,3125, 0,625, 1.25, 2,5, 5, 10, 20 e 40 mM. Adicione 2 μL de cada padrão a um frasco de cromatógrafo a gás e veda com uma tampa de politetrafluoroethtileno.

7. Preparando o cromatógrafo de gás espacial da cabeça

NOTA: Esta configuração e protocolo podem precisar ser alterados dependendo do cromatógrafo de gás utilizado. A cromatografia de gás espacial da cabeça é usada para quantificar os níveis de etanol, não para separação.

  1. Coloque o aquecedor para o amostrador automático a 58 °C e ligue. Permita que o aquecedor atinja 58 °C, e ligue as linhas de ar e gás hidrogênio alimentando o cromatógrafo gasoso (para ionização de chamas usada para quantificar o etanol).
    NOTA: O psi deve ser definido para operar adequadamente o cromatógrafo de acordo com as especificações do fabricante. Certifique-se de que a linha de hélio está ligado e definido para o psi adequado.
  2. Para o septo, certifique-se de que o número de amostras injetadas não é >100. Para a fibra de injeção, certifique-se de que o número de amostras injetadas não é >500.
    NOTA: Se algum deles for maior a quantidade de injeções, elas precisarão ser alteradas antes de executar as amostras de teste.
  3. Ligue o software de análise e certifique-se de que a estação de trabalho está configurada corretamente. Armazene todos os dados de acordo com os padrões de laboratório/departamento. Crie uma nova lista de amostras para que as amostras sejam executadas.
  4. Inicie o método de inicialização e aguarde que o detector de ionização de chamas se estabilize antes de executar as amostras. Uma vez estável, execute o método de inicialização de software para limpar a fibra.

8. Medidas de amostra usando cromatografia de gás espacial da cabeça

  1. Uma vez que o método de inicialização esteja completo, crie 1 nova linha por amostra na lista de amostras. A partir do cardápio de métodos no software de análise, carregue 436 Etanol spme corrente 2013 3min absorver 2_5min rg run. METANFETAMINA para cada amostra na lista de amostras.
    1. Preencha a lista de amostras, começando com o ar, água, 5 M NaCl/protease coquetéis em branco. Em seguida, entre nas normas em ordem, de 0,3125 a 40 mM. Siga os padrões com uma segunda rodada de ar, água e 5 m naCl/protease coquetéis em branco.
    2. Insira todas as amostras de supernatante de embriões homogeneizados para serem testadas, desde a menor até a maior concentração de etanol prevista. Termine entrando em uma terceira e última rodada do ar, água e 5 m naCl/protease coquetéis em branco.
  2. Adicione os frascos de cromatógrafo a gás ao amostrador automático na ordem em que as amostras foram inseridas. Deixe as amostras aquecerem por 10 a 15 min. Inicie a amostra executada no software.
  3. Depois de todas as amostras e os espaços em branco finais terem sido executados, ative o método de desligamento no software adicionando uma amostra final na lista de amostras e correndo em espera. METH. Respalda todos os dados adquiridos durante as corridas da amostra. Desligue o equipamento na seguinte ordem: aquecedor de amostragem automática, tanque de hidrogênio e, somente após a temperatura do cromatógrafo chegar a 30 °C, o tanque de ar. Deixe o tanque de hélio ligado para preservar a coluna de cera.

9. Amostra de etanol de integração máxima e análise de concentração amostral

NOTA: Todos os valores a partir de 9,3 on foram calculados em um arquivo excel que todas as equações pré-preenchidas.

  1. Uma vez que o método de desligamento esteja completo, clique no cromatograma Aberto. Abra a pasta contendo os resultados. As amostras são automaticamente integradas neste programa.
  2. Nos resultados, certifique-se de que os picos corretos tenham sido integrados (picos de etanol entre 2 e 2,5). Uma vez confirmadas todas as amostras, imprima ou exporte os resultados.
  3. Traçar a altura máxima dos padrões de etanol em um gráfico. Calcule os valores de inclinação, Intercept Y e R2 para as normas de etanol (R2 deve ser >0,99).
    NOTA: Esses valores serão utilizados para determinar a concentração de etanol a partir da altura do pico da amostra.
  4. Para cada amostra, subtraia a altura máxima da amostra da interceptação Y dos padrões de etanol. Divida esse valor pela inclinação das normas de etanol para obter o valor do etanol para cada amostra nos frascos gc.

Equation 3

  1. Para calcular a concentração de etanol nos embriões, primeiro calcule o fator de diluição para cada amostra. Tome a medida de volume calculada na etapa 2.3 deste protocolo e divida-a pela medida de volume mais 500 μL. Isso representa a solução de coquetel 5 M NaCl/protease adicionada a cada amostra durante o processamento de embriões (passos 5.3 e 5.4).

Equation 4

  1. Utilizando este fator de diluição amostral, multiplique pelo valor do etanol amostral para cada amostra. Os resultados serão na concentração de MM. Calcule as amostras de referência da mídia multiplicando o valor do etanol de mídia pelo fator de diluição de 10.

Equation 5

Equation 6

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Representative Results

Os níveis de etanol sanguíneo não podem ser determinados em zebrafish embrionário siciado precocemente, porque eles não têm um sistema circulatório totalmente formado. Para determinar o nível de concentração de etanol nos embriões de zebrafish, os níveis de etanol são medidos diretamente a partir de tecido embrionário homogeneizado. Para medir adequadamente as concentrações embrionárias de etanol, o volume embrionário deve ser levado em conta. O embrião (gema anexada) fica dentro da corção (casca de ovo) cercada por fluido extraembrionnico(Figura 1). Qualquer medida de volume do embrião deve ser feita em embriões no momento da exposição, porque o volume embrionário mudará em relação ao tempo de desenvolvimento à medida que o embrião aumenta de tamanho. Além disso, a forma como o embrião é processado deve ser levado em conta, bem como o volume embrionário, pois ambos os elementos criam fatores de diluição utilizados para calcular os níveis embrionários de etanol.

Como o embrião não é uma esfera perfeita, especialmente depois de 10 hpf, o deslocamento da água foi usado para avaliar o volume embrionário. Este estudo utilizou embriões a 24 hpf. O volume de embriões tanto em sua corsão quanto naqueles removidos de sua corion foram medidos. Esses volumes foram de 1,97 (± 0,4 SD) μL para o embrião com fluido extraembrionnico, e 1,1 (± 0,22 DD) μL apenas para o embrião(Tabela 1). Essa diferença entre o embrião com fluido extraembrionário e o embrião sozinho é o volume do fluido extraembrionnic, que circunda o embrião dentro da corion(Figura 1). Essa diferença é fundamental para determinar a concentração de etanol do embrião apenas nas amostras. A partir da análise, o embrião compreendeu 56% do total do volume do embrião com fluido extraembrionnic dentro da corion (Tabela 1). À medida que o embrião crescia, o volume embrionário aumentou com o tempo, resultando em uma diminuição no volume do fluido extraembrionnico25. Ao medir as concentrações de etanol de embriões ainda em sua corção, o teor de água tanto no embrião quanto no fluido extraembrionário deve ser levado em conta.

Trabalho simnamente publicado mostrou que a fração de água apenas no embrião é de 73,6%29. Este resultado foi obtido usando uma combinação de medidas de volume, espectroscopia de ressonância de giro eletrônico e microscopia de ressonância magnética. Para confirmar esse resultado, os embriões foram pesados sozinhos antes e depois de assar a 70 °C, como descrito anteriormente25. Este processo remove toda a água do embrião. A mudança de peso representa a quantidade de água no embrião. A partir dessa análise, um embrião de 24 hpf continha ~72% de água, enquanto um embrião de 48 hpf continha ~76%. Ambos os valores são extremamente semelhantes ao volume de água embrionária de 73,6% previamente calculado29. Isso sugere que o volume de água do embrião muda pouco durante o desenvolvimento precoce.

Com base no trabalho publicado utilizando múltiplas abordagens para calcular o volume de água no embrião, 73,6% foram utilizados como teor de água embrionária para todas as análises apresentadas. Isso resultou em água composta por 0,82 μL do 1,1 μL de volume embrionário (Tabela 1). A partir disso, o volume do fluido extraembrionnico foi calculado como 0,86 μL. Do volume total de água do embrião com fluido extraembrionnic, 49% está contido no embrião e 51% está no fluido extraembrionário(Tabela 1).

Para a análise da cromatografia gasosa, foram utilizados apenas 24 embriões de hpf ainda em sua corion (Figura 1). Neste regime de etanol, os embriões foram tratados com concentração de 1% (171 mM) de etanol de 6 a 24 hpf, embora diferentes concentrações de etanol e janelas de tempo de exposição possam ser usadas dependendo do design experimental. Foram analisados dois grupos de 15 amostras (10 embriões por amostra) e a mídia com a qual foram tratadas ao longo de 2 dias experimentais diferentes (Tabela 2). Os níveis de mídia podem variar de experiência para experimento. Para explicar isso, os níveis de etanol media foram medidos 5x por grupo experimental. Nesta análise, os níveis de mídia foram de 143,6 mM (± 2,3 SD) para o grupo 1 e 133,6 (± 2,7 SD) mM para o grupo 2. Esses valores são significativamente diferentes usando um teste t não emparelhado (p = 0,0002). Os embriões com fluido extraembrionário tiveram média de 63,5 mM (± 17,1 DM) e 53,1 (± 12,6 SD) mM para os grupos 1 e 2, respectivamente. No entanto, a concentração não foi significativamente diferente entre os 2 grupos de embriões com fluido extraembrionnico (teste t não emparelhado, p = 0,07). Embriões de controle não tratados foram medidos em 0 mM. Devido à variação dos níveis midiáticas, foi calculada uma razão de concentração embrionária de etanol/mediação do etanol para cada amostra. O Grupo 1 tinha 44% dos níveis de etanol de mídia, enquanto o grupo 2 tinha 40% dos níveis de etanol de mídia (Figura 3 e Tabela 2).

Figure 1
Figura 1: Uma imagem de um embrião às 24 h pós-fertilização (hpf) dentro da corion. O embrião e a gema estão cercados pelo fluido extraembrionnic, todos localizados dentro da corion. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 2
Figura 2: Protocolo para medir o volume embrionário e processar os embriões para análise. (A)Dez embriões de 24 hpf transferidos para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL marcado em um volume de 250 μL. (B) O tubo de microcentrífuga com embriões cheios de água (a água é cortida por isso é mais fácil de ver na marca de 250 μL). (C)Toda a água é removida do tubo e pesa. (D) Dez embriões transferidos para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. A água foi removida como em (C) e substituída por 50 μL de coquetel protease. (E) Após 10 min, 450 μL de 5 M NaCl foi adicionado ao tubo de(D). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 3
Figura 3: Parcela de caixa e bigode da proporção de concentração de etanol de amostras para mídia. A concentração de etanol para cada grupo foi dividida pela média das amostras de mídia desse grupo. O Grupo 1 continha 44% dos níveis de mídia, enquanto o grupo 2 continha 40%. Em ambos os grupos, n = 15; 10 embriões por amostra. Os grupos foram comparados usando uma ANOVA unidirecional com uma análise pós-hoc de Tukey (****p < 0,0001). Os bigodes representam o mínimo ao máximo. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Embrião e Embrião + Volumes de Água Extraembri (μL)
Águaa
Volume Totalb % do Volume Total (V) Volume Embrionário (W) Volume extraembrionário (X) % Água em Embrião (Y) % Água em Extraembrion (Z)
Embrião + Extraembrionário (EE)c 1,97 ± 0,4
Embrião 24 hpf (E)c 1,11 ± 0,22 56% 0.82 0.86 49% 51%
Cálculos
V Embrião % do volume total = Volume Total de E ◗ Volume Total de EE
W Volume de água embrionária = V × 73,6%
X Volume extraembrionário de água = W – Volume Total de EE
Y% Água em Embrião = (W + X)/W × 100
Z% Água em Extraembrionnic = 100 – Y
um O volume de água embrionária foi calculado a partir de Hagedorn et al.29.
b Os valores são relatados como ± desvio padrão (DP).
cn = 13; 10 embriões por amostra

Tabela 1: Cálculo do volume de água para os embriões com fluido extraembrionnic. O volume foi calculado a partir de 13 amostras (10 embriões por amostra) de 24 embriões de hpf com fluido extraembrionnic ainda na corção e embriões removidos de sua corsão. Os valores são relatados como a média ± SD.

Concentração de etanol de embriões e mídia (mM)
Grupo 1 Grupo 2 Combinado
Mídia (M)b 143,6 ± 2,3 133,6 ± 2,7 ± 138,6 ± 5,8
Embrião + Extraembrionário (EE)c 63,5 ± 17,1 53,1 ± 12,6 58,3 ± 15,7 ±
Proporção de etanol - embrião para mídia (1) 0,44 ± 0,12 0,40 ± 0,09 0,42 ± 0,11
Cálculos
1 Proporção de etanol = EE ◗ M
um Os valores são relatados como ± SD.
bn = 5
cn = 15; 10 embriões por amostra
d Os valores são a média dos grupos 1 e 2.

Tabela 2: Cálculos de concentração de etanol em embriões com fluido extraembrionário e mídia (mM). As amostras de mídia foram medidas diretas da mídia (n = 5 por grupo). A concentração embrionária de etanol foi calculada a partir de 15 amostras (10 embriões por amostra) de 24 embriões de hpf com fluido extraembrionnico. Calculou-se a proporção das concentrações de etanol dos embriões com fluido extraembrionário à mídia. Os valores são relatados como a média ± SD.

Cálculo do etanol no embriãoa.b
Embrião (Y) Proporção com mídia (Z)
32,7 ± 8,8 mM 0,24 ± 0,06
Cálculos
Y Etanol embrionário = 58,3 mM (Tabela 2) × 56% (Tabela 1)
Z Relação de etanol = Y ◗ 138,6 mM (Tabela 2)
um Os valores são a média dos grupos 1 e 2.
b Os valores são relatados como ± SD.

Tabela 3: Cálculo do etanol no embrião. A concentração embrionária de etanol foi calculada como 56% da concentração total de etanol do embrião com fluido extraembrionnico. Isso foi então relatado como uma proporção de embrião para mídia. Os valores são relatados como a média ± SD.

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Discussion

Como um sistema modelo de desenvolvimento, os zebrafish são idealmente adequados para estudar o impacto dos fatores ambientais no desenvolvimento. Eles produzem um grande número de embriões fertilizados externamente, o que permite paradigmas precisos de tempo e dosagem em estudos de etanol. Isso, combinado com as capacidades de imagem ao vivo e a conservação genética e de desenvolvimento com humanos, faz do zebrafish um poderoso sistema modelo para estudos de teratologia. Descrito é um protocolo para medir as concentrações embrionárias de etanol no desenvolvimento de embriões de zebrafish usando cromatografia de gás espacial da cabeça.

Determinar a concentração embrionária de etanol é fundamental para entender o impacto do etanol no embrião em desenvolvimento. Nos modelos de roedores, as concentrações de etanol sanguíneo se correlacionam com as concentrações teciduais26. No entanto, não é possível avaliar os níveis de etanol no sangue no desenvolvimento embrionário precoce em um zebrafish. A cromatografia de gás espacial chefe tem sido usada para medir os níveis de etanol em diversos paradigmas experimentais, incluindo zebrafish25,30,31,32,33,34,35. No entanto, esse protocolo pode ser usado para medir muitos fatores ambientais diferentes, embora a volatilidade desses vários fatores precise ser alta o suficiente para medir quantitativamente e uma coluna de cromatógrafo de gás precisa ser escolhida com base na polaridade dos compostos em questão. Além disso, os zebrafish são mais adequados para estudar o impacto dos fatores solúveis da água, pois a exposição a fatores hidrofóbicos é extremamente difícil de analisar em peixes.

Esse protocolo permitirá que os pesquisadores avaliem diretamente as concentrações de etanol em embriões de zebrafish. No entanto, vários fatores devem ser abordados para garantir medições precisas das concentrações embrionárias de etanol. Como os níveis de etanol em tecidos embrionários totais foram medidos, o volume embrionário teve que ser considerado. Após 10 hpf o embrião começa a somitogênese (formação somita) e não é mais uma esfera (Figura 1). Para avaliar o volume embrionário, o deslocamento da água foi utilizado em 10 embriões agrupados por amostra. Cada amostra consistia em 10 embriões por duas razões: primeiro, para reduzir o erro de tubos de pequenos volumes, e segundo, para uma média de pequenas flutuações nos volumes de embriões. Ao medir o volume embrionário, é importante considerar a precisão da pipetagem e da pesagem. Mesmo o uso de 10 embriões por amostra está no limite inferior de precisão tanto para as pipetas quanto para a escala usada para pesar os embriões. Com o equipamento disponível, o uso de menos de 10 embriões teria impactado as análises. Isso não limita os pesquisadores de usar menos embriões por amostra, desde que a precisão do equipamento seja considerada.

O volume embrionário é um fator que impacta a análise amostral. Um segundo fator-chave é a velocidade de processamento embrionário, porque o etanol é volátil. Além disso, o etanol se equilibra rapidamente em múltiplos estudos animais25,36,37. Nosso protocolo de lavagem foi projetado para remover rapidamente qualquer etanol aderindo à superfície externa da cor. Neste estudo, este protocolo de lavagem não impactou os níveis embrionários de etanol, embora lavantes mais longas ou múltiplas pudessem impactar as concentrações embrionárias de etanol25,38. No entanto, um terceiro fator a ser levado em conta é a diluição do volume embrionário durante o processamento. Este protocolo usa um coquetel protease para degradar a corion, bem como 5 M NaCl para desnatureza de todas as proteínas, incluindo enzimas de processamento de álcool.

Finalmente, uma série de análises e métodos de reportagem foram descritos em uma grande variedade de estudos de zebrafish. Devido à variação em diferentes amostras de um estudo ou comparando diferentes estudos, o relato adequado da concentração de etanol é fundamental25,38. Os métodos que utilizam medidas indiretas (geralmente enzimáticas) dependem da análise de um metabólito secundário. Nesse caso, a taxa de atividade enzimática pode variar e impedir uma análise precisa da concentração de etanol. Este método mede diretamente os níveis de etanol, e as concentrações de etanol são relatadas como uma razão de concentração de embrião para mídia. Nossos resultados estão em linha com um consenso crescente de um embrião de 24 hpf contendo ~30% das concentrações de mídia (Tabela 3)25,38,39,40. Surpreendentemente, essa concentração de etanol embrionário de 30% é independente da concentração da mídia, e não é bem compreendida o que cria esse equilíbrio25,38. Embriões com mais de 24 hpf apresentam diminuição nas concentrações de etanol, com 48 embriões do HPF contendo quase metade do teor de etanol de um embrião 24 hpf25. No entanto, nossos resultados não determinam o equilíbrio etanol-água. Dada a velocidade com que o etanol equilibra, bem como a volatilidade do etanol, é incrivelmente difícil avaliar as mudanças no volume de água no próprio embrião devido à exposição ao etanol. Tentar medir o volume de uma amostra de embrião tratado com etanol usando o deslocamento da água resultará na perda de etanol do embrião durante a medição. Usando métodos mais precisos de microscopia e espectroscopia do que os descritos acima, pode ser possível determinar o equilíbrio etanol-água em um embrião medindo diretamente ambos ao mesmo tempo.

No geral, o protocolo descrito aqui é uma poderosa ferramenta com a qual avaliar as concentrações embrionárias de etanol no desenvolvimento de embriões de zebrafish. Essas informações são fundamentais na padronização dos estudos da FASD usando zebrafish. A capacidade de controlar precisamente paradigmas de tratamento de etanol e quantificar diretamente as concentrações embrionárias de etanol fortalece a funcionalidade do modelo de zebrafish para estudos humanos de FASD. Em última análise, este trabalho melhorará muito nossa compreensão da FASD.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

A pesquisa apresentada neste artigo foi apoiada por subvenções anteriores dos Institutos Nacionais de Saúde/Instituto Nacional de Pesquisa Odontológica e Craniofacial (NIH/NIDCR) R01DE0208884 para J.K.E. e InstitutoNacional de Saúde/Instituto Nacional de Abuso de Álcool e Alcoolismo (NIH/NIAAA) F32AA021320 para C.B.L. e pela atual subvenção dos Institutos Nacionais de Saúde/Instituto Nacional de Abuso de Álcool (NIH/NIAAA) R00AA023560 para C.B.L. Agradecemos a Rueben Gonzales por fornecer e ajudar na análise do cromatógrafo a gás. Agradecemos a Tiahna Ontiveros e à Dra.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Air Provided by contract to the university
Analytical Balance VWR 10204-962
AutoSampler, CP-8400 Varian Gas Chromatograph Autosampler
Calcium Chloride VWR 97062-590
Ethanol Decon Labs 2701
Gas chromatograph vial with polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap 2 mL Agilent 8010-0198 Can reuse the vials after cleaning, but not the caps/septa
Gas Chromatograph, CP-3800 Varian
Helium Provided by contract to the university
HP Innowax capillary column Agilent 19095N-123I 30 m x 0.53 mm x 1.0 μm film thick
Hyrdogen Provided by contract to the university
Magnesium Sulfate (Heptahydrate) Fisher Scientific M63-500
Microcentrifuge tube 1.5 mL Fisher Scientific 2682002
Micropipette tips 10 μL Fisher Scientific 13611106
Micropipette tips 1000 μL Fisher Scientific 13611127
Micropipette tips 200 μL Fisher Scientific 13611112
Petri dishes 100 mm Fisher Scientific FB012924
Pipetman L p1000L Micropipette Gilson FA10006M
Pipetman L p200L Micropipette Gilson FA10005M
Pipetman L p2L Micropipette Gilson FA10001M
Polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap Agilent 5190-7021 Replacement caps/septa for gas chromatograph vials
Potassium Chloride Fisher Scientific P217-500
Potassium Phosphate (Dibasic) VWR BDH9266-500G
Pronase VWR 97062-916
Silica Beads .5 mm Biospec Products 11079105z
Silica Beads 1.0 mm Biospec Products 11079110z
Sodium Bicarbonate VWR BDH9280-500G
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-500
Sodium Phosphate (Dibasic) Fisher Scientific S374-500
Solid-phase microextraction fiber assembly Carboxen/Polydimethylsiloxane Millipore Sigma 57343-U Replacement fibers
Star Chromatography Workstation Varian Chromatography software
Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa Millipore Sigma 23154 Replacement inlet septa

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