Quantificazione dei livelli di etanolo negli embrioni di pesce zebra utilizzando la cromatografia dello spazio della testa

Developmental Biology

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Summary

Questo lavoro descrive un protocollo per quantificare i livelli di etanolo in un embrione di pesce zebra utilizzando la cromatografia del gas dello spazio della testa da metodi di esposizione adeguati alla lavorazione degli embrioni e all'analisi dell'etanolo.

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Lovely, C. B. Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography. J. Vis. Exp. (156), e60766, doi:10.3791/60766 (2020).

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Abstract

I disturbi dello spettro dell'alcolfe fetale (FASD) descrivono un continuum altamente variabile di difetti dello sviluppo indotti dall'etanolo, tra cui dismofomorfologie facciali e disturbi neurologici. Con una patologia complessa, FASD colpisce circa 1 bambino su 100 nati negli Stati Uniti ogni anno. A causa della natura altamente variabile della FASD, i modelli animali si sono dimostrati critici nella nostra attuale comprensione meccanicistica dei difetti di sviluppo indotti dall'etanolo. Un numero crescente di laboratori si è concentrato sull'utilizzo del pesce zebra per esaminare i difetti dello sviluppo indotti dall'etanolo. I pesci zebra producono un gran numero di embrioni emblari traslucidi, geneticamente trattivi, che sono esportati esternamente. Ciò consente ai ricercatori di controllare con precisione la tempistica e il dosaggio dell'esposizione all'etanolo in più contesti genetici e di quantificare l'impatto dell'esposizione all'etanolo embrionale attraverso tecniche di imaging dal vivo. Questo, combinato con l'elevato grado di conservazione della genetica e dello sviluppo con gli esseri umani, ha dimostrato che il pesce zebra è un modello potente in cui studiare la base meccanicistica della teratogenicità dell'etanolo. Tuttavia, i regimi di esposizione all'etanolo hanno variato tra diversi studi sui pesci zebra, il che ha confuso l'interpretazione dei dati dei pesci zebra in questi studi. Ecco un protocollo per quantificare le concentrazioni di etanolo negli embrioni di pesce zebra utilizzando la cromatografia del gas dello spazio della testa.

Introduction

I disturbi dello spettro dell'alcolfe fetale (FASD) descrivono una vasta gamma di menomazioni neurologiche e dismorfologie craniofacciali associate all'esposizione all'etanolo embrionale1. Molteplici fattori, tra cui la tempistica e il dosaggio dell'esposizione all'etanolo e il background genetico, contribuiscono alla variazione del FASD2,3. Nell'uomo, la complessa relazione di queste variabili rende difficile lo studio e la comprensione dell'eziologia della FASD. I modelli animali si sono dimostrati cruciali nello sviluppo della nostra comprensione della base meccanicistica della teratogenicità dell'etanolo. Un'ampia varietà di sistemi di modelli animali è stata utilizzata per studiare molteplici aspetti della FASD e i risultati sono stati notevolmente coerenti con quanto si trova nell'esposizionenell'uomo 4. I sistemi modello Roditori sono utilizzati per esaminare molti aspetti del FASD, con i topi che sono i più comuni5,6,7. La maggior parte di questo lavoro si è concentrata sui difetti dello sviluppo per l'esposizione precoce all'etanolo8, anche se in seguito l'esposizione all'etanolo ha dimostrato di causare anomalie dello sviluppo pure9. Inoltre, le capacità genetiche dei topi hanno notevolmente aiutato nella nostra capacità di sondare le basi genetiche di FASD10,11. Questi studi sui topi suggeriscono fortemente che ci sono interazioni gene-etanolo con il percorso riccio sonoro, segnalazione dell'acido retinoico, dismutasi Superossido, sintesi di ossido nitrico I, Aldh2 e Fancd28,10,11, 12,13,14,15,16,17,18 19,20,21. Questi studi dimostrano che i modelli animali sono fondamentali per far progredire la nostra comprensione della FASD e dei suoi meccanismi sottostanti.

Il pesce zebra è emerso come un potente sistema modello per esaminare molti aspetti della teratogenesi dell'etanolo22,23. A causa della loro fecondazione esterna, dell'elevata fecondità, della trattatibilità genetica e delle capacità di imaging dal vivo, i pesci zebra sono ideali per studiare fattori come tempismo, dosaggio e genetica della teratogenesi dell'etanolo. L'etanolo può essere somministrato a embrioni messi in scena con precisione e gli embrioni possono quindi essere immagine per esaminare l'impatto diretto dell'etanolo durante i processi di sviluppo. Questo lavoro può essere correlato direttamente agli esseri umani, perché i programmi genetici di sviluppo sono altamente conservati tra il pesce zebra e gli esseri umani e può quindi aiutare a guidare gli studi umani FASD24. Mentre il pesce zebra è stato utilizzato per esaminare la teratogenesi dell'etanolo, la mancanza di consenso nel segnalare concentrazioni di etanolo embrionale rende difficile il confronto con gli esseri umani25. Nei sistemi dei mammiferi, i livelli di alcol nel sangue sono correlati direttamente ai livelli di etanolo tissutale26. Molti degli studi sui pesci zebra trattano gli embrioni prima della formazione completa del loro sistema circolatorio. Senza un campione materno da esaminare, è necessario un processo per valutare le concentrazioni di etanolo per quantificare i livelli di etanolo all'interno dell'embrione. Qui descriviamo un processo per quantificare le concentrazioni di etanolo in un embrione di pesce zebra in via di sviluppo utilizzando la cromatografia del gas dello spazio della testa.

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Protocol

Tutti gli embrioni di pesce zebra utilizzati in questa procedura sono stati allevati e allevati seguendo i protocolli IACUC stabiliti27. Questi protocolli sono stati approvati dall'Università del Texas ad Austin e dall'Università di Louisville.

NOTA: La linea di pesce zebra Tg(fli1:EGFP)y1 è stata utilizzata in questo studio28. Tutta l'acqua utilizzata in questa procedura è acqua sterile di osmosi inversa. Tutte le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando Graphpad Prism v8.2.1.

1. Fare i media embrionali

  1. Per fare uno stock 20x di supporti embrionali, sciogliere 17,5 g di NaCl, 0,75 g di KCl, 2,9 g di CaCl2, 0,41 g di K2HPO4, 0,142 g di NA2HPO4e 4,9 g di MgSO4-7H2O in 1 L di acqua. Ignorare il precipitato bianco che si forma; ciò non avrà alcun impatto sui media. Filtrare sterilizzare la soluzione di magazzino e conservare a 4 gradi centigradi.
  2. Per creare la soluzione di supporto embrionale funzionante, sciogliere 1,2 g di NaHCO3 in 1 L di 20x di brodo di media embrionali e aggiungere 19 L di acqua. Mantenere la soluzione di supporto embrionale funzionante a 28 gradi centigradi.

2. Misurazione del volume embrionale mediante lo spostamento dell'acqua

NOTA: In questo protocollo vengono utilizzati 24 embrioni successivi alla fecondazione (hpf)(Figura 1). Gli embrioni utilizzati nelle misurazioni del volume non vengono utilizzati nell'analisi dell'etanolo.

  1. Mettere 10 embrioni e fluidi extraembryonici in un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL contrassegnato con un volume di 250 l (Figura 2A). Aggiungere acqua alla linea di riempimento di 250 L (vedere esempio con acqua tinta nella figura 2B).
  2. Ripetere il passaggio 2.1 per impostare i recipienti per gli embrioni a cui sono stati rimossi i courioni.
    1. Per rimuovere il chorion, mettere gli embrioni nei loro chorions in un piatto Petri da 100 mm con 2 mg/mL di cocktail proteasi in embriomi a temperatura ambiente (RT) per 10 min. Ogni pochi minuti, ruotare delicatamente gli embrioni per rompere il chorion.
    2. Una volta che tutti gli embrioni sono liberi dal loro coro, rimuovere gli embrioni dechorionati dal cocktail proteasi/ mezzi di embrione e mettere in un nuovo piatto Petri 100 mm con mezzi embrionali freschi per lavare gli embrioni. Ripetere questo lavaggio passo 1 più tempo (per un totale di 2 lavaggi). Trasferire gli embrioni in una parabola Petri fresca di 100 mm.
  3. Utilizzando la punta più piccola possibile e senza danneggiare gli embrioni, rimuovere con attenzione tutto il liquido da circa gli embrioni utilizzando un micropipettore p200 (Figura 2C) e pesare l'acqua con una scala con precisione <0,1 mg. Per determinare il volume del campione di 10 embrioni, sottrarre il peso/volume dell'acqua (1 mL di acqua e 1 g di acqua.) rimossa da 250 l. Per determinare il volume di un singolo embrione, dividere la differenza tra 250 l e il peso dell'acqua rimossa da 10.

Equation 1

Equation 2

3. Trattamento di embrioni con etanolo

  1. Raccogliere gli embrioni dai serbatoi di accoppiamento e metterli in una parabola Petri standard da 100 mm. Contare non più di 100 embrioni per singola parabola Petri e incubare a 28,5 gradi centigradi.
    NOTA: Se il chorion deve essere rimosso (passaggio 2.2), deve essere rimosso prima di aggiungere l'etanolo.
  2. A 6 hpf, aggiungere fino a 100 embrioni a un nuovo piatto Petri standard da 100 mm con mezzi embrionali o multimediali embrionali , ovvero l'1% di etanolo (v/v). Coprire, ma NON sigillare il piatto Petri. Collocare gli embrioni in un'incubatrice a bassa temperatura impostata a 28,5 gradi centigradi per 18 ore, o fino a quando gli embrioni raggiungono il punto di tempo di sviluppo di 24 hpf.

4. Preparazione del flusso di lavoro prima dell'elaborazione degli embrioni per la cromatografia del gas spaziale della testa

  1. Fare una soluzione di 5 M NaCl in acqua (450 s sarà necessario per ogni tubo campione) per denaturare tutte le proteine e prevenire il metabolismo dell'etanolo. Preparare il cocktail proteasi (Tabella dei Materiali) ad una concentrazione di 2 mg/mL nei mezzi embrionali.
  2. Etichettare un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml e una fiala cromatografica a gas da 2 mL per ogni campione. Etichettare ulteriori fiale di cromatografo a gas da 2 mL per gli standard di etanolo descritti di seguito, così come aria, acqua e gli spazi vuoti da cocktail 5 M NaCl/proteasi.
  3. Impostare tre micropipettori p200 due impostati su 50 l, e il terzo impostato su 200 L; un micropipettore p1000 impostato su 450 l e un micropipettore p2 impostato su 2 L. Per le pipette di vetro utilizzate per trasferire gli embrioni dai piatti Petri ai tubi di microcentrifuga da 1,5 mL, passare rapidamente la punta della pipetta attraverso una fiamma per lisciare i bordi per non danneggiare gli embrioni quando li si disegna nella pipetta.

5. Lavorazione degli embrioni per la cromatografia del gas spaziale capo

NOTA: Entrambi gli embrioni nei loro chorion e quelli precedentemente rimossi dai loro chorions sono trattati allo stesso modo per coerenza nel calcolo dei fattori di diluizione.

  1. Utilizzando i due micropipettori p200 impostati su 50 l, si innunci 50 - l della soluzione cocktail proteasi e disegna 50 l di acqua nel secondo.
  2. Utilizzando la pipetta di vetro e il micropipettore, posizionare rapidamente 10 embrioni (dal punto 3.2) in un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL e chiudere il tappo (come descritto nella Figura 2A). Ripetere l'operazione per tutti i campioni da testare, i controlli e gli embrioni trattati con etanolo.
  3. Utilizzando il micropipettore p200 impostato su 200 , aprire rapidamente il tappo e rimuovere tutti i supporti embrionali residui (come descritto nella Figura 2C). Posizionare rapidamente il pipetta contenente 50 l di acqua nel tubo e aggiungere rapidamente (per non danneggiare gli embrioni), quindi rimuovere l'acqua. Aggiungere rapidamente 50 l della soluzione di cocktail protease dal pipettor in attesa e chiudere il tappo del tubo (Figura 2D).
    NOTA: eseguire questo processo un campione alla volta.
  4. Lasciare che il campione si sieda a RT per 10 min per consentire al cocktail di proteasi di degradare il chorion. Quindi, aggiungere rapidamente 450 luna di 5 M NaCl e chiudere il tappo del tubo (Figura 2E). Vortice i campioni per 10 min. Per accelerare il processo, impostare il mixer per vortice più campioni contemporaneamente.
    NOTA: Aggiungere una piccola quantità di una miscela di perline di silice (2 dimensioni, 0,5 mm e 1 mm di perline) a qualsiasi tubo con embrioni più vecchi di 24 cvf. Negli embrioni più vecchi, il notocordo rimarrà intatto indipendentemente da quanto tempo sono omogeneizzati.
  5. Dopo aver omogeneizzato per 10 min, rimuovere rapidamente 2 -L di supernatante embrionale omogeneizzato e aggiungere a una fiala cromatografo a gas. Sigillare rapidamente la fiala con il cappuccio in politetrafluoroetilene.

6. Preparazione delle norme sui supporti e sugli etanoli

  1. Per preparare gli standard dei media, diluire i supporti con un fattore 10 con una soluzione cocktail NaCl/protease da 5 M. Aggiungere 2 l di ciascun campione a una fiala cromatografica a gas e sigillare con un tappo in politetrafluoroetilene.
  2. Per preparare gli standard di etanolo, creare una diluizione seriale di 100% etanolo nella soluzione cocktail NaCl/protease da 5 M alle seguenti concentrazioni: 0.3125, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 e 40 mM. Aggiungete 2 l di ogni standard in una fiala cromatografica a gas e si guarniscono con un cappuccio in politetrafluoroetilene.

7. Preparazione del cromatografo del gas dello spazio della testa

NOTA: questa configurazione e protocollo potrebbe essere necessario modificare a seconda del cromatografo a gas utilizzato. La cromatografia del gas spaziale della testa viene utilizzata per quantificare i livelli di etanolo, non per la separazione.

  1. Impostare il riscaldatore per l'autocampionatore a 58 gradi centigradi e accenderlo. Lasciare che il riscaldatore raggiunga i 58 gradi centigradi e accendere le linee di gas ad aria e idrogeno che alimentano il cromatografo a gas (per la ionizzazione della fiamma utilizzata per quantificare l'etanolo).
    NOTA: il psi deve essere impostato per azionare correttamente il cromatografo secondo le specifiche del produttore. Assicurarsi che la linea dell'elio sia accesa e impostata sul psi corretto.
  2. Per il setto, assicurarsi che il numero di campioni iniettati non sia >100. Per la fibra di iniezione, assicurarsi che il numero di campioni iniettati non è >500.
    NOTA: Se uno dei due è superiore alla quantità di iniezioni, dovranno essere modificate prima di eseguire i campioni di prova.
  3. Accendere il software di analisi e assicurarsi che la workstation sia configurata correttamente. Memorizzare tutti i dati in base agli standard di laboratorio/reparto. Creare un nuovo elenco di esempio per gli esempi da eseguire.
  4. Avviare il metodo di avvio e attendere che il rilevatore di ionizzazione della fiamma si stabilizzi prima di eseguire i campioni. Una volta stabile, eseguire il metodo di avvio del software per pulire la fibra.

8. Misurazioni campione con cromatografia a gas dello spazio della testa

  1. Una volta completato il metodo di avvio, creare 1 nuova riga per ogni campione nell'elenco di esempio. Dal menu dei metodi nel software di analisi, caricare 436 corrente spme etanolo 2013 3min assorbire 2_5min corsa rg. METH per ogni campione nell'elenco di esempio.
    1. Compilare l'elenco dei campioni, a partire dall'aria, dall'acqua, dagli spazi vuoti dei cocktail 5 M NaCl/protease. Quindi immettere gli standard in ordine, da 0,3125 a 40 mM. Seguire gli standard con un secondo giro di aria, acqua, e 5 M NaCl / protease cocktail spazi vuoti.
    2. Inserire tutti i campioni di supernata dell'embrione omogeneizzato da testare, dalla concentrazione di etanolo più bassa a quella più alta. Terminare inserendo un terzo e ultimo giro dell'aria, acqua, e 5 M NaCl / protease cocktail vuoti.
  2. Aggiungere le fiale del cromatografo a gas all'autocampionatore nell'ordine in cui sono stati immessi i campioni. Consentire il riscaldamento dei campioni per 10-15 min. Avviare l'esecuzione dell'esempio nel software.
  3. Dopo aver eseguito tutti i campioni e gli spazi vuoti finali, attivare il metodo di arresto nel software aggiungendo un campione finale nell'elenco dei campioni ed eseguendo standby. METH. Eseguire il backup di tutti i dati acquisiti durante le esecuzioni dell'esempio. Spegnere l'apparecchiatura nel seguente ordine: riscaldatore autocampionatore, serbatoio di idrogeno e, solo dopo che la temperatura del cromatografo raggiunge i 30 gradi centigradi, il serbatoio dell'aria. Lasciare il serbatoio di elio per preservare la colonna di cera.

9. Esempio di integrazione dei picchi di etanolo e analisi della concentrazione dei campioni

NOTA: tutti i valori a partire da 9.3 sono stati calcolati in un file Excel precompilato.

  1. Una volta completato il metodo di spegnimento, fare clic su Apri cromatogramma. Aprire la cartella contenente i risultati. I campioni vengono integrati automaticamente in questo programma.
  2. Nei risultati, assicurarsi che siano stati integrati i picchi corretti (picchi di etanolo tra 2 e 2,5). Una volta che tutti i campioni sono stati confermati, stampare o esportare i risultati.
  3. Tracciare l'altezza massima degli standard di etanolo su un grafico. Calcolare i valori di pendenza, intercetta Y e R2 per gli standard etanolo (R2 deve essere >0.99).
    NOTA: questi valori verranno utilizzati per determinare la concentrazione di etanolo dall'altezza massima del campione.
  4. Per ogni campione, sottrarre l'altezza massima del campione dall'intercetta Y degli standard di etanolo. Dividere questo valore per la pendenza degli standard di etanolo per ottenere il valore di etanolo per ogni campione nelle fiale GC.

Equation 3

  1. Per calcolare la concentrazione di etanolo negli embrioni, calcolare innanzitutto il fattore di diluizione per ogni campione. Prendere la misura del volume calcolata al punto 2.3 di questo protocollo e dividerla per la misura del volume più 500 L. Questo rappresenta la soluzione cocktail NaCl/protease da 5 M aggiunta ad ogni campione durante l'elaborazione dell'embrione (passaggi 5.3 e 5.4).

Equation 4

  1. Usando questo fattore di diluizione del campione, moltiplicare per il valore di etanolo del campione per ogni campione. I risultati saranno in concentrazione mM. Calcolare i campioni di riferimento dei supporti moltiplicando il valore dell'etanolo del supporto per il fattore di diluizione pari a 10.

Equation 5

Equation 6

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Representative Results

I livelli di etanolo sanguigno non possono essere determinati nei primi pesci zebra embrionali, perché non hanno un sistema circolatorio completamente formato. Per determinare il livello di concentrazione di etanolo negli embrioni di pesce zebra, i livelli di etanolo sono misurati direttamente dal tessuto embrionale omogeneizzato. Per misurare correttamente le concentrazioni di etanolo embrionale, è necessario tener conto del volume embrionale. L'embrione (tuorlo attaccato) si trova all'interno del chorion (guscio d'uovo) circondato da liquido extraembryonic (Figura 1). Qualsiasi misura di volume dell'embrione deve essere effettuata sugli embrioni al momento dell'esposizione, perché il volume embrionale cambierà nel corso del tempo di sviluppo man mano che l'embrione aumenta di dimensioni. Inoltre, il modo in cui l'embrione viene elaborato deve essere preso in considerazione così come il volume embrionale, poiché entrambi questi elementi creano fattori di diluizione utilizzati per calcolare i livelli di etanolo embrionale.

Poiché l'embrione non è una sfera perfetta, soprattutto dopo 10 hpf, lo spostamento dell'acqua è stato utilizzato per valutare il volume embrionale. Questo studio ha utilizzato embrioni a 24 hpf. Il volume degli embrioni sia nel loro coro che in quelli rimossi dal loro coro sono stati misurati. Questi volumi erano 1,97 (n. 0,4 SD) - L per l'embrione con liquido extraembryonic, e 1,1 (0,22 SD) - L solo per l'embrione (Tabella 1). Questa differenza tra l'embrione con liquido extraembryonico e l'embrione da solo è il volume del fluido extraembryonic, che circonda l'embrione all'interno del chorion (Figura 1). Questa differenza è fondamentale per determinare la concentrazione di etanolo dell'embrione da solo nei campioni. Dall'analisi, l'embrione comprendeva il 56% del volume totale dell'embrione con liquido extraembryonico all'interno del chorion (Tabella 1). Man mano che l'embrione cresceva, il volume embrionale aumentava nel tempo, con conseguente diminuzione del volume del liquido extraembryonico25. Quando si misurano le concentrazioni di etanolo dagli embrioni ancora nel loro coro, è necessario prendere in considerazione il contenuto di acqua sia nell'embrione che nel liquido extraembryonic.

Il lavoro pubblicato in precedenza ha dimostrato che la frazione d'acqua nel solo embrione è del 73,6%29. Questo risultato è stato ottenuto utilizzando una combinazione di misure di volume, spettroscopia di risonanza dello spin elettronico e microscopia a risonanza magnetica. Per confermare questo risultato, gli embrioni sono stati pesati da soli prima e dopo la cottura a 70 gradi centigradi, come descritto in precedenza25. Questo processo rimuove tutta l'acqua dall'embrione. La variazione di peso rappresenta la quantità di acqua nell'embrione. Da questa analisi, un embrione da 24 hpf conteneva il 72% di acqua, mentre un embrione da 48 hpf conteneva il 76%. Entrambi questi valori sono estremamente simili al 73,6% del volume d'acqua embrionale precedentemente calcolato29. Ciò suggerisce che il volume d'acqua dell'embrione cambia poco durante lo sviluppo precoce.

Sulla base del lavoro pubblicato utilizzando molteplici approcci per calcolare il volume dell'acqua nell'embrione, il 73,6% è stato utilizzato come contenuto di acqua embrionale per tutte le analisi presentate. Ciò ha comportato l'acqua che comprende 0,82 litri del volume embrionale 1 1,1(1,1). Da questo, il volume del fluido extraembryonic è stato calcolato come 0,86 l. Del volume totale dell'acqua dell'embrione con liquido extraembryonic, il 49% è contenuto nell'embrione e il 51% è nel liquido extraembryonic (Tabella 1).

Per l'analisi della cromatografia a gas, sono stati utilizzati solo embrioni da 24 hpf ancora nel loro coro(Figura 1). In questo regime di etanolo, gli embrioni sono stati trattati con una concentrazione di etanolo dell'1% (171 mM) da 6-24 hpf, anche se diverse concentrazioni di etanolo e intervalli di tempo di esposizione possono essere utilizzati a seconda della progettazione sperimentale. Sono stati analizzati due gruppi di 15 campioni (10 embrioni per campione) e i mezzi di comunicazione con cui sono stati trattati in 2 diversi giorni sperimentali (tabella 2). I livelli multimediali possono variare da esperimento a esperimento. Per tener conto di ciò, i livelli di etanolo dei media sono stati misurati 5 volte per gruppo sperimentale. In questa analisi, i livelli dei supporti erano 143,6 mM (2,3 SD) mM per il gruppo 1 e 133,6 mM per il gruppo 2. Questi valori sono significativamente diversi utilizzando un test t non accoppiato (p - 0.0002). Gli embrioni con fluido extraembryonico hanno una media di 63,5 mM (17,1 SD) e 53,1 MM per i gruppi 1 e 2, rispettivamente. Tuttavia, la concentrazione non era significativamente diversa tra i 2 gruppi di embrioni con liquido extraembryonic (test t non accoppiato, p - 0,07). Gli embrioni di controllo non trattati sono stati misurati a 0 mM. A causa della variazione dei livelli dei media, è stato calcolato un rapporto tra concentrazione di etanolo embrionale/livelli di etanolo per ogni campione. Il gruppo 1 aveva il 44% dei livelli di etanolo dei media, mentre il gruppo 2 aveva il 40% dei livelli di etanolo dei media(Figura 3 e Tabella 2).

Figure 1
Figura 1: Immagine di un embrione a 24 h postfekzazione (hpf) all'interno del chorion. L'embrione e il tuorlo sono circondati dal liquido extraembryonico, tutti situati all'interno del chorion. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Protocollo per misurare il volume embrionale ed elaborare gli embrioni per l'analisi. (A) Dieci embrioni da 24 mf trasferiti in un tubo di microcentrismo da 1,5 ml contrassegnato con un volume di 250 . (B) Il tubo di microcentrismo con embrioni riempiti d'acqua (l'acqua si sloga, quindi è più facile da vedere al marchio 250. (C) Tutta l'acqua viene rimossa dal tubo e pesata. (D) Dieci embrioni trasferiti in un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL. L'acqua è stata rimossa come in (C) e sostituita con 50 -L di cocktail proteasi. (E) Dopo 10 min, 450 luna di 5 M NaCl è stato aggiunto al tubo da (D). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Box e baffi grafico del rapporto di concentrazione di etanolo dei campioni ai media. La concentrazione di etanolo per ogni gruppo è stata divisa per la media dei campioni di media di tale gruppo. Il gruppo 1 conteneva il 44% dei livelli dei media, mentre il gruppo 2 conteneva il 40%. In entrambi i gruppi, n - 15; 10 embrioni per campione. I gruppi sono stati confrontati utilizzando un ANOVA unidirezionale con l'analisi post hoc di un Tukey (Sezione ) < 0.0001. I baffi rappresentano dal minimo al massimo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Embrione ed embrione - Volumi d'acqua extraembrionali
Innaffiarea
Volume totaleb % del volume totale (V) Volume embrionale (W) Volume extraembryonico (X) % acqua nell'embrione (Y) % di acqua in extraembryonic
Embrione - Extraembryonic (EE)c 1,97 x 0,4
Embrione 24 hpf (E)c 1.11 - 0,22 56% 0.82 0.86 49% 51%
Calcoli
V % embrionale del volume totale - Volume totale di E - Volume totale di EE
W Volume dell'Acqua Embrionale - V - 73,6%
X (in vi o Volume dell'acqua extraembryonic - W – Volume totale di EE
Y% Acqua nell'embrione (W ) / W
%di acqua in extraembryonic 100 – Y
un Il volume dell'acqua embrionale è stato calcolato da Hagedorn et al.29.
b I valori sono riportati come deviazione standard (SD).
cn - 13; 10 embrioni per campione

Tabella 1: Calcolo del volume d'acqua per gli embrioni con liquido extraembryonico. Il volume è stato calcolato da 13 campioni (10 embrioni per campione) di embrioni da 24 cv con liquido extraembryonic ancora nel chorion e di embrioni rimossi dal loro chorion. I valori sono riportati come media : SD.

Etanolo Concentrazione di embrioni e media (mM)
Gruppo 1 Gruppo 2 Combinato
Supporti (M)b 143,6 x 2,3 133,6 x 2,7 138,6 x 5,8
Embrione - Extraembryonic (EE)c 63,5 x 17,1 53,1 x 12,6 58,3 e 15,7
Rapporto tra etanolo e embrione e media (1) 0,44 x 0,12 0,40 - 0,09 0,42 x 0,11
Calcoli
1 : il nome del Rapporto di etanolo : EE e M
un I valori vengono riportati come SD.
bn 5
cn - 15; 10 embrioni per campione
d I valori sono la media dei gruppi 1 e 2.

Tabella 2: Calcoli della concentrazione di etanolo negli embrioni con fluido e supporti extraembryonici (mM). I campioni di supporti sono stati misure dirette dai media (n - 5 per gruppo). La concentrazione di etanolo embrionale è stata calcolata da 15 campioni (10 embrioni per campione) da embrioni da 24 cvcon liquido extraembryonico. È stato calcolato il rapporto tra le concentrazioni di etanolo degli embrioni con liquido extraembryonico e media. I valori sono riportati come media : SD.

Calcolo dell'etanolo nell'embrionea,b
Embrione (Y) Rapporto con i supporti
32,7 m 0,24 x 0,06
Calcoli
Y (invie Etanolo embrionale : 58,3 mM (tabella 2) - 56% (tabella 1)
N. di lavoro ( Rapporto di etanolo: Y : 138,6 mM (tabella 2)
un I valori sono la media dei gruppi 1 e 2.
b I valori vengono riportati come SD.

Tabella 3: Calcolo dell'etanolo nell'embrione. La concentrazione di etanolo embrionale è stata calcolata come 56% della concentrazione totale di etanolo dell'embrione con liquido extraembryonico. Questo è stato poi riportato come un rapporto tra embrione e media. I valori sono riportati come media : SD.

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Discussion

Come sistema di modelli di sviluppo, il pesce zebra è ideale per studiare l'impatto dei fattori ambientali sullo sviluppo. Producono un gran numero di embrioni fecondati esternamente, il che consente di tempistica precisa e paradigmi di dosaggio negli studi sull'etanolo. Questo, combinato con le capacità di imaging dal vivo e la conservazione genetica e dello sviluppo con gli esseri umani, rende il pesce zebra un potente sistema modello per gli studi di teratologia. Descritto è un protocollo per misurare le concentrazioni di etanolo embrionale nello sviluppo di embrioni di pesce zebra utilizzando la cromatografia dei gas dello spazio della testa.

Determinare la concentrazione di etanolo embrionale è fondamentale per comprendere l'impatto dell'etanolo sull'embrione in via di sviluppo. Nei modelli di roditori, le concentrazioni di etanolo nel sangue sono correlate alle concentrazioni di tessuto26. Tuttavia, non è possibile valutare i livelli di etanolo nel sangue nello sviluppo embrionale precoce in un pesce zebra. La cromatografia del gas spaziale della testa è stata utilizzata per misurare i livelli di etanolo in vari paradigmi sperimentali, tra cui il pesce zebra25,30,31,32,33,34,35. Tuttavia, questo protocollo può essere utilizzato per misurare molti fattori ambientali diversi, anche se la volatilità di questi vari fattori deve essere sufficientemente elevata da misurare quantitativamente e una colonna di cromatografo a gas deve essere scelta in base alla polarità dei composti in questione. Inoltre, i pesci zebra sono più adatti a studiare l'impatto dei fattori solubili in acqua, perché l'esposizione a fattori idrofobici è estremamente difficile da analizzare nei pesci.

Questo protocollo consentirà ai ricercatori di valutare direttamente le concentrazioni di etanolo negli embrioni di pesce zebra. Tuttavia, è necessario affrontare diversi fattori per garantire misurazioni accurate delle concentrazioni di etanolo embrionale. Poiché sono stati misurati i livelli di etanolo nei tessuti embrionali totali, è stato necessario considerare il volume embrionale. Dopo 10 hpl l'embrione inizia la somitogenesi (formazione somite) e non è più una sfera (Figura 1). Per valutare il volume embrionale, lo spostamento dell'acqua è stato utilizzato su 10 embrioni in pool per campione. Ogni campione consisteva di 10 embrioni per due motivi: in primo luogo, per ridurre l'errore derivato dalla pipettatura di piccoli volumi, e in secondo luogo, per calcolare la media di piccole fluttuazioni nei volumi embrionali. Quando si misura il volume embrionale, è importante considerare la precisione della pipettatura e della pesatura. Anche l'uso di 10 embrioni per campione è al limite inferiore di precisione sia per le pipette che per la bilancia utilizzata per pesare gli embrioni. Con le attrezzature disponibili, l'utilizzo di meno di 10 embrioni avrebbe avuto un impatto sulle analisi. Ciò non impedisce ai ricercatori di utilizzare meno embrioni per campione, purché si consideri la precisione delle apparecchiature.

Il volume embrionale è un fattore che influisce sull'analisi del campione. Un secondo fattore chiave è la velocità di elaborazione embrionale, perché l'etanolo è volatile. Inoltre, l'etanolo si acquisirà rapidamente in molteplici studi sugli animali25,36,37. Il nostro protocollo di lavaggio è progettato per rimuovere rapidamente qualsiasi etanolo aderare alla superficie esterna del chorion. In questo studio questo protocollo di lavaggio non ha avuto un impatto sui livelli di etanolo embrionale, anche se lavaggi più lunghi o multipli potrebbero avere un impatto sulle concentrazioni di etanolo embrionale25,38. Tuttavia, un terzo fattore da prendere in considerazione è la diluizione del volume embrionale durante la lavorazione. Questo protocollo utilizza un cocktail proteasi per degradare il chorion e 5 M NaCl per denaturare tutte le proteine, compresi gli enzimi di elaborazione dell'alcol.

Infine, una serie di analisi e metodi di segnalazione sono stati descritti in un'ampia varietà di studi sui pesci zebra. A causa della variazione all'interno di diversi campioni di uno studio o confrontando diversi studi, una corretta segnalazione della concentrazione di etanolo è critica25,38. I metodi che utilizzano misure indirette (di solito ezimatiche) si basano sull'analisi di un metabolita secondario. In tal caso, il tasso di attività ezimatica può variare e ostacolare l'analisi precisa della concentrazione di etanolo. Questo metodo misura direttamente i livelli di etanolo e le concentrazioni di etanolo sono riportate come rapporto tra concentrazione di embrioni e concentrazioni di media. I nostri risultati sono in linea con il crescente consenso di un embrione da 24 CV contenente il 30% delle concentrazioni di media (Tabella 3)25,38,39,40. Sorprendentemente, questa concentrazione di etanolo embrionale del 30% è indipendente dalla concentrazione dei media, e non è ben compreso ciò che crea questo equilibrio25,38. Gli embrioni di età superiore ai 24 hf mostrano una diminuzione delle concentrazioni di etanolo, con embrioni di 48 hpf contenenti quasi la metà del contenuto di etanolo di unembrione 25di 24 hpf. Tuttavia, i nostri risultati non determinano l'equilibrio etanolo-acqua. Data la velocità con cui l'etanolo viene equilibrato, così come la volatilità dell'etanolo, è incredibilmente difficile valutare i cambiamenti di volume dell'acqua nell'embrione stesso a causa dell'esposizione all'etanolo. Il tentativo di misurare il volume di un campione di embrione trattato con etanolo con spostamento dell'acqua comporterà la perdita di etanolo dall'embrione durante la misurazione. Utilizzando metodi di microscopia e spettroscopia più precisi di quelli sopra descritti, potrebbe essere possibile determinare l'equilibrio etanolo-acqua in un embrione misurando direttamente entrambi allo stesso tempo.

Nel complesso, il protocollo qui descritto è un potente strumento con cui valutare le concentrazioni di etanolo embrionale nello sviluppo di embrioni di pesce zebra. Queste informazioni sono fondamentali nella standardizzazione degli studi FASD utilizzando il pesce zebra. La capacità di controllare con precisione i paradigmi di trattamento dell'etanolo e di quantificare direttamente le concentrazioni di etanolo embrionale rafforza la funzionalità del modello di pesce zebra per gli studi FASD umani. In definitiva, questo lavoro migliorerà notevolmente la nostra comprensione della FASD.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

La ricerca presentata in questo articolo è stata supportata da precedenti sovvenzioni da National Institutes of Health/National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIH/NIDCR) R01DE020884 a J.K.E. e National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (NIH/NIAAA) F32AA021320 a C.B.L. e con l'attuale sovvenzione da parte dei National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse (NIH/NIAAA) R00AA023560 a C.B.L. Ringraziamo Rueben Gonzales per aver fornito e assistito l'analisi del cromatografo a gas. Ringraziamo Tiahna Ontiveros e la dott.ssa Gina Nobles a scrivere assistenza.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Air Provided by contract to the university
Analytical Balance VWR 10204-962
AutoSampler, CP-8400 Varian Gas Chromatograph Autosampler
Calcium Chloride VWR 97062-590
Ethanol Decon Labs 2701
Gas chromatograph vial with polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap 2 mL Agilent 8010-0198 Can reuse the vials after cleaning, but not the caps/septa
Gas Chromatograph, CP-3800 Varian
Helium Provided by contract to the university
HP Innowax capillary column Agilent 19095N-123I 30 m x 0.53 mm x 1.0 μm film thick
Hyrdogen Provided by contract to the university
Magnesium Sulfate (Heptahydrate) Fisher Scientific M63-500
Microcentrifuge tube 1.5 mL Fisher Scientific 2682002
Micropipette tips 10 μL Fisher Scientific 13611106
Micropipette tips 1000 μL Fisher Scientific 13611127
Micropipette tips 200 μL Fisher Scientific 13611112
Petri dishes 100 mm Fisher Scientific FB012924
Pipetman L p1000L Micropipette Gilson FA10006M
Pipetman L p200L Micropipette Gilson FA10005M
Pipetman L p2L Micropipette Gilson FA10001M
Polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap Agilent 5190-7021 Replacement caps/septa for gas chromatograph vials
Potassium Chloride Fisher Scientific P217-500
Potassium Phosphate (Dibasic) VWR BDH9266-500G
Pronase VWR 97062-916
Silica Beads .5 mm Biospec Products 11079105z
Silica Beads 1.0 mm Biospec Products 11079110z
Sodium Bicarbonate VWR BDH9280-500G
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-500
Sodium Phosphate (Dibasic) Fisher Scientific S374-500
Solid-phase microextraction fiber assembly Carboxen/Polydimethylsiloxane Millipore Sigma 57343-U Replacement fibers
Star Chromatography Workstation Varian Chromatography software
Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa Millipore Sigma 23154 Replacement inlet septa

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