इन विट्रो ने अधिक कठोर विशिष्टता के साथ प्रतिबंध एंनोटुकलीज के विकास का निर्देश दिया

Genetics
 

Summary

नई अनुक्रम विशिष्टता के साथ प्रतिबंध एंनोन्यूकपट्ट्स को आंशिक रूप से पतित अनुक्रम को पहचानने वाले एंजाइमों से विकसित किया जा सकता है। यहां हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं जिसका उपयोग हम सफलतापूर्वक एनएलएआईवी एंजाइम की अनुक्रम विशिष्टता को बदलने के लिए करते थे। प्रोटोकॉल के प्रमुख तत्व प्रतिलेखन/अनुवाद प्रतिक्रिया और नए अनुक्रम विशिष्टताओं के साथ वेरिएंट के चयन के इन विट्रो विभाजक हैं ।

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Skowronek, K. J., Bochtler, M. In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity. J. Vis. Exp. (157), e60807, doi:10.3791/60807 (2020).

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Abstract

प्रतिबंध एंटॉन्यूकलीज (REase) विशिष्टता इंजीनियरिंग बेहद मुश्किल है। यहां हम एक मल्टीस्टेप प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो आरईईवे का उत्पादन करने में मदद करता है जिसमें माता-पिता के एंजाइम की तुलना में अधिक कठोर विशिष्टता होती है। प्रोटोकॉल के लिए आरएनई के वेरिएंट के लिए अभिव्यक्ति चयन कैसेट (ईएससीएस) की लाइब्रेरी बनाने की आवश्यकता होती है, आदर्श रूप से डीएनए बाध्यकारी को प्रभावित करने की संभावना वाली स्थितियों में परिवर्तनशीलता के साथ। ईएससी को प्रतिबंध साइट गतिविधि वांछित और बायोटिन टैग के लिए एक अनुक्रम द्वारा एक तरफ और दूसरी तरफ अवांछित गतिविधि और एक प्राइमर एनिंग साइट के लिए प्रतिबंध साइट द्वारा फ्लैंक किया जाता है। ईएससीएस को पानी में तेल पायस में लिखित और अनुवादित किया जाता है, ऐसी स्थितियों में जो प्रति बूंद एक से अधिक डीएनए अणु की उपस्थिति की संभावना नहीं है । इसलिए, प्रत्येक कैसेट अणु में डीएनए केवल अनुवादित, एन्कोडेड एंजाइम की गतिविधि के अधीन होता है। वांछित विशिष्टता के REase वेरिएंट बायोटिन टैग को हटा दें लेकिन प्राइमर एनिंग साइट नहीं। पायस को तोड़ने के बाद, डीएनए अणुओं को बायोटिन पुलडाउन के अधीन किया जाता है, और केवल अधिनेत में उन लोगों को बनाए रखा जाता है। यह कदम आश्वस्त करता है कि केवल उन वेरिएंट के लिए ईएससी जो वांछित गतिविधि नहीं खो चुके हैं, बनाए रखे गए हैं। इन डीएनए अणुओं को पहले पीसीआर प्रतिक्रिया के अधीन किया जाता है । अवांछित अनुक्रम में दरार प्राइमर में से एक के लिए प्राइमर बाध्यकारी साइट को काटदेता है। इसलिए, पीसीआर अवांछित गतिविधि के बिना बूंदों से केवल ईएससीएस को बढ़ाती है। इसके बाद वांछित विशिष्टता और बायोटिन टैग के लिए प्रतिबंध स्थल को फिर से शुरू करने के लिए एक दूसरी पीसीआर प्रतिक्रिया की जाती है, ताकि चयन कदम दोहराया जा सके। चयनित खुले पढ़ने के फ्रेम बैक्टीरियल कोशिकाओं में अधिक व्यक्त किए जा सकते हैं जो माता-पिता की रेज़ के कॉग्नेट मिथाइलट्रांसफरेज़ को भी व्यक्त करते हैं, क्योंकि नए विकसित आरईईएस केवल मिथाइलट्रांसफरेज़ लक्ष्य साइटों के सबसेट को लक्षित करता है।

Introduction

अनुक्रम विशिष्टता इंजीनियरिंग कक्षा द्वितीय REases के लिए बेहद चुनौतीपूर्ण है । एंनोन्यूकपट्टों के इस वर्ग में, अनुक्रम मान्यता और उत्प्रेरक बारीकी से जुड़े हुए हैं, सबसे शायद अपने कॉग्नेट मिथाइलट्रांसफरेज की तुलना में व्यापक विशिष्टता के एंड्रोन्कलीज के निर्माण के खिलाफ एक विकासवादी सुरक्षा के रूप में, जो मेजबान डीएनए को नुकसान पहुंचाएगा। कोशिकाओं में नई विशिष्टताओं के निर्देशित विकास और नव इंजीनियर एंनोन्यूलीज गतिविधि के खिलाफ मेजबान डीएनए की रक्षा की जरूरत से जटिल है । इसलिए, आरएनई इंजीनियरिंग के कुछ सफल प्रयास ों की सूचना दी गई है और वे सभी एक विशेष एंजाइम,,1,2,,3,4,,55,6,,7की अनूठी विशेषताओं का दोहन करते हैं।

यहां हम विशिष्टता इंजीनियरिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं जिसका उपयोग एंटोन्यूलीज वेरिएंट उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है जिसमें माता-पिता के एंजाइम की तुलना में संकीर्ण विशिष्टता होती है जो एनएलआईवी एंनोन्यूलीज8की हमारी सफल इंजीनियरिंग पर आधारित है। एक मनमाने ढंग से मान्यता अनुक्रम के साथ ऐसे किसी भी एंजाइम के लिए, अतिरिक्त विशिष्टता flanks में ठिकानों के लिए शुरू किया जा सकता है । माता-पिता के एंजाइमों के लिए जो आंशिक रूप से पतित दृश्यों (जैसे अपने जीजीएनएनसीसी लक्ष्य के साथ NlaIV) को पहचानते हैं, मान्यता अनुक्रम के भीतर अतिरिक्त विशिष्टता भी पेश की जा सकती है। के रूप में अतिरिक्त विशिष्टता की संभावना प्रोटीन डीएनए संपर्कों की आवश्यकता होगी, नए मांयता प्राप्त ठिकानों डीएनए पर माता पिता के एंनोटुकपट्टे के पदचिह्न के भीतर झूठ होना चाहिए । सैद्धांतिक रूप से मान्यता क्रम की किसी भी वांछित विशेषज्ञता के लिए चयन योजनाएं स्थापित की जा सकती हैं । हालांकि, अधिकांश REases जो पालिनड्रोमिक और लगभग पैलंड्रोमिक लक्ष्य दृश्यों को पहचानते हैं, कार्यात्मक डिमर हैं जो पैलिनड्रोम की केवल आधी साइट को पहचानते हैं। इसलिए, प्रोटीन न्यूक्लिक इंटरैक्शन की समरूपता का उल्लंघन करने वाली नई विशिष्टताओं का चयन काम करने की संभावना नहीं है। उदाहरण के लिए, डिमेरिक NlaIV के लिए, जीजीएनएनसीसी अनुक्रम को सैद्धांतिक रूप से जीजीएटी सीजीटीसी तक संकुचित किया जा सकता है लेकिन जीएजीएसीसी के नीचे विशिष्टता को कम करने के लिए और अधिक कठिन होने की उम्मीद है। हमारी योजना में सकारात्मक और नकारात्मक चयन दोनों शामिल हैं।

यह प्रक्रिया अधिक कुशल होती है जब नकारात्मक चयन का उपयोग पसंदीदा संकरा विशिष्टता के अलावा अन्य सभी दृश्यों को क्लीव करने में सक्षम विशिष्टताओं को हटाने के लिए भी किया जाता है। उदाहरण के लिए, जीजीएटीसीसी के लिए चयन को जीजीबीवीसीसी के खिलाफ एंटीसेलेक्शन के साथ जोड़ा जा सकता है (जहां बी ए के अलावा कोई आधार है, और वी टी के अलावा कोई आधार है)। जब कुछ संभावित लक्ष्य दृश्यों को कवर नहीं किया जाता है, तो चयन प्रयोग का परिणाम सकारात्मक और नकारात्मक चयन की प्रभावशीलता पर निर्भर करता है। हमारे NlaIV काम में, हम GGATCC के लिए चयनित है, और GGSSCC के खिलाफ (जहां एस जी या सी है), और एक विशिष्टता है कि, समरूपता तोड़ने लक्ष्यों की अनदेखी, GGWWCC के रूप में वर्णित किया जा सकता है प्राप्त (जहां डब्ल्यू एक या टी है), सुझाव है कि इस विशेष मामले में, नकारात्मक चयन अधिक था सकारात्मक चयन से महत्वपूर्ण है।

हमारा दृष्टिकोण अभिव्यक्ति चयन कैसेट (ईएससी) के निर्माण से शुरू होता है। ईएससी को अनुभागों में संरचित किया गया है। अंदर कोर सेक्शन पर टी7 प्रमोटर कंट्रोल के तहत आरईई ईके के ओपन रीडिंग फ्रेम (ओआरएफ) के वेरिएंट हैं । ईएससी के इस कोर सेक्शन में इंजीनियर आरईई ईज के लिए कोई कॉग्नेट साइट नहीं हो सकती है। कोर जंगली प्रकार REase के लिए दो कॉग्नेट साइटों के बीच सैंडविच है: अवांछित गतिविधि के लिए एक दरार साइट (काउंटर चयनित अनुक्रम, इस उदाहरण में GGएसएससीसी) और वांछित गतिविधि के लिए एक दरार साइट (चयनित अनुक्रम, उदाहरण में GGटीसीसी) । पीसीआर में ईएससी की तैयारी का अंतिम चरण 5 के अंत में वांछित गतिविधि के करीब बायोटिन जोड़ता है और विभिन्न प्रकार के काउंटर चयनित दृश्यों (उदाहरण में जीजीएसएससी) बनाता है। चयन रणनीति एक इन विट्रो प्रतिलेखन/अनुवाद/चयन प्रोटोकॉल(चित्रा 1ए)के बाद ईएससी पुनर्प्रवर्धन प्रोटोकॉल में सावधानीपूर्वक डिजाइन किए गए प्राइमर के उपयोग पर निर्भर करती है । ईएससी लाइब्रेरी को इन विट्रो कंपार्टमेंटल ट्रांसक्रिप्शन ट्रांसक्रिप्शन ट्रांसक्रिप्शन ट्रांसक्रिप्शन वाटर-इन-ऑयल पायस9,10,11में व्यक्त किया गया है। प्रत्येक बूंद के भीतर, व्यक्त एंजाइम की विशिष्टता ईएससी(चित्रा 1बी,स्टेप आई) की स्थिति को प्रभावित करती है। वर्णित व्यवस्था के लिए, अनुवादित प्रोटीन की वांछित दरार गतिविधि डीएनए के बायोटिन टैग को हटा देती है लेकिन काउंटर चयनित अनुक्रम के साथ अन्य ईएससी अंत को प्रभावित नहीं करती है। जब पायस टूट जाता है, तो स्ट्रेपेविडिन एफ़िनिटी पुलडाउन द्वारा बायोटिनी के टुकड़ों को हटा दिया जाता है, ताकि वांछित गतिविधि के साथ बूंदों से केवल टुकड़े बने रहें(चित्रा 1बी,चरण II)। यह स्टेप निष्क्रिय रिज़ वेरिएंट को हटा देता है। पुल-डाउन कदम का अलौकिक अंश फिर पीसीआर द्वारा परिलक्षित होता है। पहली पीसीआर प्रतिक्रिया प्राइमर F2 और R1 में इस्तेमाल किया जाता है(चित्रा 1ए, बी,कदम III) । प्राइमर F2 काउंटर चयनित अनुक्रम और अणु अंत के बीच ईएससी अनुभाग को बांधता है। इसलिए, ईएससी उन वेरिएंट को व्यक्त करते हैं जो काउंटर चयनित अनुक्रम को छोड़ने में सक्षम हैं (और इसलिए, प्राइमर एफ 2 और आर 1 के लिए बाध्यकारी साइटों को दो अलग-अलग डीएनए अणुओं में अलग करें) परिलक्षित नहीं होते हैं और इस प्रकार पुस्तकालय से हटा दिए जाते हैं। प्राइमर आर 1 चयनित साइट और ईएससी के मूल के बीच बांधता है ताकि यह चयनित साइट की दरार स्थिति से प्रभावित न हो और वांछित गतिविधि (जीजीएटीसीसी) के लिए दरार साइट को पुनर्स्थापित करे। चक्र एक दूसरी पीसीआर (प्राइमर F1 और R2 के साथ) द्वारा बंद कर दिया गया है जो चयनित साइट के करीब 5 ' अंत में बायोटिन जोड़ता है और ईएससी(चित्रा 1बी,चरण IV) के विपरीत छोर के करीब काउंटर चयनित साइट पर डिजाइन किए गए भिन्नता को पुनर्स्थापित करता है। परिणामस्वरूप डीएनए मिश्रण चयन के एक और दौर के लिए तैयार है।

चयन प्रोटोकॉल की सफलता नए, अधिक कठोर लक्ष्य मान्यता अनुक्रम के उचित विकल्प और मुतजेनेसिस रणनीति और इसके प्रभावी कार्यान्वयन के सावधानीपूर्वक डिजाइन पर दृढ़ता से निर्भर करती है। क्योंकि उन्हें दूर करने की तुलना में आरईई की मामूली पहले से मौजूद प्राथमिकताओं में सुधार करना बहुत आसान है, हम किसी भी पहले से मौजूद प्राथमिकताओं के गतिज अध्ययन के साथ शुरू करने की सलाह देते हैं। सावधान म्यूटाजेनेसिस डिजाइन की आवश्यकता एक उत्परिवर्ती पुस्तकालय के सीमित आकार से परिणाम देती है जिसे प्रस्तुत प्रोटोकॉल (एक ही प्रयोग में 109 क्लोन) द्वारा संसाधित किया जा सकता है। इसलिए सभी 20 संभव अमीनो एसिड प्रतिस्थापन प्रभावी ढंग से केवल कुछ पदों में परीक्षण किया जा सकता है (चर्चा देखें) । एक वैकल्पिक विधि के रूप में प्रस्तुत त्रुटि-प्रवण पीसीआर (ईपी-पीसीआर) जैसे यादृच्छिक म्यूटाजेनेसिस, मौजूदा जटिलता का गहन अंडरसैंपलिंग करने के लिए नेतृत्व करेंगे। यदि डीएनए के संपर्कों में शामिल संभावित अमीनो एसिड पदों से संबंधित कोई भी जानकारी (या यहां तक कि कॉग्नेट अनुक्रम में पतित न्यूक्लियोटाइड्स के करीब निकटता में स्थित) उपलब्ध है, तो निश्चित रूप से इसका उपयोग ओलिगोन्यूक्लियोटाइड गाइडेड संतृप्ति म्यूटाजेनेसिस (प्रोटोकॉल चरण 1.6-3.10) के लिए कुछ अमीनो एसिड का चयन करने के लिए किया जाना चाहिए।

Protocol

1. ईएससीएस की तैयारी

  1. प्रतिबंध-संशोधन प्रणाली के क्लोन मिथाइलट्रांसफरेज़ को कम कॉपी संख्या प्लाज्मिड (जैसे, pACYC184 या pACYC174 या उनके डेरिवेटिव) में इंजीनियर किया जाएगा।
    नोट: बैक्टीरियल होस्ट स्ट्रेन क्लोन एंजाइम द्वारा पेश किए गए मिथाइलेशन को बर्दाश्त करने और T7 आरएनए बहुलक की प्रेरणा अभिव्यक्ति प्रदान करने में सक्षम होना चाहिए। ER2566 तनाव (McrA, McrBC, और Mrr म्यूटेशन ले जाने) का उपयोग करने की सिफारिश की है।
  2. पुष्टि करें कि रीकॉम्बिनेंट प्लाज्मिड डीएनए को कॉग्नेट एंड्रोन्कलीज द्वारा क्लीवेज के खिलाफ संरक्षित किया जाता है, जिसमें 2 घंटे के लिए एंजाइम आपूर्तिकर्ता द्वारा अनुशंसित बफर और तापमान में कॉग्नेट रेज़ की 10 इकाइयों के साथ प्लाज्मिड डीएनए के 0.5 μg का इलाज किया जाता है।
  3. इस तनाव की सक्षम कोशिकाओं को तैयार करें।
    नोट: किसी भी विधि का उपयोग किया जा सकता है। एनएलएआईवी इंजीनियरिंग परियोजना ने एक साधारण कैल्शियम क्लोराइड विधि12का उपयोग किया ।
  4. एक अलग अपवर्जन समूह से T7 प्रमोटर के नियंत्रण में REase के लिए ORF के साथ पुनः संयोजन प्लाज्मिड का निर्माण और कदम १.१ में मिथाइलट्रास्फेराज़ जीन युक्त एक से एक अलग चयन मार्कर के साथ । वेक्टर PET28 और PET30 का उपयोग किया जा सकता है।
  5. टी 7 प्रमोटर और साइलेंट म्यूटेशन(चित्रा 2,टेबल 1A) शुरू करके एंजाइम ओआरएफ के स्टॉप कोडन के बीच पुनः संयोजन प्लाज्मिड के अनुभाग से इंजीनियर एंजाइम के लिए सभी मान्यता साइटों को हटा दें।
    नोट:
    यदि ऐसी एक से अधिक साइट को हटादिया जाना चाहिए, तो कई उत्परिवर्तन दौर आवश्यक होंगे (चरण 1.5.1-1.5.7)।
    1. एक अंदर-बाहर पीसीआर प्रतिक्रिया का उपयोग करें जो प्राइमर(टेबल 2ए)के 5 ' सिरों पर पेश की गई डिजाइन विविधताओं के साथ पूर्ण लंबाई प्लाज्मिड को बढ़ाती है।
    2. पीसीआर रिएक्शन के 50 माइक्रोन में डीपीएनआई एंनोन्यूलीज के 10 यू जोड़कर टेम्पलेट डीएनए निकालें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. अगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा उत्पादों को हल करें। पूर्ण लंबाई प्लाज्मिड के अनुरूप बैंड को काट ें और इसे एक वाणिज्यिक किट के साथ शुद्ध करें।
    4. 10x लिगेशन बफर (1x एकाग्रता के लिए) जोड़ें और एटीपी (1 mM करने के लिए) के साथ पूरक करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिन के लिए T4 पॉलीन्यूक्लियोटाइड किनेज और इनक्यूबेट के 10 यू जोड़ें। 10 मिन के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करके एंजाइम को निष्क्रिय करें।
    5. खूंटी 4000 से 5%, एटीपी (1 mM करने के लिए) के साथ फिर से पूरक जोड़ें, और T4 डीएनए लिगाज के 5 यू जोड़ें। कमरे के तापमान (आरटी) पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
    6. कॉग्नेट मिथाइलट्रांसफरेज (चरण 1.1) ले जाने वाले सक्षम बैक्टीरियल स्ट्रेन में बदलें।
    7. प्लाज्मिड डीएनए को छोटे पैमाने पर अलग करें और डिएऑक्सी अनुक्रमण द्वारा अनुक्रम परिवर्तनों की शुरुआत की पुष्टि करें।
  6. ओलिगोन्यूक्लियोटाइड निर्देशित म्यूटाजेनेसिस(चित्रा 2, तालिका 1 बी)द्वारा लक्षित अनुक्रम (एस) के करीब अद्वितीय प्रतिबंध साइटों का परिचय दें। प्रत्येक साइट के लिए चरण 1.5.1-1.5.7 का पालन करें।
    नोट: यह कदम तभी किया जाता है जब एक लक्षित म्यूटाजेनेसिस का उपयोग किया जाता है। यदि यादृच्छिक म्यूटाजेनेसिस कर रहे हैं, तो चरण 2-3 को छोड़ दें और इसके बजाय धारा 3 पर जाएं। प्रस्तुत उदाहरण में सभी साइटों को लक्षित क्षेत्रों के ऊपर पेश किया गया था, लेकिन उन्हें डाउनस्ट्रीम भी पेश किया जा सकता है।
  7. ईएससी (टेबल 1 सी) के प्रवर्धन के लिए डिजाइन प्राइमर।
    1. एंनोन्यूलीज ओआरएफ के रिवर्स प्राइमर बाइंडिंग डाउनस्ट्रीम को डिजाइन करें जो चयनित मान्यता साइट (आर 1) और इसके छोटे संस्करण (आर 2) को पेश करेगा जो चयनित NlaIV अनुक्रम के बाहर बांधता है और इसमें 5 'अंत में बायोटिन शामिल है (चित्रा 1देखें)।
    2. टी 7 प्रमोटर के ईएससी अपस्ट्रीम के लिए एक फॉरवर्ड प्राइमर (F1) बाध्यकारी डिजाइन करें। इस प्राइमर को मूल मान्यता अनुक्रम (यानी, चयनित रिवर्स अनुक्रम के अपवाद के साथ मूल एंजाइम द्वारा मान्यता प्राप्त अनुक्रम विविधताओं की अधिकतम) के प्रतिचयनित संस्करण (एस) को भी पेश करना चाहिए।
      नोट: इस प्राइमर (F2) का एक छोटा संस्करण जो अनुक्रम को काउंटरचयनित अनुक्रम में शामिल करता है, बाद में चयनात्मक पीसीआर (चरण 5.9) में उपयोग किया जाएगा।

2. मुटाजेनिक प्राइमर का स्प्लिट-एंड-मिक्स संश्लेषण

नोट: इस चरण का उपयोग केवल उन परियोजनाओं के लिए किया जाता है जिन्हें एक से अधिक साइट पर उपसंतृप्ति म्यूटाजेनेसिस की आवश्यकता होती है। मल्टीपल संश्लेषण स्तंभों के साथ एक सिंथेसाइज़र की आवश्यकता होती है। म्यूटाजेनेसिस आवृत्तियों के अनुसार यादृच्छिक एनएनएस कोडन ट्रिपलेट और जंगली प्रकार के कोडन ट्रिपलेट के संश्लेषण के लिए कॉलम असाइन करें। उदाहरण के लिए, यदि सात समान मात्रा संश्लेषण कॉलम उपलब्ध हैं, और किसी दिए गए साइट पर 0.3 की उत्पत्ति दर वांछनीय है, तो ~ 0.3 x 7 या दो कॉलम में यादृच्छिक एनएनएस कोडन जोड़ें, और ~ 0.7 x 7 या पांच कॉलम(चित्रा 3)में जंगली प्रकार के कोडन जोड़ें।

  1. उपसंतृप्ति उत्ताजन के लिए साइटों के बारे में निर्णय लें। साइटों के काल्पनिक महत्व के अनुसार म्यूटाजेनेसिस आवृत्तियों का चयन करें (यानी, साइट जितनी अधिक महत्वपूर्ण है, आवृत्ति उतनी ही अधिक है), समग्र पुस्तकालय जटिलता पर सीमा को ध्यान में रखते हुए (चर्चा देखें)।
  2. सभी स्तंभों में सिंथेसाइज ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स, ट्रिपल तक तुरंत 3'-अंत से गिनती दूसरी उपसंतृप्ति उत्तान साइट से पहले। पिछले संश्लेषण चक्र में 5'-ट्राइटाइल सुरक्षा समूह को न हटाएं (सिंथेसाइज़र पर ट्राइटाइल-ऑन विकल्प का उपयोग करें)। सुरक्षा समूह अगले संश्लेषण चक्र (चित्रा 3में चरण 1) की शुरुआत में हटा दिया जाएगा ।
  3. संश्लेषण स्तंभों को खोलें। नियंत्रित ताकना ग्लास (सीपीजी) संश्लेषण एक सूखी 1.5 मिलील ट्यूब में समर्थन ले लीजिए और भंवर द्वारा मिश्रण। मिश्रित सीपीजी रेसिन को नए संश्लेषण स्तंभों में पुनर्विभाजित करें। आर्द्रता शुरू करने से बचें, क्योंकि यह समग्र उपज (चरण 2 और 4 में चित्रा 3)कम हो जाएगा।
  4. संश्लेषण जारी रखें, उपसंतृप्ति म्यूटाजेनेसिस साइट ट्रिपल से शुरू करें। वांछित म्यूटाजेनेसिस आवृत्ति के अनुसार यादृच्छिक एनएनएस ट्रिपलेट या जंगली प्रकार के ट्रिपलेट के लिए कॉलम असाइन करें (ऊपर नोट देखें)। यदि अतिरिक्त उपसंतृप्ति साइटें मौजूद हैं, तो केवल अगले उपसंतृप्ति म्यूटाजेनेसिस साइट से पहले ट्रिपल पर आगे बढ़ें। फिर, अंत में एक 5'-ट्राइटाइल समूह छोड़ दें (सिंथेसाइज़र पर 5'-ट्राइटाइल-ऑन विकल्प) (चित्रा 3में चरण 3)। फिर चरण 2.3 के साथ जारी रखें।
  5. यदि कोई और उपसंतृप्ति साइटें डाउनस्ट्रीम मौजूद नहीं हैं, तो संश्लेषण को पूरा करें, अंत में 5'-ट्राइटाइल समूह (सिंथेसाइज़र पर 5'-ट्राइटाइल-ऑन विकल्प) (चरण 5 में चित्रांकिक 3)छोड़ दें।
  6. शुद्धिकरण कारतूस निर्माता के निर्देशों के अनुसार ओलिगोन्यूक्लियोटाइड लाइब्रेरी को डिप्रोटेक्ट और शुद्ध करें।
    नोट: सीपीजी से डिप्रोटेक्शन द्वारा जारी ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को रिवर्स चरण उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमेटोग्राफी (एचपीएलसी) में ट्राइटाइल-ऑन के साथ शुद्ध किया जा सकता है जिसके बाद एक मैनुअल ट्राइटाइल ग्रुप रिमूवल (आरटी में 80% एसिटिक एसिड के साथ 1 एच उपचार) और दूसरा एचपीएलसी शुद्धि होती है।
  7. यूरिया-पेज जेल में ओलिगोन्यूक्लियोटाइड लाइब्रेरी की गुणवत्ता की जांच करें।

3. वेरिएंट लाइब्रेरी जनरेट करना

नोट: चरण 1.6 से पुनः संयोजन प्लाज्मिड का उपयोग करें।

  1. ओलिगोन्यूक्लियोटाइड निर्देशित म्यूटाजेनेसिस द्वारा पुस्तकालयों को उत्पन्न करें।
    नोट:
    वैकल्पिक रूप से, ईपी-पीसीआर प्रोटोकॉल (चरण 3.2) का उपयोग करें।
    1. T7 प्रमोटर से अद्वितीय प्रतिबंध एंजाइम साइट के लिए एक वर्ग बढ़ाना मुताजेनेसिस के साथ लक्षित अनुक्रम flanking (NlaIV के मामले में: साली, EcoRI, या Eco52I)(तालिका 1B-C, तालिका 2B, चित्रा 4)। ईएससी के 3 के अंत तक अद्वितीय प्रतिबंध एंजाइम साइट से दूसरे भाग को बढ़ाना।
    2. 8 माइक्रोन ऑफ वॉटर, 1.5 माइक्रोन ऑफ 10x प्रतिबंध एंजाइम बफर, और उचित प्रतिबंध एंजाइमों (साली, इकोरी या Eco52I) की 5 इकाइयों के साथ पीसीआर प्रतिक्रियाओं (चरण 3.1.1 से) के अलग से 5 माइक्रोन मिलाएं और 2 घंटे के लिए उचित तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    3. अगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग करके दोनों प्रतिक्रियाओं के उत्पादों को हल करें। अपेक्षित आकार बैंड को काटें और एक वाणिज्यिक किट के साथ शुद्ध करें।
    4. एक अगारोज जेल में शुद्ध उत्पादों के 1/3 तक चलाएं और घनत्व द्वारा प्रत्येक शुद्ध बैंड की एकाग्रता को मापें।
    5. 1x लिगाज बफर और टी 4 डीएनए लिगाज के 1 यू और आरटी में 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट के साथ 1:1 मोलर अनुपात में ईएससीएस के दो भागों का लिगेशन स्थापित करें।
    6. अगारोज जेल में प्रतिक्रिया उत्पादों को हल करें। अपेक्षित आकार के उत्पादों को काटें और एक वाणिज्यिक किट के साथ शुद्ध करें।
    7. प्राइमर्स F1 और R2(तालिका 1C और तालिका 2A)के साथ पीसीआर प्रतिक्रिया में शुद्ध लिगेशन उत्पादों को बढ़ाना। 20 से अधिक प्रवर्धन चक्र न चलाएं।
    8. एक अगारोज जेल में पीसीआर प्रतिक्रियाओं को अलग करें। उत्पादों को काट ें और एक वाणिज्यिक किट के साथ शुद्ध करें।
    9. अगारोज जेल में पिछले चरण से शुद्ध पुस्तकालय का 5 μL aliquot चलाएं और घनत्व द्वारा एकाग्रता को मापें।
    10. म्यूटेशन फ्रीक्वेंसी और डिस्ट्रीब्यूशन(टेबल 3)की जांच के लिए लाइब्रेरी (5 माइक्रोन तक) और सीक्वेंस >15 क्लोन का एक छोटा सा नमूना क्लोन करें । 4 कदम आगे बढ़ें।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, ईएससीएस के छोटे नमूने के उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण का उपयोग किया जा सकता है।
  2. ईपी-पीसीआर प्रदर्शन करें।
    1. प्लाज्मिड से ईएससी को बढ़ाना प्राइमरF1 और R1 के साथ चरण 1.5.7 में प्राप्त किया गया। Taq I बहुलक(तालिका 1B)के साथ 20 चक्र चलाएं ।
    2. जेल पीसीआर उत्पाद को शुद्ध करता है।
    3. पिछले कदम से शुद्ध पीसीआर उत्पाद के 2 एनजी के साथ EP-PCR की स्थापना की और एफ 1 और आर 1 प्राइमर के साथ EP-पीसीआर(टेबल 1 C)के 15 चक्र चलाते हैं ।
    4. जेल उत्पाद को शुद्ध करें और जेल घनत्व द्वारा इसकी मात्रा निर्धारित करें।
      नोट: शुद्ध ईपी-पीसीआर उत्पाद की कम एकाग्रता के कारण मात्राीकरण के लिए लगभग 1/3 का उपयोग करें।
    5. म्यूटेशन फ्रीक्वेंसी और डिस्ट्रीब्यूशन(टेबल 4)की जांच के लिए लाइब्रेरी (1/5 तक) और सीक्वेंस >15 क्लोन का एक छोटा सा नमूना क्लोन करें ।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, ईएससीएस के छोटे नमूने के उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण करें।

4. प्रदर्शन में विट्रो ट्रांसक्रिप्शन-अनुवाद प्रतिक्रिया

  1. इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन-अनुवाद में टेस्ट एंटोन्यूलीज अभिव्यक्ति और एंजाइमैटिक गतिविधि।
    1. अणु के केंद्र के करीब स्थित एंटोन्यूलीज के लिए एक ही मान्यता स्थल के साथ एक छोटा (200-500 बीपी) सब्सट्रेट तैयार करें ताकि दरार प्रतिक्रिया का आसानी से पता लगाया जा सके।
      नोट: सब्सट्रेट तैयार करने का सबसे आसान तरीका किसी भी डीएनए अणु के उचित टुकड़े के पीसीआर प्रवर्धन द्वारा है। सब्सट्रेट को क्लीवेज डिटेक्शन को आसान बनाने के लिए रेडियोलेबल या फ्लोरोसेंटी लेबल किया जा सकता है ।
    2. निर्माता की सिफारिशों के अनुसार 0.5 माइक्रोन वाइल्ड टाइप ईएससी के साथ ट्रांसक्रिप्शन-ट्रांसलेशन रिएक्शन के 50 माइक्रोन सेट करें। मैग्नीशियम नमक (एमजीसीएल2,एमजीएसओ4,और मैग्नीशियम एसीटेट का परीक्षण किया जा सकता है) 1.5 mM और पिछले चरण से सब्सट्रेट की उचित मात्रा (अवेलेबल डीएनए के मामले में कम से कम 0.5 μg)।
      नोट: किसी भी प्रतिलेखन/अनुवाद किट जिसमें मैग्नीशियम द्वारा सक्रिय न्यूक्लीज नहीं होता है, का उपयोग किया जा सकता है । कुछ किट विक्रेता उत्पादन के दौरान डीएनए संदूषण को दूर करने के लिए न्यूकलीज का उपयोग करते हैं और फिर नाइसलीज अवरोधक के रूप में चेलेटर जोड़ते हैं। इस तरह के किट इस विधि के साथ संगत नहीं हैं।
    3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रतिलेखन-अनुवाद प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें। फिर 2 घंटे के लिए प्रतिबंध एंजाइम के लिए इष्टतम तापमान के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण स्थानांतरित करें।
    4. एक अगारोज जेल में सब्सट्रेट के दरार का विश्लेषण उचित पता लगाने (जैसे, डीएनए धुंधला, फ्लोरेसेंस विज़ुअलाइज़ेशन, या ऑटोरेडियोग्राफी)(चित्रा 5)के बाद।
      नोट: कंपार्टमेंट के साथ आगे बढ़ने से पहले सब्सट्रेट का कम से कम आंशिक दरार जरूरी है। यदि यह प्राप्त नहीं होता है, तो मैग्नीशियम रासायनिक रूप या इसकी एकाग्रता का और अनुकूलन आवश्यक है।
  2. 15 मीटर शंकुई ट्यूब में स्नैच 80 के 225 माइक्रोन और ट्वीन 80 से 5 मीटर खनिज तेल के 25 माइक्रोन जोड़कर तेल-सर्फेक्टेंट मिश्रण तैयार करें। ट्यूब 15x को कोमल उलटते हुए अच्छी तरह मिलाएं।
  3. प्रत्येक पुस्तकालय हस्तांतरण के लिए तेल के 950 μL-surfactant मिश्रण एक 2 mL दौर नीचे क्रायोजेनिक शीशी, एक पुस्तकालय के नाम के साथ लेबल, और बर्फ के लिए हस्तांतरण । प्रत्येक शीशी में एक छोटा बेलनाकार सरगर्मी बार (5 x 2 मिमी2)रखो।
  4. निर्माता के सुझावों के अनुसार इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन-ट्रांसक्रिप्शन-ट्रांसलेशन रिएक्शन मिक्सचर (प्रत्येक लाइब्रेरी के लिए 50 माइक्रोन) तैयार करें। मैग्नीशियम क्लोराइड के साथ मिश्रण को 1.5 mM की अंतिम एकाग्रता में पूरक करें (चरण 4.1.4 देखें)।
  5. बर्फ पर 1.5 मीटर ट्यूबों में 50 माइक्रोन एलिकोस वितरित करें।
  6. बर्फ पर प्रतिक्रिया मिश्रण करने के लिए पुस्तकालय के 1.7 fmole (धारा 3 से) जोड़ें।
    नोट: चयन दक्षता के लिए अधिक मात्रा में अभिव्यक्ति पुस्तकालय का उपयोग न करें। एक से अधिक डीएनए अणु वाले जलीय बूंदों की आवृत्ति को कम करना महत्वपूर्ण है।
  7. प्रत्येक पुस्तकालय के लिए लगातार पानी में तेल पायस तैयार करें।
    1. 1,150 आरपीएम पर सेट सरगर्मी गति के साथ एक चुंबकीय उभारा पर बर्फ से भरा एक छोटा बीकर (या बड़ी बोतल कप) रखो।
    2. तेल-सर्फेक्टेंट मिश्रण के 950 माइक्रोन के साथ एक क्रायोजेनिक शीशी और चुंबकीय उभारक पर बर्फ-ठंडे बीकर के लिए चरण 4.3 से एक छोटा सा सरगर्मी बार स्थानांतरित करें। जांच करें कि सरगर्मी बार घूम रहा है।
    3. 30 एस अंतराल में 2 मिनट की अवधि में इन विट्रो लाइब्रेरी-ट्रांसक्रिप्शन-ट्रांसलेशन मिश्रण के पांच 10 माइक्रोन एलिकोस जोड़ें और एक अतिरिक्त मिनट के लिए सरगर्मी जारी रखें। एक बर्फ कंटेनर के लिए पायस के साथ शीशी स्थानांतरित करें। कदम 4.7.2 के साथ शुरू अगले पुस्तकालय के साथ आगे बढ़ें।
    4. सभी पुस्तकालयों के बाद किट निर्माता की सिफारिशों के अनुसार सभी पुस्तकालयों के ऊष्मायन शुरू कर रहे हैं।
  8. एक अतिरिक्त 2 घंटे के लिए इंजीनियर एंटोन्यूलीज के लिए तापमान इष्टतम करने के लिए शीशियों का हस्तांतरण और फिर उन्हें कम से कम 10 न्यूनतम के लिए बर्फ पर डाल दिया।

5. पुस्तकालयों और चयन की निरंतर प्रसंस्करण

  1. क्रायोजेनिक शीशियों से पायस को ठंडे 1.5 मिलीएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें, 0.5 मीटर ईटीए के 1 माइक्रोन जोड़ें और उन्हें कमरे के तापमान पर 5 मिन के लिए 13,000 x ग्राम पर अपकेंद्री जोड़ें।
  2. ऊपरी तेल चरण को पिपेट के साथ हटा दें। यदि तेल-पानी का इंटरफेज दिखाई नहीं देता है, तो जलीय चरण को फ्रीज करने के लिए कम से कम 5 मिन के लिए ट्यूब को कम से कम 20 डिग्री सेल्सियस तक इनक्यूबेट करें, फिर तुरंत तरल तेल चरण को बाहर निकाल दें।
  3. 10 एम Tris HCl पीएच 8.0 के 100 μL जोड़ें और तुरंत फिनॉल के 150 μL के साथ निष्कर्षण प्रदर्शन: क्लोरोफॉर्म (1:1 v/v) लघु भंवर द्वारा 13,000 x ग्रामपर 30 एस अपन्तिफेशन द्वारा चरण जुदाई के बाद। ऊपरी जलीय चरण को लीजिए।
  4. 3 एम सोडियम एसीटेट (पीएच = 5.2), ग्लाइकोजन के 2.5-5 माइक्रोन और इथेनॉल के 2.5 वोल (375 माइक्रोन) के 0.1 वोल (15 माइक्रोन) जोड़कर डीएनए को उपजी। 1 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस और 15 मिन के लिए 13,000 x,4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र पर इनक्यूबेट। अधिनायक को त्यागें और संक्षेप में ठंड के 1 मिलील 70% इथेनॉल के साथ गोली धोलें।
  5. डीएनए/ग्लाइकोजन गोली को स्पीडवैक या एयर ड्राई फॉर >5 मिन में सुखा लें ।
  6. 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच = 7.5) के 50 माइक्रोन में गोली भंग करें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार तैयार स्ट्रेप्टाविडिन चुंबकीय मोतियों के 5 μL जोड़ें और आरटी में 1 घंटे के लिए मिश्रण, अधिमानतः एक हिंडोला मिक्सर में या कोमल भंवर द्वारा।
  7. एक चुंबकीय स्टैंड पर मोतियों को अलग करें और बायोटिन के बिना डीएनए में समृद्ध तरल एकत्र करें।
  8. इथेनॉल वर्षा (चरण 5.4-5.5) द्वारा डीएनए को केंद्रित करें।
  9. पानी के 5 μL में पिछले कदम से केंद्रित डीएनए भंग और F2 और R1 प्राइमर(तालिका 1A)के साथ एक पीसीआर प्रतिक्रिया में एक टेम्पलेट के रूप में उपयोग करें ।
    नोट: टेम्पलेट संदूषण के साथ समस्याओं से बचने और पीसीआर कलाकृतियों को कम करने के लिए Taq बहुलक (Pfu या फुजन नहीं) का उपयोग करें और टेम्पलेट आकार (1 केबी = 1 मिन) (तालिका 2 बीदेखें) के आनुपातिक विस्तार समय के साथ 18-20 चक्र चलाते हैं।
  10. पीसीआर उत्पाद को अगारोज जेल में बदलें और अपेक्षित आकार के उत्पाद को काट दें। कुछ गंदा इंगित करता है कि विभिन्न आकारों के उत्पाद हैं (चित्रा 6देखें)। एक वाणिज्यिक किट के साथ जेल स्लैब से डीएनए शुद्ध।
  11. चरण 5.10 से डीएनए के 50 एनजी और प्राइमर F1 और R2 चरण 5.9 में एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग कर के साथ एक दूसरी पीसीआर प्रतिक्रिया चलाएं। 5.10 में वर्णित उत्पाद शुद्धिकरण के साथ आगे बढ़ें। इन विट्रो चयन (चरण 4.6) के अगले दौर में अगारोज जेल डेंसिटी (यूवी स्पेक्ट्रोस्कोपी नहीं) द्वारा क्वाटिफिकेशन के बाद शुद्ध डीएनए का उपयोग किया जा सकता है।

6. बदल अनुक्रम विशिष्टता के लिए स्क्रीन वेरिएंट

  1. क्लोन चयनित वेरिएंट।
    1. एंजाइम विक्रेता द्वारा अनुशंसित तापमान और बफर में ओआरएफ की क्लोनिंग के लिए उपयुक्त 10 यू प्रतिबंध एंजाइमों के साथ 2 घंटे के लिए चरण 5.10 से उत्पाद को पचाएं। अगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस के साथ उत्पादों को हल करें और अपेक्षित आकार के टुकड़े को अलग करें।
    2. प्लाज्मिड वेक्टर (जैसे, pET28) को चरण 6.1.1 में समान एंजाइमों के साथ डबल क्लीवेज द्वारा तैयार करें और जेल उत्पाद को वाणिज्यिक डीएनए जेल शुद्धिकरण किट के साथ शुद्ध करें।
    3. वेक्टर की सांद्रता का अनुमान लगाएं और अगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस के साथ घनत्व द्वारा डालें।
    4. T4 डीएनए लिगाज और वेक्टर के 1-5 यू के साथ एक लिगेशन स्थापित करें: एंजाइम विक्रेता द्वारा अनुशंसित 1x लिगाज बफर में मोलर अनुपात 1:3-1:5 डालें। आरटी में 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट और परिवर्तन या इलेक्ट्रोपोशन12द्वारा उपयुक्त मेजबान बैक्टीरिया (चरण 1.3 से) में परिचय।
    5. एलबी प्लेटों पर प्रवर्तकों का चयन करें जिसमें उपयुक्त एंटीबायोटिक (PET28 या pET30 वेक्टर के लिए कानामाइसिन का ५० μg/mL) और 1% ग्लूकोज होता है ।
  2. एक्सप्रेस प्रोटीन वेरिएंट।
    1. परिवर्तन से एकल उपनिवेशों को टीका लगाना (24 क्लोन तक आसानी से एक रन में संसाधित किया जा सकता है) एलबी के 2 मिलील में कनकमिन (50 μg/mL) और 1% ग्लूकोज के साथ और मिलाते हुए के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बढ़ते हैं।
    2. 15 मिलीग्राम गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) पौंड का टीका लगाकर 100 माइक्रोन कनामाइसिन युक्त और रात भर की संस्कृति के 0.75 मिलीग्राम के साथ ग्लूकोज नहीं और जोरदार झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
      नोट: या तो 50 मिलीआर अपकेंद्री ट्यूब या 100 मीटर एर्लेनमेयर फ्लास्क का उपयोग किया जा सकता है।
    3. रातोंरात संस्कृति के 1 mL (ग्लाइसेरोल = 15%) अच्छी तरह से मिलाएं और -70 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज कर दें।
    4. 2-3 एच पूरक के बाद संस्कृति के 15 मिलीग्राम (चरण 6.2.1 से) IPTG के साथ 1 mM और संस्कृति के लिए एक अतिरिक्त 5 घंटे के लिए।
    5. बैक्टीरियल पैलेट को सेंट्रलाइज्ड (10,000 x g,4 डिग्री सेल्सियस, 10 मिन) द्वारा इकट्ठा करें और -70 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।
  3. प्रोटीन वेरिएंट को शुद्ध करें।
    1. एक विस्तृत बोर पिपेट टिप के साथ 1.5 मिलीग्राम ट्यूब में बी 1 बफर के 200 माइक्रोन में निकल एफ़िनिटी रेसिन निलंबन के 20 μL स्थानांतरित करें, धीरे-धीरे मिश्रण करें, और अपकेंद्री (5,000 x ग्राम,30 एस, 4 डिग्री सेल्सियस)। पाइपिंग करके अधिनेता निकालें और ट्यूब को बर्फ पर छोड़ दें।
    2. जोरदार भंवर द्वारा B1 के 300 μL में चरण 6.2.5 से बैक्टीरियल गोली को फिर से निलंबित करें। निलंबन को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    3. B1 (1 मिलीग्राम/mL की अंतिम एकाग्रता) में 100x प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल और lysosome समाधान के 3 μL जोड़ें । एक टिप सुसज्जित जांच के साथ ध्वनि द्वारा कोशिकाओं को विखंडित। बीच में बर्फ में और gt;15 एस टिप ठंडा समय के साथ प्रति नमूना छह 10 एस फटने का उपयोग करें । हर समय बर्फ पर सेल निलंबन रखें।
    4. सेंट्रलाइज्ड (2 मिन, 12,000 x जी,4 डिग्री सेल्सियस) द्वारा पैलेट सेल मलबा और 250 माइक्रोन ऑफ सुपरनेटेंट को 6.3.1 से रेसिन एलिकोट में स्थानांतरित करें।
    5. एक ठंडे कमरे में 15 min के लिए मिश्रण, अधिमानतः एक हिंडोला मिक्सर में या कोमल भंवर द्वारा ।
    6. सेंट्रलाइज (5,000 x ग्राम,30 एस, 4 डिग्री सेल्सियस) और एक पिपेट के साथ अधिवक्कन।
    7. डब्ल्यू बफर के 500 माइक्रोन जोड़ें और धीरे से पुनः निलंबित करें। सेंट्रलाइज (5,000 x ग्राम,30 एस, 4 डिग्री सेल्सियस) और एक पिपेट के साथ अधिवक्कन।
    8. दोहराएं चरण 6.3.7।
    9. बफर ई के 20 μL जोड़ें, धीरे से पुनः निलंबित, और 2-5 मिन के लिए बर्फ पर नमूना छोड़ दें । सेंट्रलाइज (५,००० x ग्राम,30 एस, 4 डिग्री सेल्सियस) और अलौकिक इकट्ठा ।
    10. दोहराएं चरण 6.3.9। पूल अधिनेता।
    11. एसडीएस-पेज (5-10 माइक्रोन)(चित्रा 7)द्वारा प्रोटीन नमूनों का विश्लेषण करें।
  4. परिवर्तित विशिष्टता वाले वेरिएंट के लिए स्क्रीन।
    1. बैकेरियोफेज लैम्ब्डा डीएनए पर परख दरार गतिविधि। प्रोटीन नमूना अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा का 10% तक का गठन कर सकता है। डीएनए के प्रति 0.5 μg और 2 घंटे रिएक्शन टाइम के प्रति प्रोटीन सैंपल का कुल 2 μL एक अच्छा शुरुआती बिंदु है।
    2. जंगली प्रकार के एंजाइम द्वारा उत्पन्न उत्पादों के साथ अगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा प्रतिक्रिया उत्पादों का विश्लेषण करें। आगे के विश्लेषण(चित्रा 8)के लिए जंगली प्रकार एंजाइम द्वारा उत्पन्न एक से स्पष्ट रूप से अलग दरार पैटर्न पैदा करने वाले क्लोन का चयन करें।

Representative Results

यह प्रोटोकॉल सिर्फ एक उपकरण के लिए घट (लेकिन नष्ट नहीं) दो अवांछित वर्गों: निष्क्रिय एंजाइमों और अपरिवर्तित जंगली प्रकार अनुक्रम विशिष्टता के साथ एंटोन्यूकपट्ट्स द्वारा एक इंजीनियर REase के वांछित वेरिएंट की आवृत्ति बढ़ाने के लिए है । दूसरी ओर, क्योंकि REase विशिष्टता बदलने बहुत मुश्किल है, यहां तक कि एक ऐसे संस्करण एक दरार पैटर्न है कि 24 क्लोन की एक स्क्रीनिंग में जंगली प्रकार एंजाइम से अलग है उत्पादन खोजने के लिए एक सफलता माना जाना चाहिए । हमारे हाथों में सबसे अच्छी स्क्रीन होनहार वेरिएंट(चित्रा 8ए)के 20% तक की पहचान कर सकती है।

सकारात्मक परिणाम दृढ़ता से पुस्तकालय की गुणवत्ता (यानी, प्रतिस्थापन की सीमित आवृत्ति और उनके यादृच्छिक वितरण) और पुस्तकालय सदस्यों की बायोटिनेटेड आबादी (चरण 3.6-3.7) पर निर्भर करता है। दोनों समस्याओं का पता लगाया जा सकता है। पुस्तकालय की गुणवत्ता को चयन से पहले संभव (>15) के रूप में कई क्लोन अनुक्रमण या उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण (चरण 3.10, तालिका 3)द्वारा पुस्तकालय के प्रत्यक्ष अनुक्रमण द्वारा जांचा जाना चाहिए। यदि अधिकांश चयनित क्लोन सक्रिय नहीं हैं, तो यह स्ट्रेपेविडिन कैप्चर चयन की विफलता का स्पष्ट संकेत है। पुस्तकालयों के मामले में एक समान प्रभाव देखा जाता है जो कई चयन चक्रों से गुजरते हैं, क्योंकि ऐसे पुस्तकालयों में शायद निष्क्रिय वेरिएंट का प्रभुत्व होता है जो स्ट्रेप्टाविडिन कैप्चर चयन चरण(चित्रा 8बी)से बच गए थे। इसलिए, हर चयन चक्र के बाद स्क्रीनिंग चलाने और चयन पुनरावृत्ति पर निर्भर करने के बजाय मैन्युअल रूप से चयनित आशाजनक वेरिएंट विकसित करने की सलाह दी जाती है।

Figure 1
चित्रा 1: NlaIV इंजीनियरिंग पर आधारित एक नए अनुक्रम विशिष्टता के इन विट्रो चयन । (A)अभिव्यक्ति/चयन कैसेट (ईएससी) के संगठन में REase के लिए दो मान्यता स्थल, 1) दाएं छोर के करीब चयनित अनुक्रम (जीजीएटीसी) और बाएं छोर के करीब 2) काउंटर चयनित अनुक्रम (जीजीएसएससीसी) के साथ-साथ टी7पी और टी7टी-टी7 प्रमोटर और टी7 टर्मिनेटर शामिल हैं । प्राइमर बाइंडिंग साइट्स नीचे दिखाई जाती हैं। जंगली प्रकार और चयनित NlaIV वेरिएंट द्वारा दरार क्रमशः लाल और हरे रंग के त्रिकोण के रूप में दिखाया गया है। (ख)चयन चक्र कदम: I) ईएससी लाइब्रेरी के साथ ट्रांसक्रिप्शन-ट्रांसलेशन-क्लीवेज रिएक्शन का अनुकरण; II) सभी बायोटिनी डीएनए को स्ट्रेप्टाविडिन के साथ लेपित चुंबकीय कणों पर कब्जा कर लिया जाता है और हटा दिया जाता है, इस प्रकार एन्कोडिंग निष्क्रिय वेरिएंट को हटा दिया जाता है; III) ईएससीएस जंगली प्रकार की गतिविधि के साथ REases encoding (यानी, GGSSCC अनुक्रम को क्लीव करने में सक्षम लोग) को समाप्त कर दिया जाता है क्योंकि अनुक्रम का दरार आगे और रिवर्स प्राइमर के लिए बाध्यकारी साइटों को अलग करता है। इसलिए, इन ईएससी का कोई प्रवर्धन नहीं होता है; IV) अगले चयन दौर के लिए इनपुट दाएं छोर पर बायोटिन के अलावा और बाएं छोर पर काउंटर चयनित दृश्यों की भिन्नता को फिर से शुरू करके बनाया गया है। एल्सवाइयर से अनुमति के साथ Czapinska एट अल.8 से फिर से मुद्रित । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: ईएससी की तैयारी। टी7 प्रमोटर के नियंत्रण में एनएलएआईवी ओआरएफ वाले अभिव्यक्ति वेक्टर में मूल निर्माण से प्राप्त टुकड़ा अभिव्यक्ति/चयन के लिए उपयुक्त होने के लिए संशोधित किया गया था । NlaIV ORF से NlaIV साइट डाउनस्ट्रीम हटा दिया गया था और अद्वितीय साइटों (SalI, EcoRI और Eco52I) है कि चयनित पदों को mutagenize करने के लिए इस्तेमाल किया गया था मौन उत्परिवर्तन के रूप में NlaIV ORF में पेश किया गया । अंतिम निर्माण फ्लैंकिंग प्राइमर के साथ परिलक्षित किया गया था जिसने दो फ्लैंकिंग एनएलआईवी साइटों को पेश किया: दाईं ओर बाईं और चयनित अनुक्रम (जीजीएटसीसी)पर काउंटर चयनित अनुक्रम (जीजीएसएससीसी) । रिवर्स प्राइमर ने बायोटिन भी पेश किया। उत्परिवर्तित ईसीएस के निर्माण में उपयोग किए जाने वाले प्राइमर को नीले तीर के रूप में दिखाया गया है और नीचे लेबल किया गया है (तालिका 1B, Cदेखें)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: विभाजन और मिश्रण संश्लेषण की योजना। उदाहरण म्यूटबी प्राइमर संश्लेषण को संदर्भित करता है जहां चार पदों पर 0.8 आवृत्ति पर एनएनएस अनुक्रम पेश किया गया था (तालिका 3भी देखें)। ध्यान दें कि रासायनिक संश्लेषण 3 से 5 तक किया जाता है, लेकिन सभी दृश्यों को विहित 5'-3' अभिविन्यास (यानी, यह इस योजना में दाएं से बाएं आय) में दिखाया गया है। म्यूटाजनस्थितियों में जंगली प्रकार के दृश्यहरे रंग में दिखाए जाते हैं जबकि एनएनएस म्यूटाजेनिक दृश्य लाल रंग में होते हैं। बाद में ईएससी में म्यूटेशन शुरू करने के लिए उपयोग की जाने वाली साली मान्यता साइट को रेखांकित किया जाता है। मिश्रण और बंटवारे के कदम (2 और 4) के अंक दर्शाए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: ओलिगोन्यूक्लियोटाइड लक्षित म्यूटाजेनेसिस में अद्वितीय प्रतिबंध एंजाइम साइटों का उपयोग करें। उत्परिवर्तन परिचय की रणनीति पुस्तकालयों ए-सी के निर्माण के उदाहरण पर दिखाई गई है (चरण 3.1-3.7 देखें)। एल्सवाइयर से अनुमति के साथ Czapinska एट अल.8 से फिर से मुद्रित । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन-अनुवाद में एंडॉन्यूक्लियोलिटिक क्लीवेज। (A)इष्टतम REase बफर में एक परीक्षण सब्सट्रेट का दरार: 1) सब्सट्रेट, 612 बीपी पीसीआर उत्पाद एक ही NlaIV मान्यता साइट के साथ; 2) क्लीवेज उत्पाद, 355 बीपी और 257 बीपी।(बी)इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन-ट्रांसलेशन रिएक्शन (ईएससी के 0.5 माइक्रोन युक्त) में क्लीवेज 1-2) सब्सट्रेट के बिना इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन ट्रांसक्रिप्शन ट्रांसलेशन के 15 माइक्रोनएल एलिकोट (लाइन 2: 1.5 एमएम एमजीसीएल2के साथ पूरक प्रतिक्रिया); 3-4) 1 μg परीक्षण सब्सट्रेट के साथ इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन-अनुवाद के 15 μL aliquots; (लाइन 4: प्रतिक्रिया 1.5 mM MgCl2के साथ पूरक) । एस-डीएनए आकार मार्कर (PBR322 एमएसपीआई के साथ पचा) । नमूनों को 6% देशी पृष्ठ में हल किया गया। डीएनए एहिडियम ब्रोमाइड से दाग था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: चयन चक्र में पहली पीसीआर के उत्पाद। चित्र1Bदेखें, तीसरा चरण; प्रोटोकॉल चरण 5.10। कॉलम सेट 1 और 2 ट्रिपलिकेट में भरे दो अलग-अलग पुस्तकालयों के एलिकोट्स हैं। एस-डीएनए आकार मानक (लैम्ब्डा डीएनए हिंडIII और इकोआरआई के साथ पचाया गया)। तीर पूर्ण लंबाई ईएससी (1,050 बीपी) की स्थिति को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: NlaIV वेरिएंट मिनी पैमाने में आगे स्क्रीनिंग के लिए शुद्ध । देखें चरण 6.3.11। प्रत्येक पंक्ति में एक अलग संस्करण का 10 μL aliquot होता है। एस-प्रोटीन आणविक वजन मानक। नैव आरईईस सबयूनिट का आणविक द्रव्यमान 29.9 केडीए है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8: अनुक्रम विशिष्टता परिवर्तन के लिए NlaIV वेरिएंट की स्क्रीनिंग के उदाहरण । देखें चरण 6.4.2। (ए)होनहार वेरिएंट की उच्च आवृत्ति के साथ सफल स्क्रीनिंग । S = डीएनए आकार मार्कर, लैम्ब्डा डीएनए हिंडIII और EcoRI के साथ क्लीव्ड; जंगली प्रकार (wt) = लैम्ब्डा डीएनए जंगली प्रकार NlaIV के साथ क्लीव; इसलिए = लैम्ब्डा डीएनए सब्सट्रेट, क्लीव्ड नहीं; बहुत कम गतिविधि के साथ अन्य कॉलम = वेरिएंट। वेरिएंट लेबल हैं! = आशाजनक वेरिएंट जो जंगली प्रकार के एंजाइम से अलग दरार पैटर्न का उत्पादन करते हैं; ? = वेरिएंट है कि यह भी अनुक्रम वरीयता बदल सकता है । (ख)असफल स्क्रीनिंग, अधिकांश वेरिएंट निष्क्रिय और जाहिरा तौर पर अनछुए दरार पैटर्न के साथ एक संस्करण के साथ । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 9
चित्र 9: लिगेशन द्वारा वैकल्पिक चयन। इस विकल्प का उपयोग चिपचिपा सिरों को पैदा करने वाले सभी REases के लिए किया जा सकता है। यहां हम MwoI एंजाइम (अप्रकाशित) के लिए एक चयन योजना के लिए एक उदाहरण प्रोटोकॉल पेश करते हैं । I) चयनित अनुक्रम (ईएससी के दाहिने छोर पर स्थित) नीले रंग में दिखाए गए कॉग्नेट अनुक्रम के लाल और चयनित भिन्नता में दिखाए गए परिभाषित अवशेषों के साथ। ईएससी के बाएं छोर पर रखे जाने वाले काउंटर चयनित अनुक्रम के नीचे कोष्ठक में दिखाया गया है; II) MwoI दरार का उत्पाद; III) इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन/अनुवाद को समाप्त करने के बाद, उत्पादों को शुद्ध किया जाता है और अतिरिक्त एडाप्टर के साथ लिगेशन किया जाता है। केवल चयनित अनुक्रम में क्लीव किए गए क्लीवेज उत्पाद ही लिगेशन में भाग ले सकते हैं। इसलिए, निष्क्रिय वेरिएंट को समाप्त कर दिया जाता है, और पुलडाउन कदम अनावश्यक है। काउंटर चयनित अनुक्रम में दरार उत्पाद (ईएससी के बाएं छोर पर, नहीं दिखाया गया) इस लिगेशन में भाग नहीं ले सकता क्योंकि एडाप्टर का फैला हुआ अंत काउंटर चयनित अनुक्रम के पूरक नहीं है; IV) चयनात्मक पीसीआर जंगली प्रकार के पतित अनुक्रम विशिष्टता (काउंटर चयनित साइट के लिए F1 प्राइमर बाध्यकारी डिस्टल) के साथ वेरिएंट को खत्म करने के लिए मुख्य प्रोटोकॉल के रूप में एक ही रणनीति का उपयोग करता है, जबकि निष्क्रिय वेरिएंट चयनात्मक रिवर्स प्राइमर द्वारा समाप्त कर रहे हैं जो अंकल (और इसलिए एडाप्टर लिगेशन द्वारा संशोधित नहीं) दाएं अंत से बांध सकते हैं। अगले चक्र में इस प्रक्रिया को एडाप्टर का उपयोग करके दोहराया जा सकता है जो पिछले चरण के दरार उत्पाद (यानी, पैनल III में "क्लीव्ड कैसेट" और एक उपयुक्त चयनात्मक रिवर्स प्राइमर के समान है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

तालिका 1: एनएलआईवी इंजीनियरिंग में उपयोग किए जाने वाले प्राइमर। टिप्पणियों में उल्लिखित प्रतिबंध साइटों के दृश्यों को रेखांकित किया जाता है। छोटे अक्षर उन दृश्यों को इंगित करते हैं जिनमें डीएनए टेम्पलेट्स में पूरक नहीं होते हैं। कृपया इस तालिका को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

तालिका 2: प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली पीसीआर प्रतिक्रियाओं की शर्तें। टीएम = प्राइमर पिघलने का तापमान (यदि टीएम प्राइमर के लिए अलग है, तो निचले टीएम का उपयोग किया जाना चाहिए)। कृपया इस तालिका को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

तालिका 3: विभाजन और मिश्रण रणनीति के साथ संश्लेषित दो म्यूटाजेनिक प्राइमर की गुणवत्ता जांच के परिणाम। मुतजेनेल्ड कोडन [XXX] के साथ इंगित किए जाते हैं। एक कम सूचकांक संख्या एक एन्कोडेड अमीनो एसिड की स्थिति को इंगित करती है। एल्सवाइयर से अनुमति के साथ Czapinska एट अल.8 से अनुकूलित। कृपया इस तालिका को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

तालिका 4: ईपी-पीसीआर के परिणाम। मुख्य मापदंडई के 22 क्लोन के अनुक्रम विश्लेषण से प्राप्त। कृपया इस तालिका को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

Discussion

यहां वर्णित चयन प्रोटोकॉल NlaIV8,एक मंदपीडी-(D/E) XK गुना मांयता अनुक्रम है कि केंद्रीय NN ठिकानों के साथ एक palindromic लक्ष्य साइट को पहचानता है और एनएन ठिकानों के बीच एक कुंद अंत कटौती उत्प्रेरक के लिए परीक्षण किया गया था । NlaIV उठाया गया था क्योंकि एनएन ठिकानों के बीच दरार पता चलता है कि इन ठिकानों परिसर में प्रोटीन के करीब हैं । सिद्धांत रूप में, प्रोटोकॉल का उपयोग किसी भी अनुक्रम विशिष्ट प्रतिबंध एंनोन्यूस्लीज, मोनोमेरिक या डिमेरिक, किसी भी गुना समूह के लिए किया जा सकता है, किसी भी चौंका देने वाले के डबल स्ट्रैंड ब्रेक को उत्प्रेरित करता है, चाहे उत्प्रेरक और विशिष्ट डोमेन (NlaIV उदाहरण में) मेल खाते हैं या अलग (जैसे, फोकी) हैं। इसके अलावा, सिद्धांत रूप में प्रोटोकॉल न केवल नए, अधिक संकीर्ण एंजाइम विशिष्टता की पीढ़ी के लिए उपयोगी है, बल्कि इसका उपयोग स्टार गतिविधियों को खत्म करने या उच्च निष्ठा एंडोन्यूक्स बनाने के लिए भी किया जा सकता है। हालांकि अभी तक इस सबका परीक्षण नहीं किया गया है। विशेष रूप से, स्टार गतिविधि का लक्षित उन्मूलन जटिल हो सकता है, क्योंकि एक ही अमीनो एसिड अवशेष वांछित और अवांछित ठिकानों के लिए बाध्यकारी में शामिल किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल में वर्णित इन विट्रो चरण संकुचित विशिष्टताओं के चयन तक ही सीमित नहीं हैं, लेकिन अन्यथा परिवर्तित विशिष्टताओं का चयन करने के लिए भी उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, तब वैरिएंट एंनोन्यूकलीज के साथ एक समस्या है: यदि सब्सट्रेट्स के स्पेक्ट्रम में माता-पिता के एंनोटुकलीज द्वारा क्लीव ्ड नहीं उपन्यास लक्ष्य शामिल हैं, तो सामान्य रूप से इस गतिविधि के हानिकारक प्रभावों से कोशिकाओं की रक्षा करने का कोई अच्छा तरीका नहीं है। इसके विपरीत, यदि एंनोन्यूलीज विशिष्टता केवल संकुचित है, तो लक्ष्य जंगली प्रकार के लक्ष्यों का सबसेट है, और इसलिए पहले से उपलब्ध कॉग्नेट मिथाइलट्रांसफरेज पूरी तरह से सुरक्षात्मक होना चाहिए।

हमारा प्रोटोकॉल कई निर्देशित विकास प्रोटोकॉल से कई मामलों में अलग है। ओपन रीडिंग फ्रेम विविधता प्रयोग की शुरुआत में एक बार उत्पन्न होती है, हर पुनरावृत्ति में नहीं। इसके अलावा, यह ईपी-पीसीआर के बजाय स्प्लिट-एंड-मिक्स संश्लेषण द्वारा बनाया गया है। कोडन के एनएनएस प्रतिस्थापन के लिए, जैसा कि इस काम में उपयोग किया जाता है, छह पदों के लिए (4 x 4 x 2)6 ~ 1.07 x 109 संयोजन हैं। इसलिए, कोई भी संस्करण ईएससी के 1.7 फ़ोमोल में औसतन एक बार मौजूद होता है। इस क्षमता को 20 ट्रिन्यूक्लियोटाइड अग्रदूतों के मिश्रण के साथ संश्लेषण का उपयोग करके सात पदों पर बढ़ाया जा सकता है जो ग्लेन रिसर्च द्वारा पेश किए जाते हैं या विभाजन और मिश्रण ओलिगोन्यूक्लियोटाइड संश्लेषण के साथ कम आशाजनक पदों में उत्परिवर्तन आवृत्ति को कम करके। यदि संभव हो, तो भिन्नता की सीमा को छह पदों तक सीमित करने की सिफारिश की जाती है। जाहिर है, इस तरह के म्यूटाजेनेसिस लक्ष्यीकरण के बारे में कुछ पहले से मौजूद ज्ञान की आवश्यकता है कम से कम सब्सट्रेट बाध्यकारी में शामिल REase के क्षेत्रों । विविधता पैदा करने के लिए स्प्लिट-एंड-मिक्स प्रोटोकॉल के ईपी-पीसीआर की तुलना में स्पष्ट फायदे हैं । ईपी-पीसीआर का उपयोग करके, हमने एक ही ईपी-पीसीआर(टेबल 4)में एनएलआईवी ईएससी के लिए आठ प्रतिस्थापन ले जाने वाले अपरिवर्तित वेरिएंट और दृश्यों को प्राप्त किया। ईपी-पीसीआर से पुस्तकालय क्लोन का एक पर्याप्त अंश है कि से बचा जाना चाहिए (जंगली प्रकार के दृश्यों, कई प्रतिस्थापन, फ्रेमशिफ्ट और बकवास उत्परिवर्तन, और स्थानों में उत्परिवर्तन अनुक्रम विशिष्टता को प्रभावित करने की संभावना नहीं है) ।

हमारा प्रोटोकॉल दो अनुक्रमिक चयन चरणों की उपस्थिति से कई अन्य निर्देशित विकास प्रोटोकॉल से भी अलग है। सकारात्मक चयन यह सुनिश्चित करता है कि वांछित गतिविधि को बनाए रखा जाए, अन्यथा बायोटिन टैग को हटाया नहीं जाता है, और कोडिंग अनुक्रम को पुल-डाउन द्वारा हटाया जा सकता है। यह तकनीकी रूप से संभव है कि एक उपन्यास का आकस्मिक उद्भव, गैर-ओवरलैपिंग विशिष्टता (उदाहरण के लिए, GCATGC) बायोटिन टैग को भी तोड़ने का कारण बन सकता है, यदि एक उपयुक्त दरार साइट वांछित दरार के पास मौजूद है, लेकिन कहीं और नहीं। हालांकि, यह बहुत संभावना नहीं होनी चाहिए । नकारात्मक चयन खुले पढ़ने के फ्रेम को हटा देता है जो एंजाइमों के लिए कोड करते हैं जिनमें अभी भी अवांछित गतिविधि है। यह कदम कड़ाई से अनिवार्य नहीं है, क्योंकि प्रोटोकॉल अभी भी उन वेरिएंट के साथ आउटपुट लाइब्रेरी को समृद्ध करेगा जो चयन अनुक्रम को क्लीव करने में सक्षम हैं, लेकिन ईएससी में कहीं और क्लीव करने में सक्षम नहीं हैं, इसलिए इसे पीसीआर प्रवर्धन के लिए अनुपयुक्त प्रदान करते हैं। हालांकि, चयन प्रभावशीलता कम होने की उम्मीद है क्योंकि मूल अनुक्रम विशिष्टता वाले एंजाइमों को आउटपुट से नहीं हटाया जाएगा और वे परिवर्तित विशिष्टता के साथ आशाजनक वेरिएंट से आगे निकल जाएंगे लेकिन एंजाइमीय गतिविधि में भी कमी आएगी। ध्यान दें कि जनसंख्या के स्तर पर, वांछित और अवांछित लक्ष्य दृश्य ों दोनों कर सकते हैं, लेकिन होने की जरूरत नहीं है, पतित । NlaIV उदाहरण में, विरोधी लक्ष्य पतित और लक्ष्य गैर पतित था । यहां तक कि जब जनसंख्या के स्तर पर अपक्षय ी होती है, तो एक बूंद में केवल एक (गैर-पतित) लक्ष्य या विरोधी लक्ष्य मौजूद होता है। हमारे प्रोटोकॉल में, लक्ष्य और विरोधी लक्ष्य दृश्यों चयन कदम की हर पुनरावृत्ति पर फिर से शुरू कर रहे हैं । इसलिए, एक खुले पढ़ने के फ्रेम को सभी संभावित लक्ष्यों को छोड़ने में सक्षम एंजाइम को एन्कोड करना चाहिए, और कई चयन दौरों से बचने के लिए किसी भी विरोधी लक्ष्य को क्लीव करने में असमर्थ होना चाहिए। ध्यान दें कि प्रोटोकॉल के प्रत्येक पुनरावृत्ति पर एंटीसेलेक्शन लक्ष्य को फिर से शुरू करने की आवश्यकता दो अनुक्रमिक पीसीआरएस को लागू करती है। पहली पीसीआर एक प्राइमर का उपयोग करती है जो एंटी-टारगेट के बाहर एनियल्स करता है, ताकि एंटी-टारगेट का क्लीवेज पीसीआर रिएक्शन को रोकता है । दूसरी पीसीआर को एक प्राइमर की आवश्यकता होती है जो विरोधी लक्ष्य से परे पहुंचता है, और विरोधी लक्ष्य को फिर से पेश करता है, यह सुनिश्चित करने के लिए कि चयन के कई दौरों के दौरान, प्रत्येक ओपन रीडिंग फ्रेम का परीक्षण एंटी-टारगेट के सभी वेरिएंट के खिलाफ किया जाता है।

चिपचिपा सिरों उत्पन्न करने वाले एंजाइमों के लिए, REase ORF10 के अलगाव के लिए पहले वर्णित विधि के आधार पर एक संबंधित वैकल्पिक प्रोटोकॉल का उपयोग किया जा सकता है। हमारे प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले बायोटिन कैप्चर द्वारा निष्क्रिय वेरिएंट की कमी को वैकल्पिक प्रोटोकॉल में एक अनुक्रम के साथ संगत एडाप्टर के लिगेशन द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है जिसे चयनात्मक पीसीआर(चित्र 9)में प्राइमर बाध्यकारी साइट के रूप में उपयोग किया जाता है। केवल ईएससी जो चयनित विशिष्टता के साथ एंजाइमों का उत्पादन करते हैं, लिगेशन-सक्षम सिरों को उत्पन्न करते हैं और इसलिए इसका चयन किया जाएगा। काउंटर एचुनिंदा अनुक्रम के चिपचिपा अंत के अनुक्रम को इस तरह से डिजाइन किया जाना चाहिए कि यह एडाप्टर के साथ लिगेशन में भाग नहीं ले सकता है। चयन प्रक्रिया का पुनरावृत्ति दो अलग-अलग एडाप्टर के बीच स्विच करके आसानी से हासिल किया जा सकता है और इसके परिणामस्वरूप चयनात्मक पीसीआर में दो अलग-अलग रिवर्स प्राइमर।

नए प्रोटोकॉल के साथ भी, विट्रो में इंजीनियरिंग उपन्यास विशिष्टताओं का कार्य अभी भी बहुत चुनौतीपूर्ण है। विशिष्ट प्रकार II REases के लिए, अनुक्रम विशिष्टता और एंडॉन्यूक्लियोलिटिक गतिविधि एक ही प्रोटीन क्षेत्रों पर निर्भर करती है। इसलिए दूसरे को प्रभावित किए बिना एक को बदलना मुश्किल है । सफलता एक रणनीति है कि खाते में एंजाइम के पदचिह्न लेता है द्वारा और अधिक होने की संभावना है, प्रोटीन-डीएनए बातचीत की समरूपता का संमान करता है, और पहले से मौजूद एंजाइमैटिक वरीयताओं पर बनाता है, जो जैव रासायनिक प्रयोगों में अग्रिम निर्धारित किया जाना चाहिए, के रूप में NlaIV उदाहरण8के लिए किया गया था ।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

पोलिश नेशनल साइंस सेंटर (यूएमओ-2011/02/ए/एनजेड1/00052) से विज्ञान एवं उच्च शिक्षा मंत्रालय (0295/बी/पीओ1/2008/34 से एमबी और एन301 100 31/3043 से केएस तक) से अनुदान ों का समर्थन किया गया। UMO-2014/13/B/NZ1/03991 और UMO-2014/14/M/NZ5/00558 से एमबी) और अल्पकालिक EMBO फैलोशिप द्वारा केएस (ATSF 277.00-05) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1000Å CPG Support (dA, dT, dC, dG) Biosset 45-1000-050 Other vendors can be used as well
ASM-800 DNA/RNA Biosset 800-001-000
GeneJET Gel Extraction Kit Thermo Scientific K0691 Any other kit can be used
Glen-Pak DNA purification cartridge Glen Research 60-5200
HIS-Select Nickel Affinity Gel Sigma P6611
pET 28a vector Any other vector with T7 promoter upstream of plycloning site can be used instead
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Thermo Scientific F530S Any other high fidelity and highly processive thermophilic polymearse can be used instead
Porous steel foil Biosset 40-063
Rapid Translation System
RTS 100, E.coli HY Kit
Roche 3 186 148
Restriction endonucleases Thermo Scientific Obviously other vendors, enzymes can be used
Streptavidin Magnetic Beads New England Biolabs S1420S Other vendors can be used as well. We have positively tested beds form Sigma
Synthesis chemicals including phosphoramidities Carl Roth Other vendors can be used as well
Synthesis columns (different sizes) Biosset
T4 DNA ligase Thermo Scientific EL0011 Any other ligase can be used

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References

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