In Vitro Instrueret Udviklingen af en begrænsning Endonuclease med strengere specificitet

Vores protokol giver mulighed for oprettelse af restriktionsenzymer med ændrede, strengere sekvensspecifikiteter ved hjælp af in vitro-opdeling og en unik udvælgelsesstrategi i styret evolution. Potentielt er det helt universelt, da det bør gælde for enhver begrænsning endonuclease og udvælgelse kan rettes mod en strengere version af en original cognate sekvens. Hvis nyoprettede varianter udtrykkes ved in vitro-transskriptionsoversættelse, er protokollen egnet ikke blot til at indsnævre specificiteten, men også til at ændre specificiteten.

For at afgøre steder for undermæt mutagenesis, skal du vælge mutagenese frekvenser i henhold til den hypotetiske betydning af de steder, holde grænser for den samlede bibliotek kompleksitet i tankerne. For at begynde syntesen skal du indsætte kolonner, der er pakket med ny harpiks i synthesizeren. Syntetisere oligonukleotrider i alle kolonner op til triplet, umiddelbart før den anden subsaturation mutagenesis site tælle fra de tre-prime ende.

Syntetisere, forlader en fem-prime trityl gruppe i slutningen. Den beskyttende gruppe vil blive fjernet i begyndelsen af den næste syntesecyklus. Åbn syntesøjerne og centrifugeres kortvarigt i tørre 1,5 milliliterrør for at opsamle harpiksen.

Træk CPG syntese støtte og bland ved vortexing. Geninddeler den blandede CPG-harpiks i nye syntesekolonner. Undgå at indføre fugtighed, fordi det vil reducere det samlede udbytte.

Fortsæt syntesen, startende fra subsaturation mutagenesis site triplet. Tildel kolonner til randomiserede NNS trillinger eller wild-type trillinger i henhold til den ønskede mutagenese frekvens. Hvis der findes yderligere underordnede steder, skal du kun gå videre til den tredobbelte, der går forud for det næste undermætnings mutagenesested.

Hvis der ikke er flere underordnede steder til stede nedstrøms, skal du færdiggøre syntesen og efterlade en fem-prime tritylgruppe i slutningen. Brug brede borepipettespidser til at forberede en olie overfladeaktiv blanding ved at tilsætte 225 mikroliter Span 80 og 25 mikroliter Tween 80 til fem milliliter mineralsk olie i et 15 milliliter konisk rør. Bland grundigt ved blid inversion 15 gange.

Blandingen på dette trin skal være gennemskinnelig. For hvert bibliotek overføres 950 mikroliter af blandingen af olieoveraktivt stof til et to milliliter rundtyogent hætteglas. Etiket med et biblioteksnavn og overfør til is.

Sæt en lille cylindrisk omrøring bar i hvert hætteglas. Forbered en in vitro transskription-oversættelse reaktion blanding i henhold til producentens forslag. Tillæg blandingen med magnesiumchlorid til en endelig koncentration på 1,5 millimolar.

Dispenseres 50 mikroliter aliquots af reaktionsblandingen i 1,5 milliliter rør på is. Der tilsættes 1,7 femtomoleer i biblioteket til reaktionsblandingen på is. Forbered vand-i-olie emulsion fortløbende for hvert bibliotek ved først at placere et lille bæger fyldt med is på en magnetisk omrører med omrøringshastigheden indstillet til 1150 omdr./min.

Overfør derefter et kryogent hætteglas med 950 mikroliter olie overfladeaktivt blanding og en lille omrøringsstang til et iskoldt bægerglas på den magnetiske omrører. Kontroller, at omrøringsbjælken drejer rundt. Tilføj fem 10-mikroliter aliquots af in vitro bibliotek transskription-oversættelse blanding over en to-minutters periode i 30 sekunder intervaller og fortsætte omrøring i et ekstra minut.

Hætteglasset overføres med emulsionen til en isbeholder. På dette tidspunkt skal væsken være uigennemsigtig, ikke gennemsigtig. Fortsæt derefter med det næste bibliotek.

Når alle bibliotekerne er behandlet, skal du starte inkubationen af alle bibliotekerne i henhold til kitproducentens anbefalinger. Hætteglassene overføres til den temperatur, der er optimal for den konstruerede endonuclease, i yderligere to timer, før de anbringes på is i mindst 10 minutter. Emulsioner fra kryogene hætteglas i 1,5 milliliterrør.

Tilføj en mikroliter af 5 molar EDTA. Og centrifuge dem ved 13,000 gange g i fem minutter ved stuetemperatur. Hvis der efter centrifugering ikke kan se vand-olie interface klart, fryse blandingen før aspiration af den øvre oliefase.

Bevæg den øvre oliefase med en pipette og kassér den. Udfør straks ekstraktion ved at tilsætte 150 mikroliter fenolchloroform og 100 mikroliter af 10 millimolar Tris-HCl til den vandige fase. Vortex og derefter udføre fase adskillelse via 30-sekunders centrifugering på 13,000 gange g.

Saml den øvre vandige fase. Udfældes DNA’et ved at tilsætte 15 mikroliter tre-molar natriumacetat, 2,5 til fem mikrogram glykogen og 375 mikroliter ethanol. Efter inkubering prøverne ved minus-20 grader Celsius i en time, centrifuge i 15 minutter ved 13, 000 gange g, fire grader Celsius.

Kassér supernatanten og vask kort pellet med en milliliter kold 70% ethanol. Dna-glykogenpellet tørres i en hastighedsvac eller lufttørrer i mere end fem minutter. Derefter opløses pellet i 50 mikroliter af 10 millimolar Tris-HCl.

Dernæst tilsættes fem mikroliter af streptavidin magnetiske perler, udarbejdet i henhold til producentens anvisninger. Bland i en time ved stuetemperatur, helst i en karruselblander eller ved blid vortexing. Overfør rørene til en magnetisk stander for at adskille perlerne.

Derefter indsamles væsken beriget i DNA uden biotin. Denne protokol er et værktøj til at øge hyppigheden af ønskede varianter af manipuleret begrænsning endonucleases ved at nedbryde inaktive enzymer og endonucleases med uændret wild-type sekvens specificitet. Vellykket screening kan identificere op til 20% af lovende varianter.

Varianter er mærket som lovende varianter, hvis de producerer en spaltning mønster adskiller sig fra wild-type enzym. Varianter, der kan have ændret sekvenspræferencen, er også mærket. Vist her er en mislykket screening med størstedelen af varians inaktiv og en variant med tilsyneladende uændret spaltning mønster.

I dette tilfælde er bibliotekerne sandsynligvis domineret af inaktive varianter, der undslap streptavidin capture valg trin. Det er afgørende omhyggeligt at designe de udvalgte og kontraud valgte sekvenser og begrænse biblioteksdiversiteten efter mutagenesestrategi, der genererer udskiftninger på få udvalgte stillinger. De bedste udvalgte varianter skal karakteriseres grundigt for binding og spaltning kinetik på foretrukne og ikke kløvet sekvenser baseret på resultaterne fra den indledende screening.

I vores prøvetilfælde blev mutagenese steder udvalgt baseret på en homologi model. Overraskende nok viste en krystalstruktur senere, at nogle ændrede rester sandsynligvis ikke er i direkte kontakt med DNA.