Stabiler Knockdown von Genen, die extrazelluläre Matrixproteine in der C2C12 Myoblast-Zelllinie mit Small-Hairpin (sh)RNA kodieren

Genetics

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Summary

Wir bieten ein Protokoll, um Gene, die extrazelluläre Matrixproteine (ECM) in C2C12-Myoblasten kodieren, mit Small-Hairpin (sh) RNA zu fallig zu senken. Als Beispiel für ADAMTSL2 beschreiben wir die Methoden zur Validierung der Knockdown-Effizienz auf mRNA-, Protein- und Zellebene während der Myotube-Differenzierung von C2C12.

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Taye, N., Stanley, S., Hubmacher, D. Stable Knockdown of Genes Encoding Extracellular Matrix Proteins in the C2C12 Myoblast Cell Line Using Small-Hairpin (sh)RNA. J. Vis. Exp. (156), e60824, doi:10.3791/60824 (2020).

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Abstract

Extrazelluläre Matrixproteine (ECM) sind entscheidend für die Entwicklung von Skelettmuskeln und Homöostase. Der stabile Knockdown von Genen, die für ECM-Proteine in C2C12-Myoblasten kodieren, kann angewendet werden, um die Rolle dieser Proteine bei der Entwicklung der Skelettmuskeln zu untersuchen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erschöpfung des ECM-Proteins ADAMTSL2 als Beispiel, indem man small-hairpin (sh) RNA in C2C12-Zellen verwendet. Nach der Transfektion von shRNA-Plasmiden wurden stabile Zellen mit Puromycin chargenausgewählt. Wir beschreiben weiter die Aufrechterhaltung dieser Zelllinien und die phänotypische Analyse mittels mRNA-Expression, Proteinexpression und C2C12-Differenzierung. Die Vorteile der Methode sind die relativ schnelle Erzeugung stabiler C2C12-Knockdown-Zellen und die zuverlässige Differenzierung von C2C12-Zellen in mehrkernige Myotuben bei Erschöpfung des Serums im Zellkulturmedium. Die Differenzierung von C2C12-Zellen kann durch Hellfeldmikroskopie und durch Messung der Expressionskonzentrationen kanonischer Markergene wie MyoD, Myogenin oder Myosin-Schwere Kette (MyHC) überwacht werden, was auf das Fortschreiten der C2C12-Myoblastendifferenzierung in Myoröhren hinweist. Im Gegensatz zum vorübergehenden Knockdown von Genen mit small-interfering (si) RNA können Gene, die später bei der C2C12-Differenzierung oder während der Myotube-Reifung exprimiert werden, effizienter gezielter werden, indem C2C12-Zellen erzeugt werden, die shRNA stabil exprimieren. Einschränkungen der Methode sind eine Variabilität der Knockdown-Effizienz, abhängig von der spezifischen shRNA, die durch die Verwendung von Gen-Knockout-Strategien auf der Grundlage von CRISPR/Cas9 überwunden werden kann, sowie potenziellen Off-Target-Effekten der shRNA, die in Betracht gezogen werden sollten.

Introduction

Extrazelluläre Matrixproteine (ECM) unterstützen strukturell alle Gewebe, vermitteln die Zell-Zell-Kommunikation und bestimmen das Zellschicksal. Die Bildung und dynamische Umgestaltung des ECM ist daher entscheidend für die Erhaltung der Gewebe- und Organhomöostase1,2. Pathologische Varianten in mehreren Genen, die für ECM-Proteine kodieren, führen zu Muskel-Skelett-Erkrankungen mit Phänotypen, die von Muskeldystrophien bis zum pseudomouscularen Aufbau3,4reichen. Zum Beispiel verursachen pathogene Varianten in ADAMTSL2 die extrem seltene Muskel-Skelett-Störung geleophysische Dysplasie, die mit pseudomuskulärem Aufbau, d.h. einer scheinbaren Zunahme der Skelettmuskelmasse5. Zusammen mit Genexpressionsdaten bei Maus und Menschen deutet dies auf eine Rolle für ADAMTSL2 bei der Entwicklung von Skelettmuskeln oder der Homöostase6,7hin.

Das Protokoll, das wir hier beschreiben, wurde entwickelt, um den Mechanismus zu untersuchen, mit dem ADAMTSL2 die Entwicklung von Skelettmuskeln und/oder Homöostase in einer Zellkulturumgebung moduliert. Wir schlugen ADAMTSL2 in der murinen C2C12 Myoblast-Zelllinie stabil nieder. C2C12 Myoblaste und ihre Differenzierung in Myotuben ist ein gut beschriebenes und weit verbreitetes Zellkulturmodell für Skelettmuskeldifferenzierung und Skelettmuskelbioengineering8,9. C2C12-Zellen durchlaufen nach serumerumerentzug unterschiedliche Differenzierungsschritte, was zur Bildung von mehrnukleierten Myoröhren nach 3 bis 10 Tagen in der Kultur führt. Diese Differenzierungsschritte können zuverlässig überwacht werden, indem mRNA-Spiegel verschiedener Markergene wie MyoD, Myogenin oder Myosin schwere Kette (MyHC) gemessen werden. Ein Vorteil der Erzeugung stabiler Genknockdowns in C2C12-Zellen besteht darin, dass Gene, die in späteren Stadien der C2C12-Differenzierung exprimiert werden, effizienter ins Visier genommen werden können, verglichen mit einem vorübergehenden Knockdown, der durch klein störende (si) RNA erreicht wird, die in der Regel 5 bis 7 Tage nach der Transfektion dauert und von der Transfektionseffizienz beeinflusst wird. Ein zweiter Vorteil des hier beschriebenen Protokolls ist die relativ schnelle Generierung von Chargen von C2C12-Knockdown-Zellen mit Puromycin-Auswahl. Alternativen wie CRISPR/Cas9-vermittelter Genknockout oder die Isolierung von primären Skelettmuskelzellvorläufern von Mäusen mit menschlichem oder Zielgenmangel sind technisch schwieriger oder erfordern die Verfügbarkeit von Patientenmuskelbiopsien bzw. Zielgen-Mangelmäusen. Ähnlich wie bei anderen zellkulturbasierten Ansätzen gibt es jedoch Einschränkungen bei der Verwendung von C2C12-Zellen als Modell für die Differenzierung von Skelettmuskelzellen, wie die zweidimensionale (2D) Natur des Zellkultur-Setups und das Fehlen der in vivo Mikroumgebung, die entscheidend ist, um undifferenzierte Skelettmuskelvorläuferzellen10zu erhalten.

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Protocol

1. Vorbereitung der shRNA Plasmid DNA von Escherichia coli

  1. Erzeugung klonaler Bakterienkolonien, die die shRNA-Plasmide tragen
    1. Erhalten Sie Glyzerinvorräte von E. coli, die zielspezifische shRNA-Plasmide und ein Kontrollplasmid aus kommerziellen Quellen tragen (Materialtabelle).
      HINWEIS: Es wurden drei verschiedene shRNA-Plasmide verwendet, die auf verschiedene Regionen der murinen Adamtsl2 mRNA abzielen. Eine shRNA wurde ausgewählt, um die 3'-unübersetzte Region (3'UTR) von Adamtsl2 zu zielen, um Rettungsexperimente mit Expressionsplasmiden zu erleichtern, die rekombinante ADAMTSL2- oder einzelne ADAMTSL2-Proteindomänen kodieren. Darüber hinaus wurde ein rühriges shRNA-Plasmid als Negativkontrolle aufgenommen. Einzelheiten zu den shRNA-Sequenzen sind in Abbildung 1Aangegeben.
    2. Den shRNA-Bakterienglycerinbestand bei Raumtemperatur (RT) auftauen. Übertragen Sie 10 l bakterielleglyzerin-Bestände auf eine Luria-Bertani (LB) Agarplatte, ergänzt durch 100 g/ml Ampicillin (LB-Amp).
      HINWEIS: LB-Amp Platten werden durch Autoklavieren von 1 L LB Medium (für 1 L: 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCl, pH auf 7,0) zusammen mit 12 g Agar hergestellt. Lassen Sie das Medium auf 50 °C abkühlen und Ampicillin (Lagerlösung: 50 mg/ml in sterilem Wasser) zu einer Endkonzentration von g/ml (LB-Amp-Agar) hinzufügen. 20 ml LB-Amp-Agar sofort in eine 10 cm Petrischale geben und den Agar vor Gebrauch erstarren lassen. 1 L LB-Amp Agar ist in der Regel ausreichend, um etwa 40 10 cm Petrischalen zu gießen. Petrischalen, die LB-Amp-Agar enthalten, sind mindestens einen Monat stabil, wenn sie bei 4 °C im Dunkeln versiegelt gelagert werden.
    3. Verbreiten Sie Bakterien mit sterilen Drygalski Spachtel oder jede andere geeignete Methode, um einzelne Bakterienkolonien zu erreichen. Bakterienplatten über Nacht bei 37 °C auf den Kopf stellen.
  2. Plasmid-Präparation
    1. Am nächsten Morgen entfernen Sie die Petrischale mit den einzelnen Bakterienkolonien und lagern Sie bei 4 °C, um ein Überwuchern der Bakterienkolonien und die Bildung von Satellitenkolonien zu vermeiden. Versiegeln Sie die Petrischale, wenn sie über Nacht oder länger gelagert wird.
    2. Am Nachmittag 5 ml LB-Amp Medium in ein Polypropylen-Bakterienkulturrohr geben. Wählen Sie eine einzelne Bakterienkolonie aus der Übernacht mit einer Pipette-Spitze kultivierten Petrischale und impfen Sie LB-Amp-Medium, indem Sie die Pipettenspitze in das Bakterienkulturrohr auswerfen, das das LB-Amp-Medium enthält.
    3. Inkubieren Sie die Bakterienkultur über Nacht in einem Shaker bei 250 Umdrehungen pro Minute bei 37 °C mit lose anbringendem Deckel, um die Belüftung zu ermöglichen.
    4. Nehmen Sie am nächsten Morgen eine bakterielle Kulturröhre heraus und halten Sie sie bei 4 °C, um bakterielles Überwuchern zu vermeiden. Am Nachmittag bakterien durch Wirbeln wieder aussetzen und 1 ml der nächtlichen Bakterienkultur in 50 ml LB-Amp-Medium in einem 250 ml Kegelkolben übertragen. Über Nacht in einem Shaker bei 250 Umdrehungen pro Minute bei 37 °C inkubieren.
    5. Am nächsten Morgen Bakterien in ein 50 ml Einwegzentrifugenrohr und Zentrifugenbakterien bei 6.000 x g bei RT für 15 min übertragen. Entfernen Sie das Medium und fahren Sie mit Schritt 1.2.6 fort.
      HINWEIS: Wenn Plasmid-DNA nicht sofort isoliert werden kann, entfernen Sie das LB-Amp-Medium nach dem Zentrifugationsschritt und lagern Sie das Bakterienpellet bei -20 °C.
    6. Befolgen Sie die Anweisungen für Plasmid-Vorbereitungkit (Midi-Skala), um die Plasmid-DNA aus den Bakterien zu extrahieren. Bewerten Sie die DNA-Qualität von Plasmiden, indem Sie das Verhältnis A260/A280 mit einem Spektralphotometer messen.
      HINWEIS: Ein A260/A280 Verhältnis von >1.8 ist wünschenswert, was auf eine hohe Reinheit der Plasmid-DNA-Präparation hinweist. Ein niedrigeres A260/A280 Verhältnis deutet auf eine Kontamination mit Protein oder eine unzureichende Entfernung von Extraktionsreagenzien hin. Zusätzliche Plasmidreinigungsschritte können erforderlich sein.

2. Kulinatur und Transfektion von C2C12-Zellen und Puromycin-Auswahl

  1. C2C12-Zellkultur
    1. C2C12-Zellen(Materialtabelle) schnell in einem 37 °C-Wasserbad auftauen und Zellen in sterilen Einweg-15 ml Zentrifugenrohrgießen gießen, das 8 ml des modifizierten Eagle Mediums (DMEM) von Dulbecco enthält, ergänzt mit 100 Einheiten Penicillin- und Streptomycin-Antibiotika (serumfreies DMEM) in einer Zellkulturhaube. Zentrifugenzellen für 3 min bei 160 x g bei RT.
    2. Aspirieren Sie überstand und setzen Sie das Zellpellet in 10 ml serumfreiem DMEM, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) (komplettes DMEM) wieder auf. Übertragen Sie Zellen auf 10 cm Gewebekultur behandelt Kunststoffgeschirr. Inkubieren Sie Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C in einer 5%CO2-Atmosphäre.
    3. Ersetzen Sie am nächsten Tag das Medium durch frisches komplettes DMEM.
    4. Erweitern Sie die C2C12-Zellen mit niedriger Durchgang auf 3 x 4 10 cm Großen Unden. Wenn die C2C12-Zellen einen Zusammenfluss von 50 bis 60 % erreichen, aspirieren Sie das Medium und spülen C2C12-Zellen mit 10 ml Phosphat-gepufferter Saline (PBS).
    5. Fügen Sie 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA hinzu und brüten 2 min bei RT. Überwachen Sie die Zellablösung unter dem Mikroskop und verlängern Sie bei Bedarf die Inkubationszeit, bis die meisten Zellen getrennt sind.
      HINWEIS: Sorgfältiges Tippen auf die Schale kann helfen, die Zellen zu vertreiben.
    6. Wenn die meisten Zellen abgetrennt sind, fügen Sie der Schale 10 ml komplettes DMEM hinzu, pipetteieren Sie das Volumen mehrmals nach oben und unten und übertragen Sie die Zellsuspension in ein steriles Einweg-Zentrifugenrohr von 15 ml. Zentrifugenzellen für 3 min bei 160 x g bei RT. Abstandaden aspirieren und das Zellpellet in 2 ml Gefriermedium (10% Dimethylsulfoxid [DMSO]/90% FBS) wieder aufsetzen.
    7. Zwei 1 ml Aliquots pro 10 cm Schale in Kryovials übertragen. In einem mit RT Isopropanol gefüllten Zellgefrierbehälter für mindestens 24 h in einem Gefrierschrank von -80 °C inkubieren, was zu einer Gefrierrate von etwa -1 °C pro Min führt, um die Bildung von Eiskristallen zu vermeiden. Speichern Sie Zellen für den langfristigen Einsatz in der Dampfphase von flüssigem Stickstoff.
      HINWEIS: Der Hersteller empfiehlt die Verwendung von C2C12-Zellen bis zu Durchgangsnummer 15. Die Erfahrungen der Autoren zeigten auch, dass zellender niedrigerer Durchgangszahl eine konsistentere und schnellere Differenzierung in Myotuben aufwiesen. Es ist wichtig, C2C12-Zellen bei geringer Zelldichte (<50% Zusammenfluss) zu erhalten, um einen vorzeitigen Beginn der Differenzierung zu vermeiden. Differenzierende oder differenzierte C2C12-Zellen können nicht in den ursprünglichen Myoblast-Zustand zurückgesetzt werden und müssen verworfen werden.
  2. Vorbereitung von C2C12-Zellen für die Transfektion
    1. Kultur undifferenzierte C2C12-Zellen in einer 10 cm Schale, bis sie 50 bis 60% Zusammenfluss erreichen. Saugen Sie das Medium, spülen C2C12-Zellen mit 10 ml PBS, und fügen Sie 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA hinzu. 2 min bei RT inkubieren, die Zellablösung unter dem Mikroskop überwachen und bei Bedarf die Inkubationszeit verlängern, bis die meisten Zellen getrennt sind.
      HINWEIS: Sorgfältiges Tippen auf die Schale kann helfen, die Zellen zu vertreiben.
    2. Wenn die meisten Zellen abgetrennt sind, fügen Sie der Schale 10 ml komplettes DMEM hinzu und übertragen Sie die Zellsuspension in ein steriles Einweg-Zentrifugenrohr von 15 ml. Zentrifugenzellen für 3 min bei 160 x g bei RT. Abstandaum aspirieren und das Zellpellet in 4 ml komplettem DMEM wieder aufsetzen.
    3. Kombinieren Sie 10 l Zellsuspension mit 10 l Trypan-Blau in einem 1,5 ml Reaktionsrohr, mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten und sorgfältig das Reaktionsrohr, und übertragen Sie Zellen zu einem Zählschlitten. Bestimmen Sie die Zellennummer/ml mithilfe eines automatisierten Zellenzählers.
    4. Verdünnen Sie C2C12-Zellen auf 50.000 Zellen/ml und säen Sie 100.000 Zellen (2 ml) pro Brunnen in einer 6-Well-Platte, um nach einer nächtlichen Inkubation einen Zusammenfluss von ca. 40 bis 50 % zu erreichen. Inkubieren Sie Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C in einer 5%CO2-Atmosphäre.
  3. Transfektion von C2C12-Zellen mit dem shRNA-Plasmid mit Polyethylenimin (PEI) und Puromycin-Auswahl
    1. Vorbereitung der PEI-Lagerlösung
      1. 16 mg PEI in 50 ml sterilem destilliertem Wasser (Konzentration der Stammlösung: 0,32 mg/ml) in einer 50 ml Glasmedienflasche mit Schraubverschluss auflösen. Inkubieren Sie die Lösung bei 65 °C für 1 h und wirbeln Sie die Lösung während der Inkubationszeit mehrmals kräftig aus, um die PEI vollständig aufzulösen.
      2. Stellen Sie sich auf pH 8 ein, indem Sie 15 l von 1N HCl pro 50 ml hinzufügen.
        VORSICHT: HCl ist ätzend. Konzentriertes HCl sollte unter der Dunstabzugshaube behandelt werden. Die Ermittler sollten geeignete persönliche Schutzausrüstung tragen.
      3. Die PEI-Lösung bei -80 °C für 1 h mit einem locker befestigten Deckel einfrieren und bei 37 °C in einem Wasserbad schnell auftauen, um die Löslichkeit weiter zu verbessern. Wiederholen Sie den Freeze-Thaw-Zyklus 3x.
      4. Pei-Lagerlösung in 0,5 ml Aliquots für den einmaligen Einsatz bei -20 °C lagern.
    2. Transfektion von C2C12-Zellen
      1. Kombinieren Sie 25,5 l (8,5 l/g Plasmid-DNA) der PEI-Stammlösung mit 100 l von 25 mM NaCl in einem 1,5 ml Reaktionsröhrchen und inkubieren Sie 5 min bei 37 °C. Kombinieren Sie 3 g der Plasmid-DNA mit 100 l von 25 mM NaCl und inkubieren Sie für 5 min bei 37 °C.
      2. Kombinieren Sie das gesamte Volumen des verdünnten PEI-Reagenz mit dem verdünnten Plasmid und mischen Sie, indem Sie sanft nach oben und unten pipetieren. 25 min bei 37 °C inkubieren.
      3. Ändern Sie während der Inkubationszeit das Medium der C2C12-Zellen, die für die Transfektion in DMEM ohne FBS oder Antibiotika bestimmt sind.
      4. Fügen Sie die PEI/DNA-Transfektionsmischung zu C2C12-Zellen Tropfen für Tropfen hinzu und mischen Sie sie ständig, indem Sie die Zellkulturschale vorsichtig verschieben. Inkubationszentrum in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C in einer 5%igenCO2-Atmosphäre. Nach 6 h das Medium in DMEM umstellen.
    3. Puromycin-Auswahl
      1. 24 h nach der Transfektion, Schalten Medium auf Auswahlmedium (komplettes DMEM plus 5 g/ml Puromycin). Setzen Sie die Puromycin-Auswahl fort, bis Puromycin-resistente C2C12-Zellen erhalten sind, was in der Regel 10 bis 14 Tage dauert.
      2. Erweitern Sie puromycinresistente C2C12-Zellen bei geringer Zelldichte (<50-60%-Konfluence), d.h. um den undifferenzierten Zustand und die Kryokonservierung von 6-10 Durchstechflaschen für zukünftige Experimente beizubehalten, wie in den Schritten 2.1.4-2.1.7 beschrieben.
        ANMERKUNG: Bewahren Sie puromycinresistente C2C12-Zellen in Gegenwart von 5 g/ml Puromycin für die routinemäßige Zellkultur und -expansion auf. Puromycin wurde jedoch in den Differenzierungsexperimenten weggelassen.

3. Phänotypische Analyse der C2C12-Differenzierung

ANMERKUNG: Die nachstehend beschriebenen Methoden können leicht für die allgemeine phänotypische Analyse der Myoblastendifferenzierung c2C12 in Myotuben angepasst werden, indem die spezifischen Antikörper, die bei der westlichen Blotting verwendet werden, oder die in der quantitativen Polymerase verwendeten genspezifischen Primer variiert werden. Kettenreaktionsanalyse (qPCR).

  1. C2C12 Differenzierungsprotokoll und Hellfeldmikroskopie
    1. Samen 150.000 Zellen/gut in einer 12 Well Platte. Kultur puromycinresistente C2C12-stabile Zellen in einer 12-Well-Platte in Selektionsmedium in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C in einer 5%CO2-Atmosphäre. Kultur C2C12-Zellen in vollständiger DMEM, bis sie einen Zusammenfluss von 95 % erreichen.
    2. Um eine Differenzierung der C2C12-Zellen zu induzieren, ersetzen Sie vollständiges DMEM durch serumfreies DMEM (Tag 0 der Differenzierung). Wechseln Sie das Medium alle zwei Tage und folgen Sie der C2C12-Myotube-Formation mit einem invertierten Hellfeldmikroskop mit Kamera.
      HINWEIS: Viele Protokolle verwenden 2% Pferdeserum, um C2C12-Zellen in Myotuben zu differenzieren. In den Händen der Autoren hatte das entfernen des Serums einen ähnlichen Effekt. Insulin wird als Additiv zum Zellkulturmedium beschrieben, um die C2C12-Differenzierung zu beschleunigen. Im aktuellen Protokoll unterschieden sich C2C12-Zellen jedoch innerhalb von 3 bis 5 Tagen zuverlässig in Myotuben, nachdem Serumentzug und Insulinzusatz als unnötig erachtet wurden.
  2. Myosin schwere Kette (MyHC) Immunostaining zur Visualisierung von Myotuben
    1. Samen 50.000 puromycinresistente C2C12-Zellen pro Kammer in einem 8-Well-Kammer-Dia in 500 l komplettem DMEM. Kulturzellen, bis sie 95% Zusammenfluss in vollständiger DMEM erreichen (ca. 24 h).
    2. Um eine Differenzierung zu induzieren, wechseln Sie von der vollständigen DMEM auf 500 l serumfreies DMEM (Tag 0 der Differenzierung). Zum gewünschten Zeitpunkt(en) das Medium und spülen Zellen 3x mit 0,5 ml PBS.
      HINWEIS: Führen Sie alle folgenden Schritte bei RT aus.
    3. Fixzellen mit 0,2 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS für 15 min verdünnt. Spülen Sie Zellen mit 0,5 ml PBS 3x für je 5 min.
      VORSICHT: PFA ist gefährlich. Ergreifen Sie geeignete Vorsichtsmaßnahmen und entsorgen Sie Paraformaldehydlösung als gefährlichen Abfall.
    4. PfA mit 0,2 ml 0,5 m Glycin in PBS für 5 min. Spülen Sie Zellen mit 0,5 ml PBS 3x für je 5 min.
    5. Inkubieren Sie Zellen mit 0,2 ml 0,1% nichtionisches Tensid/Waschmittel (Materialtabelle) in PBS für 10 min, um die Zellmembran zu permeabilisieren. Block mit 0,2 ml 5% Rinderserumalbumin in PBS für 1 h. Spülzellen mit 0,5 ml PBS 3x für je 5 min.
    6. Inkubieren Sie Zellen mit 0,2 ml MyHC-Antikörper (1:200 in PBS) für 2 h. Spülen Sie Zellen mit 0,5 ml PBS 3x für je 5 min.
    7. Inkubationszellen mit 0,2 ml Ziegen-Anti-Maus-Rhodamin rotkonjugierter Sekundärantikörper (1:200 in PBS). Spülen Sie Zellen mit 0,5 ml PBS 3x für je 5 min.
    8. Nach dem Entfernen von PBS quantitativ, fügen Sie einen Tropfen Desontiermedium mit 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) pro Kammer. Abdeckungsrutsch- und Aushärtungsmedium gemäß den Anweisungen des Herstellers. Siegel mit Nagellack.
    9. Beobachten Sie C2C12-Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop mit dem entsprechenden Filtersatz.
  3. Bewertung der Knockdown-Effizienz durch quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR)
    1. Kultur C2C12-Zellen unter Differenzierungsbedingungen in 12 Brunnenplatten, wie in Abschnitt 3.1 beschrieben.
    2. Zum gewünschten Zeitpunkt(en) entfernen Sie das Differenzierungsmedium, spülen Sie die Zellen einmal mit 1 ml PBS ab und fügen Sie 0,5 ml RNA-Extraktionsreagenz (Tabelle der Materialien) pro Brunnen hinzu. Lyse die Zellen durch sorgfältiges Pipetieren nach oben und unten und übertragen Zelle Lysat in ein steriles 1,5 ml Reaktionsrohr. Isolieren Sie die RNA, indem Sie das Protokoll des Herstellers sorgfältig befolgen.
      VORSICHT: Das RNA-Extraktionsreagenz enthält Phenol. Es sollte unter einer Dunstabzugshaube verwendet werden. Sammeln Sie die RNA-Extraktionsreagenzabfälle und entsorgen Sie sie als sonderstofflichen Abfall. Die Ermittler sollten geeignete persönliche Schutzausrüstung tragen.
    3. Lösen Sie das endgültige RNA-Pellet in 20 l Diethylpyrocarbonat (DEPC)-behandeltem Wasser auf. Bestimmen Sie die Quantität und Qualität der RNA-Zubereitung mit einem Spektralphotometer und bestimmen Sie das Verhältnis A260/A280 als Qualitätsmaß.
      ANMERKUNG: Eine typische Ausbeute von 1 Bohrgut einer 12-Well-Platte beträgt 5 x 7 g Gesamt-RNA mit einem A260/A280-Verhältnis von 1,8 x 2.
    4. Um die mitgereinigte genomische DNA zu verdauen, verdünnen Sie 1 g RNA in einem Gesamtvolumen von 8 l DEPC-behandeltem Wasser in einer PCR-Röhre. Fügen Sie 1 l 10x Reaktionspuffer und 1 l DNase I (1 Einheit/L)(Materialtabelle)hinzu und 15 min bei RT inkubieren. 1 L Stopplösung (25 mM EDTA) hinzufügen und bei 70 °C 10 min inkubieren.
    5. Um cDNA zu erzeugen, kombinieren Sie 10 l DNase-behandelte RNA mit 10 l 2x Reverse-Transkriptase-Master-Mix, der die Reverse-Transkriptase, zufällige Primer, 4 mM dNTP-Mix (je 1 mM dATP, dTTP, dGTP und dCTP) und reverse transcriptase reaction buffer enthält. Inkubieren Sie die Reaktion in einem Thermocycler mit dem Programm, wie vom Hersteller empfohlen. CDNA mit Wasser im Verhältnis 1:5 verdünnen.
    6. Zur Vorbereitung der qRT-PCR-Reaktion können Sie 5 l SYBR-grünqPCR-Master-Mix mit 0,5 l genspezifischen Vorwärts- und Reverse-Primern (Bestand: 10 m) bzw. 2 l DEPC-behandeltem Wasser pro Reaktion kombinieren. Pipette qPCR-Reaktion in einem Brunnen einer 96-Well-qRT-PCR-Platte und fügen Sie 2 l verdünnte cDNA hinzu. Richten Sie drei technische Replikationen für jede biologische Replikation ein und enthalten ein Housekeeping-Gen wie Gapdh oder Hprt1.
    7. Verstärken Sie das PCR-Produkt mit einem qRT-PCR-Thermocycler mit folgendem Programm: 50 °C für 2 min (Uracil-DNA Glycosylase [UDG] Aktivierung), 95 °C für 2 min (Dual-Lock-DNA-Polymerase-Aktivierung), 40 Zyklen von 95 °C für 15 s, 60 °C für 30 s und 72 °C für 1 min.
    8. Quantifizieren Sie qRT-PCR-Ergebnisse mit der DDCt-Methode, die auf ein Housekeeping-Gen normalisiert wird, z. B. Gapdh oder Hprt1.
  4. Bewertung der Knockdown-Effizienz durch Western Blotting
    1. Samen 300.000 Puromycin-resistente C2C12-Zellen pro Brunnen in einer 6-Well-Platte für die Western-Blot-Analyse. Nach 24 h das medium in serumfreie DMEM wechseln, um eine Differenzierung einzuleiten (Tag 0 der Differenzierung).
    2. Zum gewünschten Zeitpunkt(en) zwei 1 ml serumfreies konditioniertes Medium in einem 1,5 ml Reaktionsrohr und einer Zentrifuge für 5 min bei 500 x g bei RT sammeln, um freistehende Zellen und Zellablagerungen zu entfernen.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist nur erforderlich, wenn ECM-Proteine oder andere sezernierte Proteine in konditioniertem Medium untersucht werden. Wenn das Protein von Interesse im Zytoplasma lokalisiert ist oder membrangebunden ist, saugen Sie das Zellkulturmedium an und fahren Sie mit den Zelllyseschritten fort (3.4.7-3.4.12). Die Zelllyse sollte parallel zur Proteinfällung aus dem serumfreien konditionierten Medium durchgeführt werden, um den proteolytischen Abbau und andere unbeabsichtigte Folgen einer längeren Lagerung der Zellschicht zu minimieren.
    3. Nach zentrifugieren, übertragen Sie 1 ml konditioniertes Medium in ein neues 1,5 ml Reaktionsrohr und niederschlagen Proteine durch Zugabe von 0,391 ml einer Mischung aus Trichloressigsäure (TCA) und nichtionischem Tensid/Waschmittel. Kurz wirbeln sie und brüten 10 min auf Eis.
      HINWEIS: Bereiten Sie das Protein-Fällungsgemisch direkt vor der Verwendung vor, indem Sie 0,252 ml 55% TCA und 0,139 ml von 1% nichtionischem Tensid/Waschmittel pro ml konditioniertem Medium und Wirbel kurz kombinieren. Die Lösung wird trüb.
      VORSICHT: TCA ist korrosiv und muss angemessen behandelt werden.
    4. Pellet die gefällten Proteine bei >16.000 x g für 10 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand.
      VORSICHT: Der Überstand enthält TCA und sollte separat gesammelt und als Gefahrgut entsorgt werden.
    5. Das Proteinpellet 3x mit eiskaltem Aceton und Zentrifuge jedes Mal bei >16.000 x g 10 min bei 4 °C waschen.
    6. Das Proteinpellet für 3 x 4 min bei RT lufttrocknen und in 50 l 1x Natriumdodecylsulfat Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Probenpuffer auflösen (50 mM Tris pH 6,8, 2% SDS, 6% Glycerin und 0,004% Bromphenolblau, ergänzt durch 5% Kochen Sie die Probe 5 min bei 95 °C und verwenden Sie für Western Blotting, um das gewünschte Zielprotein mit Standardverfahren zu erkennen.
      VORSICHT: Mercaptoethanol ist geruchs- und giftig und muss in einer Dunstabzugshaube behandelt werden.
    7. Für intrazelluläre und membrangebundene Proteine spülen Sie die Zellschicht einmal mit 2 ml PBS ab.
    8. Fügen Sie 1 ml PBS hinzu und lösen Sie Zellen, indem Sie sie mit einem Zellschaber aus dem Brunnen kratzen. Sammeln Sie Zellen in einem 1,5 ml Reaktionsrohr und Zentrifuge bei 3.420 x g für 3 min bei 4 °C. Waschen Sie das Zellpellet 3x mit 1 ml PBS und Zentrifuge bei 3.420 x g für 3 min bei 4 °C jedes Mal.
    9. Um die Zellen zu lysieren, setzen Sie das Zellpellet in 0,2 ml Lysepuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM Na2EDTA, 1 mM EGTA, 1% NP40, 1% Natriumdeoxycholat, 2,5 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM-Glyzerophosphat und 1 mM Natriumorthovanadate) ergänzt durch 1x EDTA-freies Protease-Hemmer-Cocktailreagenz und Inkubat für 30 min auf Eis.
    10. Ultraschall für 15 s auf Eis mit einer Ausgangseinstellung von 10 bei einer Betriebsfrequenz von 23 kHz.
    11. Zellablagerungen durch Zentrifugation bei 13.680 x g für 20 min bei 4 °C entfernen. Sammeln Sie Überstand in einem neuen 1,5 ml Reaktionsröhrchen und bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit einem kommerziellen Bradford-Assay oder einer anderen geeigneten Methode.
    12. Kombinieren Sie für jede Probe 100 g Protein mit einem 5x SDS-PAGE-Probenpuffer in einem Gesamtvolumen von 60 l und kochen Sie 5 min bei 95 °C. Analysieren Sie Proben nach standardmäßigen Westlichen Blotting-Verfahren für das Vorhandensein des gewünschten Zielproteins.

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Representative Results

Die Auswahl von puromycinresistentem C2C12 kann in 10 bis 14 Tagen nach der Transfektion durch effiziente Eliminierung nicht resistenter, d.h. untransfizierter Zellen erreicht werden (Abbildung 1B). In der Regel lösen sich mehr als 80 % der Zellen von der Zellkulturschale und diese Zellen werden während der routinemäßigen Zellerhaltung entfernt. Puromycin-resistente C2C12-Zellen, die die Kontroll-schRNA exzellent, behalten die Spindelform, die längsförmige Zellmorphologie bei geringer Zelldichte und die Fähigkeit, sich in Myoröhren zu differenzieren. Die C2C12-Differenzierung bei Serumentzug kann durch Hellfeldmikroskopie und Immunfärbung für den Myotube-Marker Myosin-schwere Kette (MyHC) überwacht werden (Abbildung 2). MyHC-positive Myotuben werden zwischen 3-5 Tagen nach Derier-Initiation beobachtet. Myotuben werden durch das Vorhandensein von mehr als einem DAPI-positiven Kern innerhalb der MyHC-positiven Zellgrenzen multinucleiert. Abbildung 3A zeigt helle Feldbilder stabiler C2C12-Zellen, die in vollständiger DMEM kultiviert wurden. Die hier vorgestellte Knockdown-Effizienz reicht von 40 bis 60 %(Abbildung 3B). Da die mRNA in dem proliferativen Zustand geerntet wurde, in dem das kleine Adamtsl2 exprimiert wird, scheint die Knockdown-Effizienz gering zu sein, aber die Knockdown-Effizienz wird zu späteren Zeitpunkten während der C2C12-Differenzierung, wo endogenes Adamtsl2 induziert und somit auf viel höheren Ebenen ausgedrückt wird, voraussichtlich größer sein. Die Western Blot-Analyse bestätigte den erfolgreichen Knockdown von ADAMTSL2 im Zelllysat, das aus C2C12-Zellen erzielt wurde, die shRNA 3086 stabil exklätcieren, verglichen mit KontrollshRNA (Abbildung 3C).

Figure 1
Abbildung 1: Auswahl stabiler C2C12-Zellen nach Transfektion mit shRNA-kodierender Plasmid-DNA. (A) Tabelle mit der Zielregion (CDS, Codierungssequenz; 3'-UTR, 3'-unübersetzte Region), Klon-ID (nachfolgend 1977, 3086 und 972) und Sequenz der shRNAs, die verwendet werden, um Adamtsl2anzuvisieren. (B) Die Panels zeigen die Auswahl der C2C12-Zellen, die mit der Steuerung shRNA und den drei Adamtsl2-TargetingshRNAs transfiziert wurden. C2C12-Zellen wurden mit den shRNA-Plasmiden transfiziert und Puromycin wurde dem Medium nach 24 h zugesetzt. Puromycin-empfindliche Zellen erscheinen rund und lösen sich schließlich während der routinemäßigen Zellkulturpflege (rote Pfeile). Im Gegensatz dazu erscheinen puromycinresistente Zellen, die die integrierten shRNA-Plasmide beherbergen, spindelförmig, leicht längs, befestigt und lebensfähig (blaue Pfeile). Skalenbalken = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: C2C12 myoblast zur Myotube-Differenzierung. Helle Feldbilder von differenzierenden C2C12-Zellen zeigen ein dichtes Kopfsteinpflaster-Erscheinungsbild der Zellen zu Beginn der Differenzierung (Tag 0 1) und multinukleierte Myotuben wurden nach Tag 5 (obere Reihe) beobachtet. Die Immunostainierung von Differenzierungs-C2C12-Zellen mit Myosin-Schwerkette (MyHC, rot), die ein Marker für Myotuben ist, wird am 3. Tag der Differenzierung (mittleres Panel) induziert. Kerne wurden mit DAPI befleckt und das zusammengeführte Bild wird in den unteren Paneelen angezeigt. Skalenbalken = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Validierung eines stabilen Knockdowns in sich vermehrenden C2C12-Zellen. (A) Helle Feldbilder stabiler C2C12-Zellen, die in vollständiger DMEM kultiviert wurden. Skalenstäbe = 300 m . (B) qRT-PCR-Analyse der Adamtsl2 mRNA-Expression in stabilen C2C12-Zellen. Die Ct-Werte wurden auf das Haushaltsgen Hprt1normalisiert. mRNA wurde vor Beginn der Differenzierung geerntet. Fehlerbalken stellen eine Standardabweichung dar. (C) Western Blot-Analyse zeigt reduziertes ADAMTSL2-Protein in der Zelllysat/ECM-Fraktion von C2C12-Zellen stabil aus, die shRNA 3086 stabil exemitzen. Endogene ADAMTSL2 wurde mit einem maßgeschneiderten polyklonalen Peptid-Antikörper nachgewiesen (auf Anfrage erhältlich). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Wir beschreiben hier ein Protokoll für den stabilen Abbau von ECM-Proteinen in C2C12-Myoblasten und für die phänotypische Analyse der Differenzierung von C2C12-Myoblasten in Myotuben. Mehrere Faktoren bestimmen das Ergebnis des Experiments und müssen sorgfältig geprüft werden. Die Aufrechterhaltung von C2C12-Zellen in der Vermehrungsphase ist ein entscheidender Schritt, um die C2C12-Zellen im Myoblast-Vorläuferzustand zu halten. Die Beibehaltung der Fähigkeit von C2C12-Zellen, sich konsequent in Myotuben zu differenzieren, hängt von i) der Durchgangszahl der Zellen ab, ii) der Dichte der kultivierten Zellen während der routinemäßigen Wartung und iii) der Nährstoffverfügbarkeit, die eine häufige und regelmäßige Auffüllung des Zellkulturmediums11,12,13erfordert. Durch einige unbekannte Mechanismen verlieren auch die höheren Durchgangszahl C2C12-Zellen das Potenzial für weitere Myoblastenfusion11. Die Anweisungen des Anbieters der C2C12-Zellen schlagen vor, diese Zellen bis zu Durchgangsnummer 15 zu erhalten. Danach kann das Differenzierungspotenzial reduziert werden und Experimente mit solchen Zellen können zu einer weniger konsistenten Myotubebildung führen. Andererseits kann die Zelldichte während der Wartung zu ähnlichen Effekten führen9. Das Erreichen der konfluenten C2C12-Zelldichten während der routinemäßigen Zellkultur fördert die Initiierung der C2C12-Myoblastendifferenzierung und kann somit das Differenzierungspotenzial der Zellpopulation negativ beeinflussen. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, c2C12-Zellen daran zu hindern, während der routinemäßigen C2C12-Zellwartung hohe Zelldichten zu erreichen. Dies kann erreicht werden, indem C2C12-Zellen bereits bei niedriger Zelldichte sub-culturing (<50-60% Zusammenfluss) subkulturiert werden. Serumhunger wird verwendet, um C2C12-Zelldifferenzierung in Myotuben zu induzieren. Daher erschöpfen die Zellen für längere Zeit, ohne Medium aufzufüllen, den Nährstoff- und Serumgehalt stark. Das Auffüllen mit frischem Serum, das mindestens alle zwei Tage ein Medium enthält, kann das Auftreten einer unerwünschten vorzeitigen Differenzierung aufgrund von Nährstoff- und Serumentzug verhindern.

Die C2C12-Differenzierung wird in der Regel durch Serumhunger induziert. Der Prozentsatz des Serums, der zur C2C12-Differenzierung verwendet wird, kann die Ergebnisse stark beeinflussen, insbesondere die Zeit, die es dauert, MyHC-positive Myotuben14,15zu bilden. Mehrere Protokolle zeigen eine erfolgreiche Induktion der Differenzierung unter verschiedenen Serumkonzentrationen. Die Verwendung von 2-10% FBS oder Pferdeserum und vollständige Serumentzug wurde berichtet und alle Bedingungen führen zu C2C12 Myotube Bildung. Der Serumprozentsatz oder die Änderung des Serumlos kann Marker zur Differenzierung erheblich verändern. Darüber hinaus kann die Quelle des Serums das Versuchsergebnis beeinflussen, da das Ursprungsland bestimmte Zusatzstoffe während der Rinderserumproduktion zulassen kann oder auch nicht8. Der Serumspiegel könnte angepasst werden, um die Differenzierungsrate entsprechend den spezifischen experimentellen Anforderungen zu erreichen. Insulin kann dem Kulturmedium von C2C12-Zellen zugesetzt werden, um die Differenzierung und Myotubebildung zu beschleunigen16.

Die Fähigkeit, Plasmide, die shRNA oder rekombinante Proteine in C2C12-Zellen kodieren, über Transfektion zu liefern, ist ein attraktives Merkmal von C2C12-Zellen. Mehrere kommerzielle Liposomen-basierte Transfektionsreagenzien wurden zuvor verwendet, um Plasmid-DNA in C2C12-Zellen mit variablen berichteten Transfektionseffizienzen17,18,19,20,21zu liefern. PEI zeigt auch eine angemessene Transfektionseffizienz und ist eine kostengünstige Alternative zu Liposomen-basierten Transfektionsreagenzien. Ein Vergleich zwischen Transfektion mit einem kommerziellen Liposomen-basierten Transfektionsreagenz und PEI zeigte keine nennenswerte Veränderung der Transfektionseffizienz und eine etwas höhere Effizienz wurde mit PEI22festgestellt. In unseren Händen reichte die Transfektionseffizienz mit PEI aus, um stabile, puromycinresistente C2C12-Zellen zu erzeugen. Ein wichtiger Schritt in diesem Protokoll besteht jedoch darin, die Inkubationszeit des Transfektionsreagenzes kurz zu halten. Wie oben erwähnt, c2C12-Zellen sind empfindlich auf Serumentzug und eine längere Exposition gegenüber niedrigen Serumbedingungen während der Transfektion kann C2C12-Zelldifferenzierung begünstigen. Da die Transfektion in Abwesenheit von Serum durchgeführt wird, wurde die Inkubationszeit nach der Transfektion kurz gehalten, um schnell serumhaltiges Medium wieder zu versorgen, um eine vorzeitige Differenzierung zu verhindern. Puromycin wurde dem Kulturmedium 24 h nach Derktion zugesetzt, um die Auswahl von Puromycin-resistenten C2C12-Zellen zu initiieren. Methoden zur Einführung von Plasmid-DNA in differenzierte Myotuben umfassen Transfektion (bis zu 85% Effizienz gemeldet), Elektroporation oder ein biolistischer Ansatz23,24,25. Alternativ könnten stabile C2C12-Zellen mit einem induzierbaren shRNA-Plasmid erzeugt werden, um Gene in späteren Stadien der Myotube-Differenzierung oder während der Myotube-Reifung26zu stürzen.

Die hier beschriebene Methode führte zu einem stabilen Knockdown von ADAMTSL2 in C2C12-Zellen, wo seine Funktion bei der Differenzierung in Myotuben nun bestimmt werden kann. Die Erzeugung stabiler Knockdown-Zellen kann besonders wichtig sein, um die Funktion von Proteinen zu untersuchen, die während der Myotube-Bildung oder Reifung induziert werden. Transiente Transfektion mit siRNA zum Beispiel würde nicht ausreichen, um diese Gene effizient abzubauen, da der transiente Knockdown-Effekt von siRNA nach 5-7 Tagen entwöhnen kann. Alternativ ist der Knockout eines ECM-Proteins mit CRISPR/Cas9 technisch anspruchsvoller und einzelne Klone müssen ausgewählt und sequenziert werden, um den Knockout des gewünschten Gens zu gewährleisten. Die sich entwickelnde Reagenzienlinie kann CRISPR/Cas9 jedoch in Zukunft zur Methode der Wahl für Funktionsverlustexperimente machen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

D.H. wird von den National Institutes of Health (National Institute for Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, NIAMS, Grant Number AR070748) und Der Samenförderung der Leni & Peter W. May Department of Orthopedics, Icahn School of Medicine Mt. Sinai.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Fisher Chemical 191784
Agar Fisher Bioreagents BP1423
Ampicillin Fisher Bioreagents BP1760-5
Automated cell counter Countesse II Invitrogen A27977
Bradford Reagent Thermo Scientific P4205987
C2C12 cells ATCC CRL-1772
Chamber slides Invitrogen C10283
Chloroform Fisher Chemical 183172
DMEM GIBCO 11965-092
DMSO Fisher Bioreagents BP231-100
DNase I (Amplification Grade) Invitrogen 18068015
Fetal bovine serum VWR 97068-085
GAPDH EMD Millipore MAB374
Glycine VWR Life Sciences 19C2656013
Goat-anti-mouse secondary antibody (IRDYE 800CW) Li-Cor C90130-02
Goat-anti mouse secondary antibody (Rhodamine-red) Jackson Immune Research 133389
HCl Fisher Chemical A144S
Incubator (Shaker) Denville Scientific Corporation 1704N205BC105
Mercaptoethanol Amresco, VWR Life Sciences 2707C122
Midiprep plasmid extraction kit Qiagen 12643
Myosin 4 (myosin heavy chain) Invitrogen 14-6503-82
Mounting medium Invitrogen 2086310
NaCl VWR Life Sciences 241
non-ionic surfactant/detergent VWR Life Sciences 18D1856500
Paraformaldehyde MP 199983
PBS Fisher Bioreagents BP399-4
PEI Polysciences 23966-1
Penicillin/streptomycin antibiotics GIBCO 15140-122
Petridishes Corning 353003
Polypropylene tubes Fisherbrand 149569C
Protease inhibitor cocktail tablets Roche 33576300
Puromycin Fisher Scientific BP2956100
PCR (Real Time) Applied Biosystems 4359284
Reaction tubes Eppendorf 22364111
Reverse Transcription Master Mix Applied Biosystems 4368814
RIPA buffer Thermo Scientific TK274910
sh control plasmid Sigma-Aldrich 07201820MN
sh 3086 plasmid Sigma-Aldrich TRCN0000092578
sh 972 plasmid Sigma-Aldrich TRCN0000092579
sh 1977 plasmid Sigma-Aldrich TRCN0000092582
Spectrophotometer (Nanodrop) Thermo Scientific NanoDrop One C
SYBR Green Reagent Master Mix Applied Biosystems 743566
Trichloroacetic acid Acros Organics 30145369
Trizol reagent Ambion 254707
Trypan blue GIBCO 15250-061
Tryptone Fisher Bioreagents BP1421
Trypsin EDTA 0.25% Gibco-Life Technology Corporation 2085459
Water (DEPC treated and nuclease free) Fisher Bioreagents 186163
Western blotting apparatus Biorad Mini Protean Tetra Cell
Yeast extract Fisher Bioreagents BP1422

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References

  1. Tanzer, M. L. Current concepts of extracellular matrix. Journal of Orthopaedic Science: Official Journal of the Japanese Orthopaedic Association. 11, (3), 326-331 (2006).
  2. Hubmacher, D., Apte, S. S. The biology of the extracellular matrix: novel insights. Current Opinion in Rheumatology. 25, (1), 65-70 (2013).
  3. Sakai, L. Y., Keene, D. R. Fibrillin protein pleiotropy: Acromelic dysplasias. Matrix Biology. 80, 6-13 (2019).
  4. Iozzo, R. V., Gubbiotti, M. A. Extracellular matrix: The driving force of mammalian diseases. Matrix Biology. 71-72, 1-9 (2018).
  5. Le Goff, C., et al. ADAMTSL2 mutations in geleophysic dysplasia demonstrate a role for ADAMTS-like proteins in TGF-beta bioavailability regulation. Nature Genetics. 40, (9), 1119-1123 (2008).
  6. Dubail, J., Apte, S. S. Insights on ADAMTS proteases and ADAMTS-like proteins from mammalian genetics. Matrix Biology. 44-46, 24-37 (2015).
  7. Koo, B. H., et al. ADAMTS-like 2 (ADAMTSL2) is a secreted glycoprotein that is widely expressed during mouse embryogenesis and is regulated during skeletal myogenesis. Matrix Biology. 26, (6), 431-441 (2007).
  8. Khodabukus, A., Baar, K. The effect of serum origin on tissue engineered skeletal muscle function. Journal of Cellular Biochemistry. 115, (12), 2198-2207 (2014).
  9. Bajaj, P., et al. Patterning the differentiation of C2C12 skeletal myoblasts. Integrative Biology. 3, (9), 897-909 (2011).
  10. Mashinchian, O., Pisconti, A., Le Moal, E., Bentzinger, C. F. The Muscle Stem Cell Niche in Health and Disease. Current Topics in Developmental Biology. 126, 23-65 (2018).
  11. Hindi, L., McMillan, J. D., Afroze, D., Hindi, S. M., Kumar, A. Isolation, Culturing, and Differentiation of Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult Mice. Bio-protocol. 7, (9), 2248 (2017).
  12. Krauss, R. S., Joseph, G. A., Goel, A. J. Keep Your Friends Close: Cell-Cell Contact and Skeletal Myogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9, (2), 029298 (2017).
  13. Lawson, M. A., Purslow, P. P. Differentiation of myoblasts in serum-free media: effects of modified media are cell line-specific. Cells Tissues Organs. 167, (2-3), 130-137 (2000).
  14. Fujita, H., Endo, A., Shimizu, K., Nagamori, E. Evaluation of serum-free differentiation conditions for C2C12 myoblast cells assessed as to active tension generation capability. Biotechnology and Bioengineering. 107, (5), 894-901 (2010).
  15. Cheng, C. S., et al. Conditions that promote primary human skeletal myoblast culture and muscle differentiation in vitro. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306, (4), 385-395 (2014).
  16. Conejo, R., Valverde, A. M., Benito, M., Lorenzo, M. Insulin produces myogenesis in C2C12 myoblasts by induction of NF-kappaB and downregulation of AP-1 activities. Journal of Cellular Physiology. 186, (1), 82-94 (2001).
  17. Dodds, E., Dunckley, M. G., Naujoks, K., Michaelis, U., Dickson, G. Lipofection of cultured mouse muscle cells: a direct comparison of Lipofectamine and DOSPER. Gene Therapy. 5, (4), 542-551 (1998).
  18. Balcı, B., Dinçer, P. Efficient transfection of mouse-derived C2C12 myoblasts using a matrigel basement membrane matrix. Biotechnology Journal. 4, (7), 1042-1045 (2009).
  19. Xia, D., et al. Overexpression of chemokine-like factor 2 promotes the proliferation and survival of C2C12 skeletal muscle cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1591, (1), 163-173 (2002).
  20. Tapia, O., Gerace, L. Analysis of Nuclear Lamina Proteins in Myoblast Differentiation by Functional Complementation. Methods in Molecular Biology. 1411, 177-194 (2016).
  21. Yamano, S., Dai, J., Moursi, A. M. Comparison of transfection efficiency of nonviral gene transfer reagents. Molecular Biotechnology. 46, (3), 287-300 (2010).
  22. Luo, J., et al. An efficient method for in vitro gene delivery via regulation of cellular endocytosis pathway. International Journal of Nanomedicine. 10, 1667-1678 (2015).
  23. Sandri, M., Bortoloso, E., Nori, A., Volpe, P. Electrotransfer in differentiated myotubes: a novel, efficient procedure for functional gene transfer. Experimental Cell Research. 286, (1), 87-95 (2003).
  24. Yi, C. E., Bekker, J. M., Miller, G., Hill, K. L., Crosbie, R. H. Specific and potent RNA interference in terminally differentiated myotubes. Journal of Biological Chemistry. 278, (2), 934-939 (2003).
  25. Antolik, C., De Deyne, P. G., Bloch, R. J. Biolistic transfection of cultured myotubes. Science's STKE. 2003, (192), 11 (2003).
  26. Shintaku, J., et al. MyoD Regulates Skeletal Muscle Oxidative Metabolism Cooperatively with Alternative NF-kappaB. Cell Reports. 17, (2), 514-526 (2016).

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