Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Imaging Mycobacterium tuberculosis i mus med Reporter enzym fluorescens

Published: February 26, 2018 doi: 10.3791/56801
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center, 2Tuberculosis Research Section, Laboratory of Clinical Infectious Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health
* These authors contributed equally

Summary

Vi beskriver optisk avbilding av mus infisert med Mycobacterium tuberculosis (M. tuberkulose) bruker reporter enzym fluorescens (REF). Denne protokollen forenkler følsom og bestemt påvisning av M. tuberkulose i pre-klinisk dyremodeller for patogenesen, therapeutics og vaksinen forskning.

Abstract

Reporter enzym fluorescens (REF) benytter underlag som er spesifikke for enzymer finnes i målet organismer rundt for avbildning eller deteksjon av fluorescens eller bioluminescens. Vi benytter BlaC, et enzym uttrykt constitutively av alle M. tuberkulose stammer. REF lar rask kvantifisering av bakterier i lungene av infiserte mus. Den samme gruppen av mus kan avbildes på mange tidspunkt, sterkt redusere kostnader, opplisting bakterier raskere, slik at romanen observasjoner i vert-patogen interaksjoner og økende statistisk styrke, siden vedlikeholdes lett flere dyr per gruppe . REF er ekstremt følsom på grunn av katalytisk natur BlaC enzymatisk reporteren og bestemt på grunn av egendefinerte flourescence resonans energioverføring (bånd) eller fluorogenic underlag brukes. REF krever ikke rekombinant stammer, sikre normal vert-patogen interaksjoner. Vi beskriver avbilding av M. tuberkulose infeksjon med et bånd substrat med maksimal utslipp på 800 nm. Bølgelengden av underlaget kan følsom dype vev bildebehandling i pattedyr. Vi vil skissere aerosol infeksjon for mus M. tuberkulose, anestesi mus, administrasjon av REF substrat og optisk tenkelig. Denne metoden har vært anvendt evalueres vert-patogen interaksjoner og effekten av antibiotika målretting M. tuberkulose.

Introduction

Langsomme veksten av M. tuberkulose er en viktig veisperring i rask diagnose tuberkulose1,2,3. Mens kultur basert diagnose tar uker å produsere resultater, har acid-fast smøre diagnostiske begrensninger4 barn5 og pasienter co infisert med humant immunsviktvirus6,7. Optisk bildeteknologi har nylig blitt anerkjent som et alternativ til tradisjonelle diagnostiske metoder for tuberkulose8,9. Fluorescens og bioluminesens kan brukes å optisk image M. tuberkulose i levende dyr i sanntid10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19. Optisk tenkelig har fordelen av en rask og spesifikk vurdering av en infeksjon med M. tuberkulose20,21,22.

Vi skissere detaljer for optisk tenkelig av M. tuberkulose i levende mus med REF. Denne metoden er veldig spesifikk og følsom23,24 og lik andre optiske metoder, er mindre dyr enn andre metoder for tuberkulose (TB) imaging25, inkludert beregnet tomografi (CT)26, magnetiske resonans imaging (MRI)27, og F-fluorodeoxyglucose fantes et positron utslipp tomografi/CT (F-FDG PET/CT)28. REF benytter egendefinerte fluorescent eller bioluminescent underlag som ved spalting av en bakteriell enzym, produsere en fluorescerende produktet8,29. Derfor har den fordelen av ikke krever en rekombinant mycobacterial reporter belastning30,31. BÅND underlaget beskrevet består av en fluorochrome og en avsluttes forbundet med en β-Laktam ring som er hydrolyzed av BlaC (β-lactamase), naturlig constitutively uttrykt av tuberkulose-kompleks Mycobacterium8, 32. bakterier generere direkte tapsfrie REF katalytisk aktivitet som gjør forsterkningen av mange størrelsesordener og følsom påvisning av M. tuberkulose.

REF underlaget brukt i denne studien har utmerket vev penetrasjon i levende dyr og redusert bakgrunn på grunn av sin lange bølgelengde. Med dette lang-bølgelengde underlaget er det mulig å oppnå en terskel for påvisning M. tuberkulose på nesten 100 kolonien danner enheter (CFU) i vitro og < 1000 CFU i lungene mus i vivo (helt dyr)8, 33. REF kan brukes som et diagnostisk verktøy for sputum, klinisk materialer og selv direkte hos pasienter med mikro endoskopisk systemer16,32,33,34 grunn dens høy sensitivitet og spesifisitet. REF kan brukes på tuberkulose klinisk belastning, fordi den bruker en naturlig produsert bakteriell enzym, BlaC, til å søke i alle stammer. Disse egenskapene gjør REF imaging et verdifullt verktøy i pre-klinisk tuberkulose forskning generelt for å lette terapeutiske og vaksine evaluering samt analyse av patogenesen, men kan også være brukt diagnose i tuberkulose pasienter.

Protocol

Dyrestudier ble utført i henhold til retningslinjer og regler fastsatt av den institusjonelle Animal Care og bruk komiteen av Texas A & M University. Gjennomgang og godkjenning fra biohazard verneleder eller komiteen på institusjonen din kan være nødvendig.

Advarsel: Alle prosedyrer krever BSL3 forvaring. Personell er pålagt å ha personlig verneutstyr til alle tider. Alle manipulasjoner utføres innenfor biosikkerhet kabinett (BSC) og alle sharps blir destruert på sharps beholdere. Arbeid overflater og BSC rengjøres med bufret fenol og 70% etanol før du starter arbeidet og etter arbeidstid. Prosedyrer vil normalt gjøres på biosikkerhet nivå 3 med Mycobacterium tuberculosis, men for illustrasjon og filming forfatterne viser disse prosedyrene på biosikkerhet nivå 2 med mindre virulente bakterier.

1. stammer og kultur forhold

Merk: M. tuberkulose belastning CDC1551 brukes i denne studien, men M. tuberkulose belastning kan brukes på samme måte.

  1. Vokse bakterier i M-OADC-TW (7H 9 buljong med 0,5% glyserol og 10% oljesyre druesukker komplekse uten catalase 0,05% Tween-80) middels står på 37 ° C til en OD600 på 0,5 (~ 0,2 x 107 CFU).
  2. Fortynne kulturen i M-OADC-TW (serie 1:10 fortynninger av bakterier). Plate fortynninger av bakterier (105, 106, 107108) i tre eksemplarer på selektiv 7 H 11 plater tillate fastsettelse av CFU.
  3. Inkuber platene i fire uker på 37 ° C eller til koloniene nøyaktig kan telles.
  4. Sentrifuge bakteriell inoculum 8,534 x g i 5 min å få pellets. Vask pellet gang med 10 mL saltoppløsning (0,9% NaCl) og å suspendere pellet i 15 mL saltoppløsning (0,9% NaCl).

2. aerosol infeksjon av mus med en Madison kammer

  1. Kan mus å acclimate seg de nye omgivelsene i en uke.
  2. Veie musene før laste dem inn i kammeret.
  3. Koble tre snorer til grenuttaket: hovedkammeret kraften og vakuumpumpe luftkompressor, i den rekkefølgen.
  4. Nøye skru glasskrukke. Bringe glasskrukke biosikkerhet skap og legge til utfordringen inoculum suspendert i 15 mL saltoppløsning (0,9% NaCl) å oppnå ~ 104 - 106 CFU bakterier i lungene.
  5. Lukk lokket på glasskrukke i biosikkerhet kabinett. Feste glasset til forstøveren enhet og justere loddrette rustfritt stål røret slik at den nedre enden (inntak) er omtrent en fjerdedel av en tomme nedenfor nivået til væsken i glasset.
  6. Last alle dyr nødvendig for eksperimentet (kammeret rommer opptil 90 mus) inn i kammeret og lukke alle låsene på døren.
  7. Sjekk viktigste (rom) luft gjennomstrømningsmåler. Sikre at midten av float (ball) går ca 50 L/min målt på skalaen til venstre.
  8. Trykk Start-knappen på kontrollpanelet på kammeret. Angi luftstrømmen hastighet gjennom kompressor luft gjennomstrømningsmåler (mindre meter til venstre) som 4 L/min på skalaen. Sjekk visuelt for å sikre at utfordringen inoculum nebulized.
  9. Etter 15 min, når det røde lyset på forsiden av kontrollpanelet vises og et hørbart signal indikerer slutten av kjøringen, trykk nullstillingsknappen på nedre høyre hjørne av kontrollpanelet for å tilbakestille tidtakerne.
  10. Hold nede den lille røde knappen på døren til kammeret å løslate vakuum.
  11. Åpne kammeret og fjern dyrene. Plass musene rygg i deres burene.
  12. Fjern forstøveren glasskrukke og plasser i en forseglet, lekkasjefri transport beholder. Plasser beholderen i bio-sikkerhet kabinettet og kast utfordring suspensjon i en angitt avfallsbeholderen.
  13. Plasser brukte forstøveren glasset inne en biohazard bag, og forsegl posen for transport til autoclave.
  14. På slutten av infeksjon prosedyren, spray innsiden av kammeret med bufret fenol og 70% etanol og tillate kammeret til å sitte i 10 min.
  15. Deretter tørke ned alle tilgjengelige innvendige flater veldig grundig. Kast alle forurensede papirhåndklær, etc. i biohazard papirkurven. Autoclave søppel, avfall beholder og brukt forstøveren krukker.
  16. Plass dyrene i forvaring rommet til det tenkelig tidspunktet.
  17. På dagen for bildebehandling, overføre dyrene i en sekundær beholder tenkelig rommet.

3. animal anestesi

  1. Bedøve mus med isoflurane med en tilpasset gass anestesi system.
  2. Veie hver av de to trekull filteret ligger på toppen av anestesi enheten.
  3. Erstatte med en ny boks hvis vekten er 50 g over første vekten.
  4. Sjekk vaporizer enheten for å sikre tilstrekkelig isoflurane for prosedyren.
  5. Plass forpart holderen inne tenkelig kammeret. Plasser antall nesen kjegle kreves for prosedyren og forsegle gjenværende åpningene med nesen kjegle-stopper.
  6. Slå på oksygentilførsel fra høytrykks sylinderen og sette den på 55 psi.
  7. Slå på evakuering pumpen ligger anestesi enheten og sette den å 8 L/min.
  8. Slå på den oksygen veksle ligger anestesi enheten.
  9. Slå på gasstrømmen til anestesi induksjon chamber å motregne flyten av gass på 1,5 L/min. slå gasstrømmen.
  10. Slå på gasstrømmen til tenkelig chamber å motregne flyten av gass på 0,25 L/min. slå gasstrømmen.
  11. Slå på isoflurane vaporizer og sett den på 2-2,5%. Justere isoflurane etter antall og vekten av dyr som brukes for eksperimentet ved å vri skiven på isoflurane vaporizer (2-2,5% for mus veier ~ 20 g, 4% for en guinea gris veier 300 g).
  12. Plasser musene i anestesi kammeret og stenger lokket. Slå på gasstrømmen til anestesi induksjon kammeret.
  13. La musene i anestesi induksjon kammeret i 5-10 min før helt anesthetized.
  14. Når mus er anesthetized, gjelde en optisk salve for øynene for å beskytte dem samtidig bildebehandling.
  15. Plass musene i ventrale eller sternal recumbency slik at nesen plasseres i nesen kjegle å lette anestesi mus under tenkelig prosedyren.

4. reporter enzym fluorescens (REF) bildebehandling

  1. Injisere underlaget (20 µM, 2,5 µL/g vekt) av intraperitoneal injeksjon i den infiserte samt kontroll mus. Mus er under anestesi inne i tenkelig kammeret for mindre enn 1 min.
  2. Starte tenkelig systemet.
  3. Initialisere systemet ved å klikke på initialiseringen. Vent til temperaturen baren viser til grønn.
    Merk: Bildebehandling kammeret består av en oppvarmet plattform å opprettholde kroppstemperatur på dyret mens bildebehandling.
  4. Imaging oppkjøpet innstillingen, Velg fluorescerende | Trans-belysning for hele dyr eller Epi-belysning for lunge vev, struktur og overlegg i oppkjøpet Kontrollpanel.
  5. Angi synsfelt b for enkelt museklikk og lampe til høy.
  6. Angi eksponeringstid auto, middels binning, 2-3 for f/stopp og eksitasjon filteret på 745 nm og utslipp filtre fra 780 nm å 840 nm.
  7. For sekvensen oppsett, klikk på sekvens oppsett, velg 9-12 Trans-belysning poeng i lunge-området.
  8. Klikk på Hent for bildeopptak.
  9. Plass musen tilbake til buret etter avbilding.
  10. Overvåk mus til helt frisk eller ofre for kvantifisere CFU hvis imaging på et tidspunkt av eksperimentet. Utføre en modifisert Karnofsky score for å overvåke velvære mus stolpe-tenkelig.

5. analyse av REF imaging

  1. Åpne tenkelig programvare.
  2. Legg bildefiler ved å klikke Bla gjennom ikonet.
  3. Klikk på Spectral Unmixing paletten for verktøyet for spectral unmixing, og klikk til spectra må unmix. Klikk på start unmixing.
  4. For optisk surface rekonstruksjon, klikk på overflaten topografi.
  5. Velg papirretningen som rygg, kan pels musen og klikk Generer overflaten.
  6. Tegne Beskjær bilde og angi terskelen bilde for et område av interesse. Klikk ferdig.
  7. For orgel registrering, gå til kategorien registrering i 3D optisk verktøy-rullegardinmenyen.
  8. Registrere organer rundt i et organ atlas.
  9. Juster orgel størrelsen eller plasseringen til den genererte form ved hjelp av transformeringsverktøyet/på ligger på panelet-registrering verktøy.
  10. Gå til fluorescerende tomografi (SMETTE) 3D rekonstruksjon og velg analysere kategorien Velg bildene tas med for analyse, image type normalisert overføring fluorescens (NTF) effektivitet, klikker Start.
  11. Sjekk på Velg alle og rekonstruere i kategorien Data forhåndsvisning.
  12. For fluorescens kvantifisering, gå område av interesse (ROI) verktøy, legge ROI kube til orgelet rundt og justere cube størrelse for å dekke orgelet rundt. Klikk på måle 3D ROIs.
  13. I vinduet avkastning mål gå til 3D ROI-mål, velger datatypen til voxels og målinger kildeenheten til pmolM-1cm-1.
  14. Lagre og/eller Eksporter resultatet av PILE 3D rekonstruksjon analyse til en figur eller data fil.

6. kvantifisering av bakterier av CFU

  1. Euthanize mus ved intraperitoneal injeksjon av 0,1 mL pentobarbital natrium (390 mg/mL).
  2. Sjekk for pedal refleks ved å klemme pads av feet mus å sikre det er ingen refleks reaksjon.
  3. Explant lungevev fra mus sterilt tang og saks. Homogenize lungevev i 1 mL 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS).
  4. Gjør 10 ganger føljetong fortynninger av lunge-homogenate i sterilt 1 x PBS.
  5. For plating, spot tre dele 20 µL hver av de respektive fortynning på agar tallerkenen.
  6. Inkuber plater i en inkubator på 37 ° C og skjerm for bakterievekst.
  7. Antall koloniene i hvert øye etter inkubasjon og express som CFU / mL ved å korrigere for volum og fortynning ved hjelp av følgende ligning:
    CFU / mL = (C/V) x M
    Hvor C = kolonien teller per sted, V = volum av prøve inokulert på hver plate (mL) og M = multiplikasjonsfaktor (gjensidige av fortynning brukes).
    Merk: Hvis 11 kolonier telles på ett sted for et eksempel volum 0.002 ml på en prøve fortynning av 10-4, ved hjelp av formelen, koloni greven beregnes som
    (11/0,02) x 104 = 5.5 x 106 CFU / mL

Representative Results

REF imaging mus infisert med M. tuberkulose sammen med infisert kontroll musen er vist i figur 1A. Infiserte mus produsert en signifikant (P = 0.0057) høyere fluorescens signalet fra lungene på 6 uker etter smitte sammenlignet kontroll på underlaget administrasjon. En typisk tid kurs å studere den terapeutiske effekten mot M. tuberkulose bruker REF kan bildebehandling på uke 1, 2, 4, 6, 15, 24 etter infeksjon. Fluorescens intensitet er kvantifisert bruker epi-belysning for lunge vev (figur 1B). Stadig økende signal fra uke 2 uke 6 i lungene av infiserte mus antyder at REF er klarer å oppdage M. tuberkulose i vivo. En nedgang i bakgrunnen signalet kontroll mus på et senere tidspunkt (figur 1B) kan tilskrives økningen i kroppen massen og volumet av mus over en periode på 6 uker og dermed redusere eksitasjon bølgelengde penetrasjon. 3D SMETTE rekonstruksjon fluorescens kilder i mus infisert med M. tuberkulose er representert i figur 2A. Bildesekvenser er ervervet på flere trans-belysning punkter i musen med samme excitation og rekke utslipp filtre. Disse bildesekvenser brukes deretter 3D SMETTE gjenoppbygging for fluorescerende kildedistribusjonen innenfor dyr emnet. Figur 2 A-D viser forskjellige retninger (Koronal, sagittal og transaxial) av musen tomografi lunge orgel registrering. NTF effektivitet kart for å sjekke rekonstruksjon kvaliteten er representert i figur 2E. NTF kan trekke bakgrunn lys lekkasje fra trans-belysning bilder gjennom et ekstra bilde tatt med nøytral tetthet filter. Bildet tatt med bestemte eksitasjon filteret (figur 2E-målt) er normalisert overføring bildet målt med den samme utslipp og en åpen eksitasjon filter (figur 2E - simulert) å gi signalet produsert av underlaget alene. Lignende målt og simulert NTF effektivitet profil i både horisontale (figur 2F) og loddrette (figur 2G) profiler med nesten 0% prosent feil (figur 2E-% feil) gir bevis på en god kvalitet 3D rekonstruksjon med redusert gjenstander og forbedret signal lokalisering og følsomhet.

Figure 1
Figur 1 . Imaging av M. tuberkulose med REF. (A) i vivo imaging mus infisert og smittet med M. tuberkulose på 2, 4 og 6 uker etter smitte. Farge representerer intensiteten av fluorescerende signalet i fotoner per sekund per cm2 fra lav (gul) til høy (rød). (B) kvantifisering av fluorescens fra mus infisert med M. tuberkulose. Fluorescens verdier for både kontroll (svart) og infiserte (rød) er representert med standard feilverdi for hvert punkt. Betydningen av resultatene ble bestemt av studenter t-test, p -verdier av < 0,05 ble vurdert betydelig. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . 3D SMETTE rekonstruksjon fluorescens kilder i mus infisert med M. tuberkulose. Musen tomografi representert i forskjellige retninger; A) Koronal, B) sagittal, og C) transaxial med D) lunge orgel registrering. 3D regionen rundt (ROI) representeres som en rød kube i lungene for kilde målinger. (E) NTF effektivitet kart målt og simulert for avmerker rekonstruksjon kvaliteten. Målt og simulert NTF effektivitet profilen ble sammenlignet, gir god kvalitet på 3D rekonstruksjon (lignende målt og simulert NTF effektivitet). F) vannrett og G) loddrett signal profiler representerer målt (blå) og simulert (rød) NTF effektivitet kurve. De vannrette og loddrette røde linjene angir kilden posisjonen. Farge representerer intensiteten av fluorescerende signalet i fotoner per sekund per cm2 fra lav (blå) til høy (rød). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Når du bruker imaging teknikker, som REF, er det viktige strategier at generasjon robust og konsekvent data. Optisk tenkelig gir spredte lys i vev som kan påvirke dybden av penetrasjon, siden det er vanskelig å fange lys som slippes ut i alle retninger. Bruk av en nær infrarød fluorophore (NIR) substrat for REF imaging har en eksitasjon og utslipp bølgelengde i Querange av 700-900 nm muliggjør minimal absorpsjon av fluorescerende signalet av pattedyr vev. Tilpasset designet underlaget ble bygget ved å koble en NIR fluorophore, IRDye 800Cw til en avsluttes, IRDye QC-1, av en Laktam ring slik at fluorescens resonans energi overføring-basert slukker. IRDye har utmerket vev gjennomtrenging og lys spredning egenskaper og ikke har noen tydelig skadelig effekt på pattedyr36, fjernes fra blod og organer av 24 h. fluorescens signal betydelig øker begynner 4T etter substrat administrasjon, nådd maksimal nivåer 6 h etter administrasjon.

Bakteriell smittsomme dose, modus for administrasjon av smittsomme dose og underlaget samt tidspunkt Imaging innlegget infeksjon ved å utføre pilotstudier bør standardiseres før embarking på store, komplekse, eksperimenter. Pilotstudier kan sterkt redusere tid og kostnader når imaging en rekke dyr fordi en standardprosedyre kan optimaliseres før du gjør nøkkelen eksperimentet. Bakteriell laster bør fastsettes i organer/vev rundt etter hele kroppen bildevisning trans-belysning og ex vivo lunge bildebehandling bruker epi-belysning å validere kilden til signalet og bestemme kvaliteten på korrelasjon med bakteriell tall stede8. Pilotstudier vil gi innsikt i terskelen til gjenkjenning, dynamisk område av teknikken og bestemmelse av de optimale eksperimentelle forholdene for bildebehandling.

Hovedfordelene med å bruke REF imaging som sammenlignet med andre fluorescerende og bioluminescent strategier er dens høy følsomhet og evne å image naturlig M. tuberkulose stammer. REF imaging benytter katalytisk robust enzymet BlaC som er bevart i alle M. tuberkulose kliniske isolater og tuberkulose-kompleks stammer. Stor sensitiviteten av REF imaging er rask katalytisk frekvensen av BlaC i kombinasjon med oppbevaring av cleaved fluorescerende produktet av verten cellen. Signalet kontinuerlig øker underlaget er tilgjengelig som resulterer i nesten ubegrensede oppbygging av infiserte celler og vev. Dette økt følsomhet av REF imaging som i forhold til alternative tilnærminger for imaging oppdages bestemt M. tuberkulose både i vitro og i vivo8,23,24, 29.

REF imaging kan brukes for bakteriell gjenkjenning uten genetiske modifikasjoner aktivere sin direkte søknad til infeksjon modell, enten laboratorium dyr8,37 eller menneskelige kliniske materialer29,38 . REF kan brukes til å oppdage og image en rekke patogener39,40, siden fluorogenic underlag kan utvikles for mange enzymatisk mål enn BlaC som proteaser, kinaser, ureases og β-galactosidases. Men forsiktig tanke bør gis til målet for å sikre den viser optimale egenskaper for bildebehandling. BlaC representerer en god modell enzymet for egenskaper som sikrer bruk av denne strategien. REF imaging gir en umiddelbar lese-out om bakterielle belastningen i lungene under infeksjoner, som sterkt gjør fremskritt i studiet av tuberkulose patogenesen, siden fastsettelse av bakteriell tall krever vanligvis tre til seks ukers, men enda mer rask hurtigvoksende organismene denne tilnærmingen vil spare mye tid. REF kan også brukes til å diskriminere kreftsvulster tuberkulose, et sentralt problem i diagnostisering av nodulær lesjoner i pasienter41,42. REF fungerer som en roman verktøyet å akselerere translasjonsforskning tuberkulose bildebehandling og kan også brukes til mennesker, noe som muliggjør rask prediksjon av terapeutiske resultater.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane VETONE 501027
CNIR800 Custom synthesized
Fatal Plus solution Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd
7H9 Middlebrook broth BD 271310
OADC Middlebrook enrichment BD 212351
Sporcidin RE-1284F
7H11 Middlebrook Agar BD 212203
Madison Chamber
IVIS Spectrum Perkin Elmer 124262
XGI-8-gas Anesthesia System Perkin Elmer
Living Imaging software Perkin Elmer
Transparent nose cones Perkin Elmer
M. tuberculosis strain CDC1551 ATCC
Female BALB/C mice, 5-7 weeks Jackson Laboratory

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lewinson, D. M., et al. Official American thoracic society/infectious diseases society of America/ centers for disease control and prevention clinical practice guidelines: diagnosis of tuberculosis in adults and children. Clin Infect Dis. 64 (2), 1-33 (2017).
  2. Lee, J., et al. Sensititre MYCOTB MIC plate for testing Mycobacterium tuberculosis susceptibility to first- and second-line drugs. Antimicrob Agents Ch. 58 (1), 11-18 (2014).
  3. Dheda, K., et al. The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis. Lancet Resp Med. 5 (4), 291-360 (2017).
  4. Behr, M. A., et al. Transmission of Mycobacterium tuberculosis from patients smear-negative for acid-fast bacilli. Lancet. 353 (9151), 444-449 (1999).
  5. Cruz, A. T., Revell, P. A., Starke, J. R. Gastric aspirate yield for children with suspected pulmonary tuberculosis. J Pediatric Infect Dis Soc. 2 (2), 171-174 (2013).
  6. Monkongdee, P., et al. Yield of acid-fast smear and mycobacterial culture for tuberculosis diagnosis in people with human immunodeficiency virus. Am J Resp Crit Care. 180, 903-908 (2009).
  7. Karstaedt, A. S., Jones, N., Crewe-Brown, H. H. The bacteriology of pulmonary tuberculosis in a population with high human immunodeficiency virus seroprevalence. Int J Tuberc Lung D. 2 (4), 312-316 (1998).
  8. Yang, H. J., et al. Real-time imaging of Mycobacterium tuberculosis, using a novel near-infrared fluorescent substrate. J Infect Dis. 215 (3), 405-414 (2017).
  9. Nooshabadi, F., et al. Intravital excitation increases detection sensivity for pulmonary tuberculosis by whole-body imaging with β-lactamase reporter enzyme fluorescence. J Biophotonics. , (2016).
  10. Chang, M. H., Cirillo, S. L. G., Cirillo, J. D. Using luciferase to image bacterial infections in mice. J Vis Exp. (48), (2011).
  11. Kong, Y., Subbian, S., Cirillo, S. L. G., Cirillo, J. D. Application of optical imaging to study of extrapulmonary spread by tuberculosis. Tuberculosis. 89 (1), 15-17 (2009).
  12. Andreu, N., et al. Rapid in vivo assessment of drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis using an improved firefly luciferase. J Antimicrob Chemoth. 68 (9), 2118-2127 (2013).
  13. Andreu, N., et al. Optimisation of bioluminescent reporters for use with Mycobacteria. PLoS ONE. 5 (5), 10777 (2010).
  14. Nooshabadi, F., Yang, H. Y., Bixler, J. N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Maitland, K. C. Intravital fluorescence excitation in whole-animal optical imaging. PLoS ONE. 11 (2), 0149932 (2016).
  15. Bixler, J. N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Matiland, K. C. Multi-scale fluorescence imaging of bacterial infections in animal models. Proc. SPIE 8565, Photonic Therapeut Diagnos IX. , 856537 (2013).
  16. Mufti, N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Maitland, K. C. Detection of bacterial infection with a fiber optic microendoscope. Proc. SPIE 8092, Med Laser Appl Laser-tissue Interac V. , 80920A (2011).
  17. Zelmer, A., et al. A new in vivo model to test anti-tuberculosis drugs using fluorescence imaging. J Antimicrob Chemoth. 67 (8), 1948-1960 (2012).
  18. Yang, D., Ding, F., Mitachi, K., Kurosu, M., Lee, R. E., Kong, Y. A fluorescent probe for detecting Mycobacterium tuberculosis and identifying genes critical for cell entry. Front. Microbiol. 7, (2016).
  19. Ordonez, A. A., et al. Mouse Model of pulmonary cavitary tuberculosis and expression of matrix metalloproteinase-9. Dis Model Mech. 9, 778-779 (2016).
  20. Mills, B., Bradley, M., Dhaliwal, K. Optical imaging of bacterial infections. Clin Transl Imaging. 4, 163-174 (2016).
  21. Calderon, V., Valbuena, G., Goez, Y., Endlsey, J. J. A humanized mouse model of tuberculosis. PLoS ONE. 8 (5), 63331 (2013).
  22. Vergne, I., Chua, J., Lee, H. H., Lucas, M., Belisle, J., Deretic, V. Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis. P Natl Acad Sci Usa. 102 (11), 4033-4038 (2004).
  23. Kong, Y., et al. Imaging tuberculosis with endogenous β- lactamase reporter enzyme fluorescent in live mice. P Natl Acad Sci Usa. 107 (27), 12239-12244 (2010).
  24. Kong, Y., Cirillo, J. D. Reporter enzyme fluorescence (REF) imaging and quantification of tuberculosis in live animals. Virulence. 1 (6), 558-622 (2010).
  25. Skoura, E., ZumLa, A., Bomanji, J. Imaging in tuberculosis. Int J Infect Dis. 32, 87-93 (2015).
  26. Lee, K. S., Im, J. G. CT in adults with tuberculosis of the chest: characteristic findings and role in management. Am J Roentgenol. 164, 1361-1367 (1995).
  27. Hoffman, E. B., Crosier, J. H., Cremin, B. J. Imaging in children with spinal tuberculosis. A comparison of radiography, computed tomography and magnetic resonance imaging. J Bone Joint Surg Br. 75 (2), 233-239 (1993).
  28. Soussan, M., et al. Patterns of pulmonary tuberculosis on FDG-PET/CT. Eur J Radiol. 81 (10), 2872-2876 (2012).
  29. Sule, P., et al. New directions using reporter enzyme fluorescence (REF) as a tuberculosis diagnostic platform. Tuberculosis. 101, 78-82 (2016).
  30. Heuts, F., Carow, B., Wigzell, H., Rottenberg, M. E. Use of non-invasive bioluminescent imaging to assess mycobacterial dissemination in mice, treatment with bactericidal drugs and protective immunity. Microbes Infect. 11 (14-15), 1114-1121 (2009).
  31. Kong, Y., et al. Application of fluorescent protein expressing strains to evaluation of anti-tuberculosis therapeutic efficacy in vitro and in vivo. PLoS ONE. 11 (3), 0149972 (2016).
  32. Xie, H., et al. Rapid point-of-care detection of the tuberculosis pathogen using a BlaC-specific fluorogenic probe. Nature Chem. 4, 802-809 (2012).
  33. Nooshabadi, F., et al. Whole-animal imaging of bacterial infection using endoscopic excitation of β-lactamase (BlaC)- specific fluorogenic probe. Proc SPIE. 9715, 97150 (2016).
  34. Ghiasi, M., Pande, T., Pai, M. Advances in tuberculosis diagnostics. Curr Trop Med Rep. 2 (2), 54-61 (2015).
  35. Rao, J., Andrasi, A. D., Yao, H. Fluorescence imaging in vivo: recent advances. Curr Opin Biotech. 18 (1), 17-25 (2007).
  36. Marshall, M. V., Draney, D., Sevick-Muraca, E. M., Olive, D. M. Single-dose intravenous toxicity study of IRDye 800CW in Sprague-Dawley rats. Mol Imaging Biol. 12 (6), 583-594 (2010).
  37. Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine. Front Microbiol. 8, 717 (2017).
  38. 2,7-disubstituted cephalosporin derivatives as beta-lactamase substrates and methods for their use for the diagnosis of tuberculosis. US patent. Rao, J., Xie, H., Cheng, Y., Cirillo, J. D. , 20150219653 A1 (2015).
  39. Shao, Q., Zheng, Y., Dong, X., Tang, K., Yan, X., Xing, B. A Covalent Reporter of β-Lactamase Activity for Fluorescent Imaging and Rapid Screening of Antibiotic-Resistant Bacteria. Chem Eur J. 19 (33), 10903-10910 (2013).
  40. Li, L., Li, Z., Shi, W., Li, X., Ma, H. Sensitive and Selective Near-Infrared Fluorescent Off-On Probe and Its Application to Imaging Different Levels of β-Lactamase in Staphylococcus aureus. Anal Chem. 86 (12), 6115-6120 (2014).
  41. Ashizawa, K., et al. Coexistence of lung cancer and tuberculoma in the same lesion: demonstration by high resolution and contrast-enhanced dynamic CT. BRIT J RADIOL. 77 (923), 959-962 (2004).
  42. Figueroa, C. J., Riedel, E., Glickman, M. S. Clinical and radiographic differentiation of lung nodules caused by mycobacteria and lung cancer: a case-control study. BMC Infect Dis. 15 (482), (2015).

Tags

Immunologi problemet 132 lunge optisk lactamase vaksiner dyremodeller therapeutics patogenesen
Imaging <em>Mycobacterium tuberculosis</em> i mus med Reporter enzym fluorescens
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sharan, R., Yang, H. J., Sule, P.,… More

Sharan, R., Yang, H. J., Sule, P., Cirillo, J. D. Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence. J. Vis. Exp. (132), e56801, doi:10.3791/56801 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter