Summary
Burada açıklanan protokol endoreduplication yumrular patates (Solanum tuberosum) içinde ölçmek için bir yöntemdir. Gürültü ve enkaz aşağı akım akış sitometrik analizinde azaltmak için plasmolysis ve işgal ayıklama adımları içerir.
Abstract
Endoreduplication, bir hücrenin nükleer genom sonraki sitokinez olmadan çoğaltılması hücreleri artan DNA içeriği ile verimleri ve Hücresel boyutta uzmanlık, geliştirme ve artış ile ilişkilidir. Bitkiler, endoreduplication büyüme ve genişleme belirli doku ve organların kolaylaştırmak için gibi görünüyor. Bunlar arasında karbonhidrat depolama işlevini yerine getirmede önemli hücresel genişleme uğrar (Solanum tuberosum), patates yumru var. Böylece, endoreduplication nasıl yumrular karbon Bu bolluk karşılamak edebiliyoruz önemli bir rol oynayabilir. Ancak, yumrular kaba nükleer yalıtım metotlarından yol hücresel açması yaprakları ile etkin kullanılabilir yöntemleri yumru endoreduplication Index (EI) tahmini engellemektedir. Bu makale farklı genotip elde temsilcisi sonuçları gösteren ve yumru doku bölümlere yumru endoreduplication önceki yalıtım aracılığıyla değerlendirmek için bir teknik sunar. Protokolü'nün önemli sınırlamaları önceki lizis sonra numune hazırlama gibi örnekleri nispeten kısa ömrü için gerekli zaman ve reaktif maliyetlerdir. Protokol teknik varyasyona önemli olmakla birlikte, bu büyük özel hücreler nükleer izolasyon geleneksel yöntemler üzerinde bir gelişme gösterir. Olanakları enzim, Fiksajlar kullanımı ve diğer değişiklikler geri dönüşüm gibi iletişim kuralına iyileştirmeler için önerilmektedir.
Introduction
Endoreduplication bir hücre tipik hücre döngüsü forgoes ve bunun yerine bir alternatif tabii ki DNA ikileşmesi hücresel bölünme olmadan tekrarlanan tur oluşan geliştirme uğrar işlemidir. Elde edilen hücre DNA artmış olacak içerik ve nükleer boyutu hücresel düzenlemesi, genişleme ve uzmanlık bir rol oynadığı düşünülmektedir. Genel olarak, (bir endocycle olarak adlandırdığı) endoreduplication ve DNA içeriği karşılık gelen artış bir tur daha büyük hücre birimle ilişkili, "DNA içeriği artan karyoplasmic teorisi" çöktürülmüş bir gözlem için düzgün gereklidir düzenleyen bir daha büyük, belki de daha fazla karmaşık, hücre1. Bu fenomen dokuların yapısal/savunma (trichomes)2,3, olanlar dahil olmak üzere bir aralıktaki gözlenen yüksek bitkilerde yaygındır Besleyici (Mısır endosperm)4,5ve lavabo/depolama () domates meyve örtüsü; patates yumru)6,7,8 işlevleri. Meyve, o endoreduplication olarak endoreduplication ve meyve gelişimsel dönem9arasında negatif ilişki kanıtladığı meyve örtüsü hızlı büyümenin kolaylaştırıcı bir rol oynar sürülmüştür. Örneğin DNA ile 512 C (512 kez haploit genom) domates meyve örtüsü8' gözlenen içerik içeren hücreler. Ayrıca Chevalier ve ark. (2014) değişiklikler hücre döngüsü genlerin ifadesinde daha büyük meyve10sonra hangi sonuçlara endoreduplication düzeyleri meyve örtüsü içinde artışlara açabilir gösterdi. Bu nedenle, değişiklik endoreduplication teşvik genlerin biyokütle veya verim bitki ıslahı veya genetik manipülasyon yoluyla iyileştirilmesi için potansiyel bir hedef sağlar. Ancak, bu tür gelişme nedenleri daha iyi anlamak ve endoreduplication sonuçlarını şartlı olduğunu.
Endoreduplication en sık sayede çekirdeği, ham doku hazırlıklar11' de yayımlanan propidium iyodür12 (PI) gibi bir DNA'ya bağlanıcı fluorophore ile inkübe Akış Sitometresi ile ölçülür. Filtre uygulanmış örnekleri sonra nerede emisyon dalga boylarında fluorophore için özel dikkat edilmelidir akış sitometresi lazer tarafından iletilir. Her olay (Yani, çekirdeği) floresan yoğunluğu parçacık DNA-içerik ile doğrudan ilişkilidir. Böylece, bilinen bir standarda karşılaştırarak, belirli bir örnek hücrelerinin göreli ve mutlak DNA içeriği hesaplanabilir. Endoreduplication Endeksi (EI) hücresel DNA içeriği (C-değeri) 1 C haploit hücre (protokol 6,7 adımda sunulan formül) DNA içeriğini nerede gözlemleyerek endocycles bir örnek içinde hücre başına ortalama sayısı kurarak belirlenir. Örneğin, diploit bir organizma olarak temel DNA içeriği somatik hücre 2 c. Bir örnek 4 C kaç hücre varsa, karşılık gelen bir endoreduplication turu için veya daha büyük bir EI 0 yakınındaki olurdu; Ancak neredeyse tüm hücreleri 4 C varsa EI yaklaşık 1 olacaktır. Endoreduplication birden fazla mermi daha yüksek bitkiler gözlenen EI değerleri ortak olduğu gibi Ancak, çok daha büyük olabilir. Endoreduplication Endeksi Hesaplama sırasında nispeten basit, çekirdeği göreli zenginliği C-değerleri güvenilir olmasını gerektirir, hangi belirli türler ve doku (patates yumrular dahil) engellemiştir tespit. Bu hücresel anatomi, kimya veya hücre duvarı kompozisyon13 farklılıkları çekirdeklerin yaygın olarak kullanılan doğrudan uygun arabellekleri serbest bırakmak için jilet kullanarak tipik hazırlıkları için inatçı olmak bu örnekler neden muhtemeldir domates meyve örtüsü gibi dokular ile endoreduplication için bir model8çalışmaları.
Patates, söz konusu ham hazırlıklar tutarsız sonuçlar endoreduplication yumru içinde incelenmesi için sadece birkaç çalışmalar, belki de güvenilir bir protokolü kısmen bir eksikliği nedeniyle sınırlı kalır. Bu tür yaklaşımlar de yumru örnekleri ciddi bozulma ve gürültü enkaz, çekirdek değerleri neredeyse imkansız farklı C ile oluşan tepeler farklılaşma yapma şeklinde bir bolluk deneyim yaprakları için çalışırken. Bu belki de hücresel kompozisyon ve yumru hücreleri içinde hücresel enkaz bir bolluk farklılıklar nedeniyle olduğunu (örn. nişasta depolama amyloplasts). Bu engeli aşmak için son zamanlarda Akış Sitometresi patates yumrular, ayırt Peaks'e edinme için daha güvenilir bir iletişim kuralı geliştirilmiştir. Her tepe hücrelerde sıklığı daha sonra farklı genotip veya bir yumru oluşturan farklı dokular için doğru endoreduplication düzeylerini hesaplamak için kullanılabilir. Değiştirilmiş protoplast ayıklama yöntemi14,15 antecedent istihdam Protokolü Akış Sitometresi11patates akrabalar, çeşitlerin ve doku16 içinde önemli farklılıklar gösterdi, daha önce açıklanan . Burada Ploitlik, doku ve yumru boyut bağlamlarda EI değerlendirerek ayrıntılı olarak iletişim kuralı mevcut.
Protocol
Not: Deneysel örnekleri olarak aynı Ploitlik dokusunun yaprak şeklinde uygun denetimleri, genellikle eklemek önemlidir. Bunun nedeni yumru örnekleri 2 C zirvesine küçük ve tanımlamak zor olabilir.
1. hazırlıkları
Not: burada listelenen çözümleri vaktinden önce hazırlanacak ve 4 ° C'de depolanan ancak bu sonraki adımlar sunulan kullanım gününde taze yapılması gerekir.
- Uygun bir birim Plasmolysis kuluçka çözüm (PIS) yapmak (15 mL/örnek): 0.55 M mannitol, 2 mM CaCl2, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgCl2, 50 mM Tris tampon pH 7.5 (HCl ile ayarlanabilir).
- Uygun bir birim Plasmolysis yıkama çözüm (PWS) yapmak (15 mL/örnek) olduğu için PIS aynı 0,71 M mannitol ilavesi hariç.
- Değiştirilmiş Galbraith'ın Akış Sitometresi arabellek11 (FCB) 250 mL olun: 13,6 mM sodyum sitrat (TRISODYUM), 8 mM BEZLERİ, 18 mM MgCl2, % 0,4 v/v Triton X-100. Triton X-100 dağıtmak en az 30 dakika karıştırın.
- Filtre sterilize PIS ve Hava Meydanı çözümleri olan bir 0,22 µm asimetrik polyethersulfone (maymun) filtre. Vakum tahrik filtreleme birimleri kullanın.
-
106 µm kafes filtreler lysed önceki için hazırlayın. Süspansiyonlar 106 µm filtreden geçen herhangi bir yöntem kullanılabilir ancak 1,5 mL doğrudan koleksiyonu tüpler içine iç içe olabilir microcentrifuge tüpleri hazırlayın.
Not: Bunlar steril olması gerekmez.- 1.5 mL microcentrifuge tüpler kullanıyorsanız, 1 cm uzakta belgili tanımlık uç her microcentrifuge tüp kesti. Sıcak bir tabak veya diğer ısı kaynak ısı kullanarak 1 cm2 adet 106 µm çelik kafes alüminyum folyo bir parçası üzerinde. Onlar erimiş kadar tüp kesme sonu kafes basın.
- Patates tatmak için tüm toprak ve enkaz kaldırma yıkayın.
Not: Yumru boyutu ve yaş deneme gol için uygun olmalıdır ancak sonuçlar kalitesini etkileyecek gibi görünüyor değil. Soğuk hava deposu (4 ° C, % 95 RH) için 8 ay olmuştur yumrular başarıyla bu protokole uyguladınız. Yumrular kusurları (örneğin yumru son rot, içi boş kalp, kahverengi nekrotik alanlar) ile duyarlı olsa da, onlar, mümkünse kaçınılması gerekir.
2. gün 1: Yumru doku Plasmolyze
Not: Kontrol yaprak örnekleri burada önceki üretmek veya ham ürünleri tercih edilen iseniz, 5.2 atlamayı dahil edilebilir. Laminar akış hood gibi aseptik bir ortamda steril araçlarla gerçekleştirilmelidir.
- Yüzey patates yumrular % 75 etanol en az 5 min için daldırma ile sterilize.
- Kaldır yumrular etanol ve hava kuru. Yumru 100 gr büyükse, bu genellikle ~ 5 dk, daha uzun sürer.
- Hazırlamak ve her içine PIS etiketi steril 50 mL konik tüpler için her örnek ve filtre aliquot 15 mL steril.
-
Yaklaşık 1 cm3 sterilize yumrular steril neşter ya da mantar matkap kullanarak istenen dokudan örnek.
Not: örnek doku bağlı olarak bir steril cork matkap veya bıçak/neşter kullanabiliriz. Örneğin, ilik isterseniz mantar matkap çekirdeğinden apikal yumru distal ucuna çekmek için kullanılan ve çekirdek orta kısmını örnek. Ancak, patates yumrular asimetrik iç morfolojisi nedeniyle örnek parankimi için daha kesin olabilir veya yumru yarıya indirmek ve istenilen doku bilincin korteks. İç yumru Morfoloji bir tasviri için bkz: şekil 1 .- Kaba doku içine yaklaşık 3 mm3 adet ve transferi doku konik tüp PIS içeren steril neşter kullanarak doğrayın. Gecede 4 ° C'de kuluçkaya
Not: Bu yüzey alanı en üst düzeye çıkarmak için olduğunu böylece PIS, ve daha sonra enzim çözüm tam olarak nüfuz daha kapsamlı sindirim sonucu doku.
- Kaba doku içine yaklaşık 3 mm3 adet ve transferi doku konik tüp PIS içeren steril neşter kullanarak doğrayın. Gecede 4 ° C'de kuluçkaya
Şekil 1: patates yumru iç morfolojisi. İlik (P) ile perimedullary parankimi (PM) arasındaki mesafeyi siyah çizgiler ile gösterilmektedir. Parankimi korteks (C) ayıran vasküler ring siyah bir ok ile gösterilir. Stolon sonu (S) ve yumru gözler (E) de etiketlenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
3. gün 2: Patates önceki üretmek
Not: Bu laminar akış hood gibi aseptik bir ortamda steril araçlarla gerçekleştirilmelidir.
- Hazırlamak ve (0,45 µm maymunlar) uygun bir miktar enzim çözüm (ES) filtre (10 mL/örnek): 0,71 M mannitol, 3 mM CaCl2, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgCl2, % 4 Onozuka R-10 cellulase, %0,8 macerozyme R-10, % 1'hemicululase, 10 mM MES arabellek, pH 5.8. Uygun filtreler bu adımda kullanıldığından emin olun; filtreler ile 0,45 µm yatkındır gibi maymunlar, düşük protein bağlayıcı membran filtrasyon sırasında Enzim kaybı en aza indirir, ancak tıkanma için daha küçük boyuta gözenek.
- PIS konik tüpler steril serolojik pipet kullanarak örneklerinden Aspire edin.
- Her örnek ve ters çevirmek için ES 10 mL ekleyin 2-3 kez.
- Örnekleri gecede 29 ° C'de 180 rpm yatay sallayarak ile kuluçkaya. Örnekler en az 16 h için kuluçkaya.
4. gün 3: Hasat önceki ve yıkama önceki
Not: Aseptik koşullar bu noktada Hayır uzun zaman gerek yoktur.
- Örnekleri shaker kaldırmak ve onları ~ 10 dk için yerleşmek izin.
-
Kapalı büyük bir kısmını ES çözüm mümkün olduğunca Aspire edin.
- ES çözüm olarak sindirilir dokusunu önlemek için dikkat çekici bir serolojik pipet ile mümkün olduğunca kaldırın.
- Micropipette Kaldır kullanarak kalan herhangi bir ES çözüm tekrar sindirilir doku kaçınarak. Bu en kolay sindirilir doku en altında kalırken ES çözüm kapak doğru akması tüp bir açıyla tutarak yapılır.
- Her örnek için Hava Meydanı 15 mL ekleyin ve yavaşça tersine çevirin 2-3 kez. Önceki 10 dakikadır yerleşmek izin verir.
- PWS serolojik pipet ile kaldırın. Bir micropipette kalan herhangi bir sıvı kaldırmak için kullanın.
Not: Bu sırasında Akış Sitometresi örneği çekirdeği bütünlüğünü sağlamak için kesinlikle çok önemli bir adımdır. Sorun gidermede, bu adımı bir örnek başarısızlık büyük olasılıkla kaynak bulundu.
5. gün 3: Örnek Akış Sitometresi için hazırlamak.
Not: Örnekleri buradan buzda aksi belirtilmedikçe tutulmalıdır.
- Propidium iyodür (0.4 mg propidium iyodür/mL FCB) ve RNase çözümleri hazırlamak (0,8 mg RNase A / mL FCB) her FCB içinde eriterek tarafından.
Dikkat: Propidium iyodür çok zehirli. Cilt veya gözlerle temas kaçının. Uygun KKE giymek. -
Buz 1,5 mL ekleyin her örnek için soğuk FCB. Kısaca sallamak ya da girdap ayırmak için her örnek toplanan doku. Yumru doku kümeleri kadar break FCB tam hücreleri nüfuz ve çekirdekleri serbest bırakmak önemlidir. Farklı örnekler az ya da doku ve genotip bağlı olarak ajitasyon gerektirebilir.
Not: FCB çekirdeklerin bırakmadan önceki lyses. Bu nedenle tutmak gerekliliğini yıkımı önlemek için buza örnekler.- Denetim akış sitometresi örnekleri protoplast üretimi adımda dahil değildi Eğer onlar burada dahil edilebilir. Eğer bir kontrol eklemek için küçük yaprak (~ 3 cm2) 1,5 mL buz ince doğrayın soğuk FCB jilet kullanarak. Kontrol örnekleri deneysel örnekleri, tercihen aynı genotip olarak aynı Ploitlik olmalı. Vitro Bitkicik sera veya alan yetiştirilen bitkiler daha temiz doruklarına vermek eğilimindedir.
-
FCB/doku süspansiyon 1 mL 106 µm gözenekli filtre geçmek. 1.5.1. adımda açıklandığı gibi altına metal kafes erimiş ve kesilmiş ipucu ile 1.5 mL microcentrifuge tüp kullanın. Bu microcentrifuge tüp bir 2 mL microcentrifuge tüp iç içe olabilir ve örnek doğrudan üzerinden geçti. Filtrasyon başka bir yöntem kullanıyorsanız, filtrate buz gibi bir Petri tabak içinde toplanan ve daha sonra 2 mL tüp için transfer.
Not: bazen kalan agrega ve hücresel enkaz gözenekli filtre yapışmasına neden. Bu durumda, sadece iki iç içe geçmiş microcentrifuge tüp birkaç kez dokunun enkazı çıkarmak için. - 250 µL RNase çözümde her örnek için ekleyin. Ters çevir ve oda sıcaklığında (RT) 30 dk için kuluçkaya.
Not: Bu adım daha az gürültü için Akış Sitometresi sırasında önde gelen örneklerinden, RNA kaldırmak için tasarlanmıştır. Çekirdeklerin kısa ömürlü olduğu için ancak, araştırmacılar kuluçka zamanı azaltmak veya saldırganın saklanıp örnekleri ciddi sorunlar yaşamaya devam ediyorsanız buz üzerinde gerçekleştirmek karar verebilir. - Propidium iyodür çözüm 125 µL her örnek için ekleyin. Ters çevir ve 30 dk için buz üzerinde kuluçkaya.
Not: Örnek Akış Sitometresi bozulması bile buz üzerinde 2 saat içinde belirgin olduğu gibi en kısa zamanda kullanılmalıdır.
6. gün 3: Akış Sitometresi patates yumru nükleuslar
Not: Akış Sitometresi işlemi ve yazılım enstrüman ve üreticisine bağlı olarak değişiklik gösterir. Cihazın kullanım kılavuzunda Akış Sitometresi belirli işleyişi hakkında ayrıntılı talimatlar sağlanacaktır.
- Vs yan dağılım ve propidium iyodür (PI) vs yan dağılım ileri dağılım Logaritmik ölçek kullanarak iki nokta araziler oluşturun. Ayrıca bir çubuk grafik ile PI x ekseni üzerinde oluşturun. Logaritmik ölçek çekirdeği büyük ölçüde Floresans içinde farklı olabilir olarak tüm olayları içinde ölçekli olduğundan emin olmak için gereklidir.
-
Bir bilinen denetim örnek tüp yük ve böylece tüm olayları ölçekte gerilim ayarlayın. Biz bir örnek genotip dokudan tüp bebek yaprak kullanın. Eğer farklı ploidies örnekleri çalıştırılması için her bir denetimi örneğini dahil edilmelidir.
- Not 2 C en yüksek kanal denetimi örneğini alın. Deneysel örnekleri 2C doruklarına aynı konuma düşmek gerekir.
- Bir deneysel (yumru) örnek yük ve tekrar tüm olayları ölçek üzerinde olduğundan emin olun. Ayarlamalar eğer gerekli, yineleme adım 2 C kanal tanımlamak için 6,2 doruklarına.
- El ile yan dağılım vs PI çizim kullanarak protoplast çekirdeği kapı.
- Sadece kapı protoplast çekirdeği bölgesinde göstermek için PI çubuk grafik ayarlayın.
- Olaylar için istediğiniz sayıyı örnekleri toplamak. Sık sık araştırmacılar 10,000 geçişli olayları Akış Sitometresi için kullanın; Ancak 2000 etkinlikler yumru protoplast örnekleri için daha fazla örnekleri ve düşük konsantrasyonlarda örnekleriyle uyum sağlamak için kullanın.
- Aşağıdaki formül kullanılarak PI çubuk grafikler üzerinden her örnek EI Hesapla:
EI =
4 C 4 C (endoreduplication bir turu temsil eden) olan çekirdek yüzdesi nerede, 8C 8 C, ve benzeri yüzdesidir. Bkz: çubuk grafikler örnekleri için şekil 4 ve C-değerleri doruklarına.
Representative Results
Önceki imalatı
Önceki nesil patates yumrular, hangi genel Morfoloji şekil 1' de görüntülenen yinelenebilir Akış Sitometresi sonuçlar elde etmek gereklidir. Araştırmacılar özellikle sorun giderme gereklidir olay bu yüksek kaliteli önceki FCP ek önce üretilen emin olmak isteyebilirsiniz. Önceki çoğunluğu en az çıkıntılar (Şekil 2) küresel olmalı ve belki de yansıtıcı EI farklılıkları boyutu büyük ölçüde farklı olabilir.
Şekil 2:, edinilen temsilcisi yaprak ve yumru önceki adım 4.4 Protokolü'nün. İzole önceki küresel ve plazma zarı sağlam ile simetrik olmalıdır. Yaprak (A-C) ve yumru (D, E) önceki yanı sıra boyutu endoreduplication farklı düzeylerde gösterebilir bir doku içinde farklılıkları arasındaki büyüklük farkı unutmayın. Amyloplasts yumru önceki içinde görünür ise yaprak önceki kloroplast içerir. Ölçek çubukları 1000 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Akış Sitometresi sonuçlarının değerlendirilmesi
Başarılı veya başarısız bir deney tepeler ve ayırma Akış Sitometresi çubuk genişliği üzerinden gauged. Ölçüm endoreduplication göreli çekirdeklerin her Peak bolluk hesaplama gerektirir gibi sadece varlığı ya da yokluğu doruklarına aralarında anlamlı sınırları çizmek için çok fazla gürültü ise yeterli değil. Şekil 3 araştırmacılar Akış Sitometresi scatter araziler ve çubuk grafikler karşılaşabileceğiniz sonuçları görüntüler. Başarısız örnekleri için olası nedenler tartışma içinde sunulmaktadır.
Şekil 3: temsilcisi sonuçları protoplast çekirdekleri sağlam Akış Sitometresi elde edilen ve ilik örnekleri bozulmuş. Sağlam çekirdeği(a)bozulmuş örnekleri (B) Peaks'e değiştirdi, geniş ve çakışan üsleri göstermek, ancak her uygun yazılımı kullanarak hücreler göreli bereket ölçmek için zirveleri arasında temiz ayrılık göster. Sağlam (C) ve (D) örnekleri bozulmuş scatterplots içinde siyah kutular nükleer olay çubuk grafikler ve olayların kümeleme için geçişi çubuk grafik doruklarına genişliğini yansıtılır gösterir. Kapıları dışında olaylar enkaz, ciddi bir şekilde bozulmuş çekirdeği veya diğer toplamları gösterir. PI-H rasgele ölçülür floresan yoğunluğuna karşılık gelir. Örnek yıkımı önlemek için sorun giderme yöntemleri metin içinde ele alınmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Dokular arasında Endoreduplication farklar
Daha önce yumru ilik dokusu endoreduplication önemli ölçüde daha fazla düzeyde korteks doku16daha olduğunu bildirdi. Onaylamak ve bu üç farklı dokularda cv. çift endoreduplication düzeyde baktık genişletmek için: ilik, perimedullary parankimi ve korteks, örnek başına 2.000 geçişli olaylarla nüsha olarak çoğaltılır. Sonuçlarımız ilik dokusu hücre başına sırasıyla 1,79 ve 1.12 endocycles aracı ile kortikal doku daha önemli ölçüde daha fazla EI vardır bizim daha önceki gözlem doğruladı (p = 0,018; Öğrenci t-Testi). Biraz şaşırtıcı parankimi doku korteks için benzer bir profil gösterdi ve aynı zamanda ilik dokudan önemli ölçüde farklı (yani 1,14; = p = 0,013; Öğrenci t-Testi). Bu sonuçları şekil 4' te özetlenmiştir.
Şekil 4: üç dokularda cv. Superior Endoreduplication. Histogramlar yaprak(a), yumru korteks (B), (C) parankimi ve ilik (D) dokuların o çubuk grafikler hesaplanan EI değeri ile birlikte gösterilir. Her tepe oluşan hücre çekirdeği göreli bereket farklılıkları kolayca özellikle yaprak ve yumru dokular arasında belirgin. C-değerleri her zirve için de görüntülenir. PI-H rasgele ölçülür floresan yoğunluğuna karşılık gelir. EI yumru dokuların karşılaştırmalar burada yıldız işareti gösterir önemli fark E görüntülenir demek (p < 0,05) ve hata çubukları, standart sapma gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Yumru boyutu ve Ploitlik etkisi
Biz daha önce verilen bir genotip için farklı boyutu ama benzer vade yumrular EI16bir karşılık gelen fark göstermedi, bildirdi. Biz bu sonucu onaylamak gibi Ploitlik ve endoreduplication arasındaki ilişki değerlendirmek amaçladık. Bu deneme için kullandığımız üç farklı genotip dokudan parankimi üç çoğaltır: cv. çift (4 x), VT_SUP_19 (2 x) bir dihaploid olduğu cv. çift prickle tozlaşma17ve VT_SUP_19 tarafından bir iki katına dihaploid olan 4 x elde 18 VT_SUP_19 için isogenic. Biz çoğaltır küçük ve büyük (90-130 g) için bir dizi dahil (< 35 g) yumrular cv. yumrular için diğer iki genotip 90-130 g iken çift için. Yumrular tüm bitkiler tam vade sonunda Yani yetiştirilen sera üzerinden hasat bitkileri üst kısımları senesced vardı. Biz VT_SUP_19 ve onun progenitör çift arasında önemli bir fark gözlendi (p = 0.04); Ancak, VT_SUP_19 ve VT_SUP_19 arasında anlamlı bir fark vardı 4 x (p = 0,69). Bu büyük olasılıkla bir genetik bileşeni olarak maskesiz genomik azaltma tarafından endoreduplication için ise bu Ploitlik, en az bu arka planda dikte edilir değil olduğunu gösterir. Son olarak, biz bir kez daha büyük ve küçük cv. arasında önemli bir fark yoktur üstün yumrular şekil 5' te gösterildiği gibi gözlenen.
Şekil 5: Endoreduplication yumrular cv. çift ve diploid (VT_Sup_19) ve tetraploid, iki farklı boyutta (VT_Sup_19 4 x) türevleri. Çubuk grafik için küçük ortalama gösterir (< 35 g) ve büyük (90-130 g) cv. üstün yumrular gibi büyük (90-130 g) yumrular dihaploid VT_SUP_19 ve isogenic iki kat dihaploid VT_SUP_19 4 x. Önemli farklılıklar (p < 0,05) bağlantı mektup rapor tarafından belirtilir. Hata çubukları standart sapma tasvir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Burada sunulan iletişim kuralı diğer Akış Sitometresi hazırlıklar engel araştırmacılar ile endoreduplication patates yumrular, değiştirilmiş olan hücresel içerik ve artan hücre boyutu görünüşte içinde değerlendirmek için bir yol sağlar. Protokol protoplast nesil nükleer bütünlüğü korunarak gürültü ve enkaz azaltmak için bir araç olarak üzerine dayanır. Daha önce araştırmacılar özellikle inatçı Akış Sitometresi örnekleri benzer hazırlıkları açıklanan yanı sıra çeşitli konularda Patogenez19,20gibi çalışmaya yumru önceki kullanılmaktadır. Ancak, bizim bilgi için hiçbiri böyle yumru önceki kullanımı endoreduplication eğitim amacıyla Akış Sitometresi ile birleştirdik. Ayrıca, tipik ham hazırlıkları yanı sıra teknik iki sadece diğer çalışmalar yumru endoreduplication6,7değerlendirmek için kullanılan daha güvenilir olmak önceki kullanımı bulduk. Burada iletişim kuralı, yürütme ve örnek hazırlama, ve bu istihdam tipik bir denemenin sonuçları potansiyel tuzaklar eksikliklerin tartışmak.
Yardımcı programı ve tekrarlanabilirlik yumru Akış Sitometresi protokolünün rağmen ele birkaç zayıflıkları vardır. Başlamak için saat iki gecede incubations gerektiren yoğun iletişim kuralıdır. Ayrıca, protokol bazı pahalı reaktifler, özellikle cellulase ve macerozyme gerektirir. Ayrıca, hazırlıklar özellikle birçok olay istenirse hangi üretilen iş tek bir gün içinde sınırlayabilir bir kaç saat içinde son derece zamana duyarlı, aşağılayıcı. Son olarak, protokol, güvenilir olsa da, tüm bunların çekirdek ve daha düşük kalitede sonuçlar zarar görmesine neden gibi görünüyor içinde numune hazırlama hataları duyarlıdır. Örneğin, mikrobiyal kirlenme sırasında plasmolysis ve işgal üretimi adımları (1-3,4) yanlış aseptik teknik nedeniyle oluşabilir. Örnek her zaman başarı örneği, iyileştirmelerden iken kirlilik, elde edilen çubuk grafikler, çekirdekler için hasar tekrar olasılığı nedeniyle kalitesini önemli ölçüde azaltmak için gibi görünüyor.
Daha önce belirtildiği gibi iletişim kuralının büyük dezavantaj maliyeti, zaman ve hassasiyet hataları vardır. Araştırmacılar bunların her biri azaltmak için ilgili adımları uygulamak isteyebilirsiniz. Maliyet, gelince pek çok örnekleri için iletişim kuralı uygulamak isteyen araştırmacılar enzim konsantrasyonları ve/veya süre sindirim adımın farklı dokular değiştirme düşünebilirsiniz ve genotip yanıt değişiklik gösterebilir. Bu filtre uygulama imkanı içerir ve daha önce gösterdi ama ES geri dönüşüm burada21istihdam. Zamanında bizim gözlem gelince ilk kuluçka (plasmolysis adım) ile dağıtmak ve hala önceki ayıklamak mümkündür; Ancak, onların bütünlüğü ve bereket, hangi olumsuz sonuçları etkiler yaşayacaktır. Örnekleri bozulma azaltmak için araştırmacılar bazı Akış Sitometresi yaklaşımlar örnek bütünlük22korumak için (Örneğin, formaldehit) Fiksajlar kullanımı dahil düşünebilirsiniz. Bu hem bozulmasını önlemek ve sunulan aynı gün meydana gelen örnek protoplast yerine depolama ödemezse ve Akış Sitometresi için izin vermek için yararlı bir araç olabilir. Çekirdeklerin yıpratma engelleyen başka bir aracı ES ve/veya FBC nükleaz inhibitörü eklemek olabilir; 2-mercaptoethanol hiçbir göze çarpan değişiklikler geliştirme sırasında etkilenen iken, diğer inhibitörleri burada sınanmamıştır.
Bizim gözlem tek en kritik adım adım 4.4, kaldırma önce Akış Sitometresi arabellek (FCB) yanı sıra tüm plasmolysis yıkama çözüm olduğunu. Eğer bile küçük bir birim (< 10 µL) kalıntıları, örnekleri çok daha bunun için yoksul ya da bile başarısız örnek açabilir bozulmuş muhtemeldir. Bu enzim çözüm içindeki yabancı maddeleri nedeniyle muhtemeldir (örneğin enzimler, proteaz)23,24 hızlı bir şekilde saat arasında düşük konsantrasyonlarda bile örnek çalıştırır ve kuluçka dönemleri sırasında çekirdeklerin bozulmasına yol açar. Diğer bir önemli faktör PI ve RNase kuluçka adımları süresi kadardır. İletişim kuralında belirtildiği gibi örnekleri düşük çekirdek kaynaklanan araştırmacılar daha fazla numune veya uzun Akış Sitometresi yerleştirmek için aşağıdaki adımları süresini azaltmak karar verebilirsiniz böylece FCB ilavesi çalıştıktan sonra bir kaç saat için kararlı kalmaz konsantrasyonları. Bu da olayların örnek başına toplam sayısını ve çalıştırılması veya daha önce bahsedilen gibi Fiksajlar kullanmayı düşünün için örnekleri arasında tradeoff düşünmeye araştırmacı gerektirir.
Doku ve genotip arasındaki farklar
Sonuçları temsilcisi Protokolü'nün sağlamak üzere iki basit deneyler doku tarafından daha önce raporlanmış değişim onaylamak ve Ploitlik ve genotip etkisini incelemek için tasarlanmıştır. İlik dokusu bir kez daha yüksek EI var bulundu gibi protokol tekrarlanabilir sonuçlar verir doku denemenin sonuçları göstermektedir. Biraz şaşırtıcı daha önce değerlendirildi değil, parankimi doku bir EI değeri önemli ölçüde ilik daha düşük ve benzer kortikal doku vardı. Parankimi hücreleri en az vade sonunda öz ya da beyin hücreleri, genellikle büyüktür bu beklenmedik oldu. Yumrular (90-130 g) tam olarak genişletilmiş ve onların en fazla C-değerleri25ulaştı vade sonunda yumru birim çoğunluğu oluşturan parankimi hücreler için olgun bir mantıklı açıklaması bu. Bu da neden açıklayabilir dihaploid (VT_SUP_19) ve iki katına dihaploid (VT_SUP_19 4 x) cv. üstün yumrular; daha önemli ölçüde daha fazla EI gösterdi yaklaşık olarak eşit büyüklükte yumrular her genotip örneklenmiş, yumrular VT_SUP_19 veya isogenic tetraploid en büyük boyutunu yaratıcı daha küçük iken. Böylece, o-ebilmek var olmak onlar sade bir şekilde büyük EI görüntülenen en fazla ulaşılabilir boyutlarına göre daha büyük oldukları için. Alternatif olarak, fark VT_SUP_19 tetraploid onun progenitör alınan genetik tamamlayıcı bir sonucu olabilir. Dihaploid ayıklama üzerinde tetraploid oluştu genomik azaltılması da yükseltilmiş EI-26katkıda bulunmak için gösterilen bitki çapında stres sonuçlanan zararlı gen maskesi başka bir ihtimal. Yine de, bu dikkatli bir değerlendirme araştırmacılar yumrular ve dokuların seçerken özellikle arasında genotip EI değerleri karşılaştırma için kullanılmak üzere istihdam gerekir göstermektedir.
Gelecek uygulamaları
Bu makalede açıklanan protokol patates anlayış endoreduplication için araştırmacılar ile önemli bir araç sağlar. Bu gelişme karşısında yumru dokulara zaman seyri ve doğal varyasyon değerlendirilmesi endoreduplication, genetik ve çevresel bileşenlerine çalışmaları için izin verebilir. Sonuçta, endoreduplication patates iyileştirme, güvenilir bir aracı değerlendirme gerektiren bir girişim için umut verici bir hedef yapmak.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Bu araştırma Ulusal Bilim Vakfı Ödülü numarası "Heterozygosity, Allelic kompozisyon ve kopya numarası varyasyon patates çözülüyor" 1237969 tarafından finanse edildi ve USDA özel Grant 2014-34141-22266 (Maine Üniversitesi) için RV
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Serological pipette | Fisher | 13-676-10k | (sterile) |
| Pipet Aid XP (autopipettor) | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| Conical tubes (50 mL) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | (sterile) |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Globe Scientific | 111558 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | Globe Scientific | 111552 | |
| Vacuum filtration unit (0.22 µm)(aPES) | Thermo Fisher Scientific | 564-0020 | (sterile) |
| Vacuum filtration unit (0.45 µm)(aPES) | Thermo Fisher Scientific | 168-0045 | (sterile) |
| Cellulase "Onozuka R-10" | Yakult | contact company | |
| Macerozyme "Onozuka R-10" | Yakult | contact company | |
| Hemicellulase | Sigma | H2125 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| MES buffer | Acros Organics | 172590250 | |
| Triton X-100 | MP Biochemicals | 194854 | |
| Magnesium Chloride (hexahydrate) | Fisher Scientific | M35-500 | |
| Calcium Chloride (dihydrate) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| D-Mannitol | Acros Organics | 423922500 | |
| MOPS | Acros Organics | 17263-0250 | |
| Potassium Phosphate (monobasic, anhydrous) | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | For flow cytometry preparations |
| Ribonuclease A | Sigma-Aldrich | R5000 | For flow cytometry preparations |
| Cork borers with punch | American Scientific | 2093-02 | For sampling desired tissue |
| Forceps | Thermo Fisher Scientific | 16-31 | For smapling desired tissue |
| Scalpel | Thermo Fisher Scientific | 08-920B | For smapling desired tissue |
| 106 µm stainless steel mesh or other seive of same pore size | New Jersey Wire Mesh Co. | contact company |
References
- Wilson, E. The karyoplasmic ratio. 727, 3rd edn, The Macmillan Company. (1925).
- Szymanski, D. B., Marks, M. D. GLABROUS1 overexpression and TRIPTYCHON alter the cell cycle and trichome cell fate in Arabidopsis. Plant Cell. 10 (12), 2047-2062 (1998).
- Melaragno, J. E., Mehrotra, B., Coleman, A. W. Relationship between endopolyploidy and cell size in epidermal tissue of Arabidopsis. Plant Cell. 5 (11), 1661-1668 (1993).
- Grafi, G., Larkins, B. A. Endoreduplication in maize endosperm: involvement of M phase--promoting factor inhibition and induction of S phase--related kinases. Science. 269 (5228), 1262-1264 (1995).
- Schweizer, L., Yerk-Davis, G., Phillips, R., Srienc, F., Jones, R. Dynamics of maize endosperm development and DNA endoreduplication. Proc Natl Acad Sci. 92 (15), 7070-7074 (1995).
- Chen, C. T., Setter, T. L. Response of potato tuber cell division and growth to shade and elevated CO2. Ann Bot. 91 (3), 373-381 (2003).
- Chen, C. T., Setter, T. L. Response of potato dry matter assimilation and partitioning to elevated CO2 at various stages of tuber initiation and growth. Environ Exp Bot. 80, 27-34 (2012).
- Cheniclet, C., et al. Cell expansion and endoreduplication show a large genetic variability in pericarp and contribute strongly to tomato fruit growth. Plant Physiol. 139 (4), 1984-1994 (2005).
- Pirrello, J., et al. How fruit developmental biology makes use of flow cytometry approaches. Cytometry Part A. 85 (2), 115-125 (2014).
- Chevalier, C., et al. Endoreduplication and fruit growth in tomato: evidence in favour of the karyoplasmic ratio theory. J Exp Bot. 65 (10), 2731-2746 (2014).
- Galbraith, D. W., et al. Rapid flow cytometric analysis of the cell cycle in intact plant tissues. Science. 220 (4601), 1049-1051 (1983).
- Doležel, J., Greilhuber, J., Suda, J. Flow Cytometry with Plants: An Overview. Flow Cytometry with Plant Cells. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 41-65 (2007).
- Doležel, J., Bartoš, J. A. N. Plant DNA flow cytometry and estimation of nuclear genome size. Ann Bot. 95 (1), 99-110 (2005).
- Doke, N., Tomiyama, K. Effect of hyphal wall components from Phytophthora infestans on protoplasts of potato tuber tissues. Phys Plant Path. 16 (2), 169-176 (1980).
- Davis, D. A., Currier, W. W. The effect of the phytoalexin elicitors, arachidonic and eicosapentaenoic acids, and other unsaturated fatty acids on potato tuber protoplasts. Physiol Mol Plant Pathol. 28 (3), 431-441 (1986).
- Laimbeer, F. P. E., et al. Protoplast isolation prior to flow cytometry reveals clear patterns of endoreduplication in potato tubers, related species, and some starchy root crops. Plant Methods. 13 (1), 27 (2017).
- Uijtewaal, B. A., Huigen, D. J., Hermsen, J. G. Production of potato monohaploids (2n=x=12) through prickle pollination. Theor Appl Genet. 73 (5), 751-758 (1987).
- Karp, A., Risiott, R., Jones, M. G. K., Bright, S. W. J. Chromosome doubling in monohaploid and dihaploid potatoes by regeneration from cultured leaf explants. Plant Cell Tiss Org Cult. 3 (4), 363-373 (1984).
- Doke, N. Generation of superoxide anion by potato tuber protoplasts during the hypersensitive response to hyphal wall components of Phytophthora infestans and specific inhibition of the reaction by suppressors of hypersensitivity. Phys Plant Path. 23 (3), 359-367 (1983).
- Doke, N., Tomiyama, K. Suppression of the hypersensitive response of potato tuber protoplasts to hyphal wall components by water soluble glucans isolated from Phytophthora infestans. Phys Plant Path. 16 (2), 177-186 (1980).
- Saxena, P. K., King, J. Reuse of enzymes for isolation of protoplasts. Plant Cell Rep. 4 (6), 319-320 (1985).
- Sgorbati, S., Levi, M., Sparvoli, E., Trezzi, F., Lucchini, G. Cytometry and flow cytometry of 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)-stained suspensions of nuclei released from fresh and fixed tissues of plants. Physiol Plant. 68 (3), 471-476 (1986).
- Bhojwani, S. S., Dantu, P. K. Tissue and cell culture. Plant Tissue Culture: An Introductory Text. , Springer. 39-50 (2013).
- Flores, H. E., Kaur-Sawhney, R., Galston, A. W. Protoplasts as Vehicles for Plant Propagation and Improvement. Advances in Cell Culture. Maramorosch, K. 1, Elsevier. 241-279 (1981).
- Reeve, R. M., Timm, H., Weaver, M. L. Parenchyma cell growth in potato tubers I. Different tuber regions. Am Potato J. 50 (2), 49-57 (1973).
- Scholes, D. R., Paige, K. N. Plasticity in ploidy: a generalized response to stress. Trends Plant Sci. 20 (3), 165-175 (2015).
