Summary
在这里,我们描述了一种通用方案和设计,可用于鉴定藏药中复杂的天然产物制剂(基质)中的痕量和微量成分。
Abstract
藏药复杂,含有许多未知化合物,因此对其分子结构的深入研究至关重要。液相色谱-电喷雾电离飞行时间质谱(LC-ESI-TOF-MS)常用于提取藏药;然而,在使用光谱数据库后,仍然存在许多不可预测的未知化合物。本文开发了一种使用离子阱质谱(IT-MS)鉴定藏药成分的通用方法。该方法包括用于样品制备、MS设置、LC预运行、方法建立、MS采集、多阶段MS操作和手动数据分析的标准化和编程方案。采用多阶段碎裂法鉴定藏药 Abelmoschus 种子中的两种代表性化合物,并对典型化合物结构进行了详细分析。此外,本文还讨论了离子模式选择、流动相位调整、扫描范围优化、碰撞能量控制、碰撞模式切换、碎片因素和方法局限性等方面。所开发的标准化分析方法是通用的,可以应用于藏药中的未知化合物。
Introduction
中药微量成分的定性分析已成为研究中的重要课题。由于中药中的化合物数量众多,很难将其分离出来用于核磁共振波谱仪(NMR)或X射线衍射仪(XRD)分析,这使得只需要低样品量的质谱(MS)方法越来越受欢迎。此外,液相色谱(LC)与MS联用近年来已广泛应用于中药研究中,用于改进复杂样品的分离和化合物的定性分析1。一种常用的方法是液相色谱-电喷雾电离飞行时间质谱(LC-ESI-TOF-MS),广泛用于藏药的定性研究2。使用这种方法,复杂组分在LC色谱柱中富集和分离,并使用MS检测器观察加合物离子的质荷比(m / z)。搜索串联 MS(MS/MS 或 MS2)数据库是目前使用四极杆飞行时间 (Q-TOF) MS 和 Orbitrap MS3 进行小分子分析中可靠化合物注释的最快方法。然而,数据库质量差和各种异构体的存在阻碍了未知化合物的鉴定。此外,MS/MS数据库提供的信息仅限于4,5,6,7。使用可广泛应用于其他中药的通用方案研究每种中药中的化合物具有重要意义。
IT-MS通过向环形电极施加不同的射频(RF)电压来捕获各种离子8。IT-MS可以按不同的时间顺序进行时间序列多阶段MS扫描,提供成分多阶段MS(MS n)碎片,其中n是产物离子级数9。线性IT-MS被认为是结构识别的最佳选择,因为它可用于顺序MSn 实验10。目标离子可以分离并积累在线性IT-MS 1中。IT-MS中的MSn (n ≥ 3)比Q-TOF-MS中的MS/MS提供更多的片段信息。由于IT-MS不能锁定目标离子及其碎片离子,因此它是阐明未知化合物(包括异构体1)结构的有力工具。MSn 技术已广泛应用于未知蛋白、多肽和多糖的结构分析11,12。MSn 中碎片离子的丰度水平比Q-TOF-MS中的MS/MS提供更多的复杂样品中靶向化合物的分子碎片信息。因此,将MSn 技术应用于中医的结构鉴定至关重要。
藏医药是中医13的重要组成部分,这些药物主要来源于高原地区14发现的动物、植物和矿物质。藏药Abelmoschus manihot种子(AMS)是Abelmoschus manihot(linn.medicus)的种子。AMS 是一种传统草药,用于治疗特应性皮炎、风湿病和麻风病等疾病。它含有查耳酮,具有抗菌,抗真菌,抗癌,抗氧化和抗炎作用15。本研究改进了MS n程序,并开发了一种使用IT-MS和MSn鉴定藏药AMS化合物结构的详细方法。优化了某些MS参数,包括离子模式、扫描范围和碰撞模式,以克服鉴定痕量化合物的问题。本研究旨在促进中药微量化合物的标准化结构鉴定。
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Protocol
1. 样品制备
- 准确称取 1 g AMS 样品,并将其放入装有 30 mL 80% 甲醇的锥形烧瓶中。将混合物转移到超声浴超声仪中,在25°C下提取30分钟。 将样品以14,000 x g 离心5分钟。
注意:超声波浴超声仪的频率为40 KHz。 - 准备注射器和微孔膜过滤器(0.22μm,仅有机)。将上清液过滤到 2 mL 样品瓶中。
2. 质谱设置
- 打开真空泵的开关。打开氩气缸的主阀和分压阀,将压力调节到约0.3MPa。打开氮气阀。
注意:等待至少8小时,以确保实验条件有足够的真空度。分析前检查氩气和氮气的气体压力是否足够高。 - 启动 MS 控制软件。单击软件面板中的 加热 SEI 源 ,然后输入 MS 参数,包括加热器温度 (350 °C)、护套气体流量 (35 arb)、辅助气体流量 (15 arb)、喷雾电压(正模式为 3.8 KV,负模式为 −2.5 KV)和毛细管温度 (275 °C)。单击 “应用 ”按钮以激活离子源。
3. 液相色谱预运行、方法建立和MS采集
- 分别使用0.1%甲酸水溶液和纯乙腈制备流动相A和流动相B。在超声波浴超声仪中对它们脱气至少15分钟。将溶液分别连接到 A 和 B 流体通道(图 1A)。准备甲醇-水(1:9 v/v)溶液,然后用手将其填充到泵和注射器的清洁液瓶中。
注意:超声波浴超声仪的频率为40 KHz。 - 启动 LC-MS 控制软件。
- 单击 直接控制 按钮以打开 LC 控制面板。在泵模块上以逆时针方向打开吹扫阀(图1B)。
- 单击 “更多选项 ”按钮打开泵设置,并将吹扫参数设置为 5 mLmin−1 ,持续 3 分钟。单击 “清除” 按钮开始去除气泡。随后,关闭吹扫阀。
- 单击主注射 器、洗涤缓冲环和 外部清洗 针按钮,分别冲洗注射器三个周期、一个循环和针头一个周期。将样品瓶放入采样器中(图1C)。
- 单击 仪器设置 按钮以打开方法编辑窗口。单击 “新建 ”按钮以创建新的LC-MS仪器方法。
- 为 LC 方法建立总运行时间。接下来,输入值以在方法编辑窗口中设置压力限值、总流速、流量梯度、样品温度、柱温和就绪温度增量。
注意:流动相的默认总流速恒定为0.3 mL/min,使用50% A和50% B,在没有色谱柱的情况下无柱温。样品温度和就绪温度增量的默认值分别为15°C和0.1°C。其他设置取决于所用液相色谱柱的类型。 - 为 MS 方法选择 常规 MS 或 MSn 实验类型。输入值以配置采集时间、极性、质量范围、分流值数和分流值持续时间。单击 “保存 ”按钮将设置配置为仪器方法。
注意:没有色谱柱的默认设置如下:采集时间,2分钟;极性,正极或负极;质量范围,100 至 1,200;转移值数,2;和转移值持续时间,1.99 分钟。
4. 操作多级质谱
- 单击序列设置按钮以打开 序列 表。
- 在表中,输入以下信息:样品类型、文件名、路径、样品 ID、仪器方法、位置和进样体积。
- 单击“ 保存 ”按钮记录序列表,然后单击 “开始分析 ”按钮实现设置并启动MS采集。
注意:默认样本类型被选为未知。仪器方法是步骤 3.6 中保存的方法。样品瓶放置在样品室中的独特位置。例如, RA1 是样品室中红色区域第一行中的第一个位置。默认进样体积通常为2 μL,这取决于样品的浓度。
- 双击资源管理器中的原始文件,将MS数据加载到数据处理软件中。在基峰色谱图(BPI)中,通过单击并拖动鼠标选择曲线下最大面积(AUC)的区域。相应的MS谱图将显示在同一窗口中。
- 选择目标离子进行下一次MS/MS分析。
- 重新打开方法编辑窗口。在 MSn 设置 表中,将目标离子的m/z设置为 母质量 数列中的小数点后一位。
- 选择碰撞模式,然后输入 碰撞 能量 (CE) 值。设置 MS/MS 扫描范围。单击“ 保存 ”按钮记录 MS 方法,然后在序列表中输入新的文件名。单击 “开始 ”按钮以启动 MS/MS 采集。
注意:MS/MS扫描范围为目标母离子的40%-130%。碰撞诱导解离 (CID) 模式下的默认 CE 值为 35%。
- 双击资源管理器中的原始文件,将 MS/MS 原始文件加载到数据处理软件中。
- 鉴定MS/MS谱图中最强的碎片离子,并将其m/z值输入MSn方法列表中。在 MSn 设置表中,设置 MS3 参数,包括碰撞模式、CE 值和扫描范围。
- 单击“ 保存 ”按钮记录 MS 方法,然后在序列表中输入新的文件名。单击 “开始 ”按钮以启动 MS3 采集。
- 双击资源管理器中的原始文件,将 MS3 原始文件加载到数据处理软件中。重复步骤4.4以获得MS4 频谱。
- 当光谱中未观察到稳定的碎片离子时,完成MSn 实验。
5. 手动MSn 数据分析
- 双击原始文件以打开从MS到MSn的所有质谱。手动计算离子和相应碎片离子之间的m / z差异值。
注:例如,离子(m/z 617.25)与相应碎片离子(m/z 571.28)之间的m/z差值在MS/MS中为45.97,在MS3中离子(m/z 571.28)和相应的碎片离子(m/z 525.38)之间的m/z差值为45.90,离子(m/z 525.38)与相应的碎片离子(m/z 344.93和273.16)之间的m/z差值为180.45和MS4 中的 252.22 分。 - 根据MS4 结果(MSn的最后一级)手动绘制“核心”结构。根据m / z差异值使用官能团或分子片段手动推导出原始结构。根据MSn中的每个分子结构手动绘制分子切割路径。手动分子推导的示例详见代表性结果部分。
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Representative Results
以玻璃二糖为模型,验证了MSn在正离子模式下的可行性。如图2A所示,纤维二糖[C 12 H22O11]+的ESI-MS(正离子模式)在m / z 365处产生质子化分子[M + H]+。[M+H]+ 在 m/z 365 处的产物离子扫描 (CID-MS/MS) 在 m/z 305 处产生第二个碎片离子(图 2B),并使用 MS3 和 MS4 分析对其进行进一步分析(图 2C,D)。MS3 分析在 m/z 254 处产生第三个碎片离子,MS4 分析在 m/z 185 处产生第四个碎片离子。MS/MS分析(图2E)显示,m/z 60处丢失的碎片离子表明m/z 365处的离子碎裂序列,即开环水解(蓝色标记)、C-C键裂解(红色标记)和脱水(绿色标记)。同样,MS3分析显示,m/z 60处丢失的碎片离子表明m/z 305处离子的C-C键裂解(标记为红色)。MS4分析表明,在m/z 60处丢失的碎片离子意味着水解(蓝色标记)和脱水(绿色标记),导致离子与m / z 245裂解为具有m / z 185的离子。MSn分析中的阶梯断裂表明该方法可用于研究碳水化合物的结构。
使用LC-Q-TOF-MS对AMS进行的初步定性分析揭示了许多未知化合物的存在。其中一种是m/z 617处的离子,被选中在负模式下进行MSn分析。在AMS中m/z 617处的[M-H]−的产物离子扫描(CID-MS/MS)在m/z 571处产生了第二个碎片离子。该碎片离子的MS3分析在m / z 525处产生第三个碎片离子,MS4分析在m / z 345和273处产生第四个碎片离子(图3A-D)。m/z 571的MS3在m/z 525处通过CH2OH部分作为甲醇(-32 Da)和OH部分(-18 Da)作为水的损失而产生碎片离子。这些MS4结果用于手动鉴定化合物的“核心”结构,并通过比较离子及其碎片离子的m / z值来确定其原始结构。化合物在m / z 617处的分子结构及其在MSn中的裂解路径如图3E所示。使用MSn在阳性模式下分析m / z 365处的另一种未知化合物。在AMS中m/z 365处的[M+H]+离子的产物离子扫描(CID-MS/MS)在m/z 299、m/z 329和m/z 347处产生第二个碎片离子。对这些碎片离子的MS3分析在m / z 231处产生了第三个碎片离子(图4A-C)。化合物在m/z 365处的分子结构和裂解机理如图4E所示。
图1:使用IT-MS和多级质谱分析鉴定藏药中的未知化合物结构 。 (A)液相色谱用流动相。(二)液相色谱泵。(三)样板室。(D) MS 的离子源。 (E) MS 中离子阱模块的内部结构。 (F) MS4 光谱。(G)来自MS4 结果的分子结构信息。 请点击此处查看此图的大图。
图 2:正离子模式下 通过 IT-MS 对纤维二糖进行多级碎裂 。 (A)纤维二糖的原始质谱。(B) MS/MS光谱中的碎片离子。(C) MS3 光谱中的碎片离子。(D) MS4 光谱中的碎片离子。(五)纤维二糖的裂解机理和分子结构。 请点击此处查看此图的大图。
图 3:在负离子模式下 通过 IT-MS 对 m/z 617 处未知 AMS 化合物离子的多级碎裂和结构分析 。 (A) AMS的部分质谱。(B) MS/MS光谱中的碎片离子。(C) MS3 光谱中的碎片离子。(D) MS4 光谱中的碎片离子。(E)ams化合物离子在m/z 617处的切割机理和分子结构。 请点击此处查看此图的大图。
图 4:在正离子模式下 通过 IT-MS 在 m/z 365 处对未知 AMS 化合物离子进行多级碎裂结构分析 。 (A) AMS的部分质谱。(B) MS/MS光谱中的碎片离子。(C) MS3 光谱中的碎片离子。(D)ams化合物离子在m/z 365处的裂解机理和分子结构。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
IT-MS及其MSn 技术为鉴定痕量中药化合物的结构提供了一种新方法。与无法深度识别碎片离子的Q-TOF-MS不同,采用MSn 技术的IT-MS因其分离和积累离子的能力而表现出色。本文概述了一种使用IT-MS和MSn 技术鉴定藏药中痕量化合物的方法。该方法利用MS n中的n 值来确定所提供的碎片离子信息的量。该方法的关键步骤包括选择合适的扫描范围和调整CE值,从而鉴定有价值的碎片。
通常,糖类的MSn分析最好在正离子模式16下进行,而酚酸和生物碱最好在负离子模式下进行分析。通过使用甲酸、乙酸和乙酸铵17等添加剂调节流动相,可以改善ESI源中化合物的响应。对于极性较弱的化合物,可以考虑使用常压化学电离源。选择合适的扫描范围可以增加碎片离子的强度,这对MS n的下一阶段是有益的,因为每个MSn中不可避免的能量衰减。碎片离子的m/z应位于扫描范围的中心区域,以获得最佳的相应强度。如果离子具有双电荷或多个电荷,则可以通过在碎裂过程中减小电荷数来获得具有较高m / z值的碎片离子。在这种情况下,扫描范围的结束m/z应设置为更大。CID 模式适用于 MSn 分析中的大多数化合物18。如果碎片离子的强度不足,CE值一次可以增加5%。当MSn中有多个复杂的碎片离子时,需要较低的CE值来控制离子解离。脉冲Q碰撞诱导解离模式适用于小分子,比CID模式19提供了更详细的低分子量碎片离子信息。电子转移解离(ETD)模型在肽断裂和蛋白质鉴定中占主导地位,但很少用于鉴定TCM成分20。ETD模式可用于研究含有二硫键的未知化合物21。
尽管与其他MS技术相比,MSn 方法在结构鉴定方面具有许多优势,但仍存在一些局限性。首先,没有一种碰撞模式适用于所有中药化合物。合理选择碰撞方式和手动调节碰撞能量可以改善碎片离子。此外,使用MSn 方法很难区分具有复杂异构体的大分子中官能团的位置。鉴定官能团位点是一项具有挑战性的任务,需要经验丰富的研究人员。手动后分析和较长的MSn 数据处理时间也是阻碍研究人员利用这项技术的重大障碍。Q-TOF-MS因其高测量精度、分辨率和数据库易用性而受到研究人员的欢迎。然而,IT-MS是未鉴定离子和痕量离子的良好解决方案,因为它能够分离和积累离子并执行多个分析阶段。Q-TOF和IT-MS的整合可以为中药样品的全定性分析提供最优解。MSn 技术广泛应用于食品、环境科学、医药等领域,随着IT-MS仪器的改进,其在各个领域的普及和使用有望增加。
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Disclosures
作者声明没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作由成都中医药大学杏林人才计划(030058191号)、四川省自然科学基金(2022NSFSC1470)和国家自然科学基金(82204765)资助。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Acetonitrile | Thermo Scientific | CAS 75-05-8 | LC-MS grade |
Formic Acid | Knowles | CAS 64-18-6 | HPLC grade |
Linear ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | LTQ XL | |
liquid chromatograph | Thermo Scientific | U3000 | |
LTQ Tune | Thermo Scientific | version 2.8.0 | MS control software |
Methanol | Thermo Scientific | CAS 67-56-1 | LC-MS grade |
Pure water | Thermo Scientific | CAS 7732-18-5 | LC-MS grade |
Xcalibur | Thermo Scientific | version 2.0 | LC-IT-MS operational software |
References
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