Summary
यहां, हम एक सामान्य प्रोटोकॉल और डिजाइन का वर्णन करते हैं जिसे तिब्बती चिकित्सा में जटिल प्राकृतिक उत्पाद फॉर्मूलेशन (मैट्रिक्स) में ट्रेस मात्रा और मामूली घटकों की पहचान करने के लिए लागू किया जा सकता है।
Abstract
तिब्बती दवाएं जटिल होती हैं और इसमें कई अज्ञात यौगिक होते हैं, जिससे उनकी आणविक संरचनाओं पर गहन शोध महत्वपूर्ण हो जाता है। तरल क्रोमैटोग्राफी-इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण टाइम-ऑफ-फ्लाइट मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-ईएसआई-टीओएफ-एमएस) का उपयोग आमतौर पर तिब्बती दवा निकालने के लिए किया जाता है; हालांकि, स्पेक्ट्रम डेटाबेस का उपयोग करने के बाद कई अप्रत्याशित अज्ञात यौगिक बने रहते हैं। वर्तमान लेख ने आयन ट्रैप मास स्पेक्ट्रोमेट्री (आईटी-एमएस) का उपयोग करके तिब्बती चिकित्सा में घटकों की पहचान करने के लिए एक सार्वभौमिक विधि विकसित की है। विधि में नमूना तैयारी, एमएस सेटिंग, एलसी प्रीरन, विधि स्थापना, एमएस अधिग्रहण, बहु-चरण एमएस ऑपरेशन और मैनुअल डेटा विश्लेषण के लिए मानकीकृत और प्रोग्राम किए गए प्रोटोकॉल शामिल हैं। तिब्बती दवा एबेलमोस्चुस मैनिहोट बीज में दो प्रतिनिधि यौगिकों की पहचान विशिष्ट यौगिक संरचनाओं के विस्तृत विश्लेषण के साथ कई-चरण विखंडन का उपयोग करके की गई थी। इसके अलावा, लेख आयन मोड चयन, मोबाइल चरण समायोजन, स्कैनिंग रेंज अनुकूलन, टकराव ऊर्जा नियंत्रण, टकराव मोड स्विचओवर, विखंडन कारक और विधि की सीमाओं जैसे पहलुओं पर चर्चा करता है। विकसित मानकीकृत विश्लेषण विधि सार्वभौमिक है और तिब्बती चिकित्सा में अज्ञात यौगिकों पर लागू किया जा सकता है।
Introduction
पारंपरिक चीनी चिकित्सा (टीसीएम) में ट्रेस घटकों का गुणात्मक विश्लेषण अनुसंधान में एक महत्वपूर्ण विषय बन गया है। टीसीएम में यौगिकों की उच्च संख्या के कारण, परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोमीटर (एनएमआर) या एक्स-रे डिफ्रेक्टोमीटर (एक्सआरडी) विश्लेषण के लिए उन्हें अलग करना मुश्किल है, जिससे मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) आधारित विधियां जिन्हें केवल कम नमूना वॉल्यूम की आवश्यकता होती है, तेजी से लोकप्रिय हो जाती हैं। इसके अतिरिक्त, एमएस के साथ युग्मित तरल क्रोमैटोग्राफी (एलसी) का व्यापक रूप से जटिल नमूनों के बेहतर पृथक्करण औररासायनिक यौगिकों के गुणात्मक विश्लेषण के लिए हाल के वर्षों में टीसीएम अनुसंधान में उपयोग किया गया है। एक आम विधि तरल क्रोमैटोग्राफी-इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण टाइम-ऑफ-फ्लाइट मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-ईएसआई-टीओएफ-एमएस) है, जिसका व्यापक रूप से तिब्बती चिकित्सा2 पर गुणात्मक अनुसंधान में उपयोग किया जाता है। इस विधि के साथ, जटिल घटकों को एक एलसी कॉलम में समृद्ध और अलग किया जाता है, और एमएस डिटेक्टर का उपयोग करके जोड़ आयनों के द्रव्यमान-से-चार्ज अनुपात (एम / जेड) को देखा जाता है। अग्रानुक्रम एमएस (एमएस / एमएस या एमएस2) डेटाबेस खोजना वर्तमान में क्वाड्रोपोल टाइम-ऑफ-फ्लाइट (क्यू-टीओएफ) एमएस और ऑर्बिटरैप एमएस3 का उपयोग करके छोटे अणु विश्लेषण में आत्मविश्वास यौगिक एनोटेशन के लिए सबसे तेज़ तरीका है। हालांकि, डेटाबेस की खराब गुणवत्ता और विभिन्न आइसोमर्स की उपस्थिति अज्ञात यौगिकों की पहचान में बाधा डालती है। इसके अलावा, MS/MS डेटाबेस द्वारा प्रदान की गई जानकारी सीमित है 4,5,6,7. एक सामान्य प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्रत्येक टीसीएम में रासायनिक यौगिकों की जांच करना महत्वपूर्ण है जिसे अन्य टीसीएम पर व्यापक रूप से लागू किया जा सकता है।
आईटी-एमएस रिंग इलेक्ट्रोड 8 पर विभिन्न रेडियो आवृत्ति (आरएफ) वोल्टेज लागू करके आयनों की एक विस्तृत श्रृंखला को कैप्चरकरता है। आईटी-एमएस विभिन्न कालानुक्रमिक क्रमों में समय-श्रृंखला बहु-चरण एमएस स्कैन कर सकता है, घटक बहु-चरण एमएस (एमएस एन) विखंडन प्रदान करता है, जहांएन उत्पाद आयन चरणों की संख्या9 है। रैखिक आईटी-एमएस को संरचना पहचान के लिए सबसे अच्छा माना जाता है क्योंकि इसका उपयोग अनुक्रमिक एमएसएन प्रयोगों10 के लिए किया जा सकता है। लक्षित आयनों को रैखिक आईटी-एमएस1 में अलग और संचित किया जा सकता है। आईटी-एमएस में एमएस एन (एन ≥ 3) क्यू-टीओएफ-एमएस में एमएस /एमएस की तुलना में अधिक टुकड़ा जानकारी प्रदान करता है। चूंकि आईटी-एमएस लक्ष्य आयन और उसके टुकड़े आयनों को लॉक नहीं कर सकता है, इसलिए यह अज्ञात यौगिकों की संरचना स्पष्टीकरण के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, जिसमें आइसोमर्स1 भी शामिल है। एमएसएन तकनीक को व्यापक रूप से अज्ञात प्रोटीन, पेप्टाइड्स और पॉलीसेकेराइड11,12 के संरचनात्मक विश्लेषण के लिए लागू किया गया है। एमएसएन में टुकड़े आयनों का बहुतायत स्तर क्यू-टीओएफ-एमएस में एमएस /एमएस की तुलना में जटिल नमूनों में लक्षित यौगिकों पर अधिक आणविक टुकड़ा जानकारी प्रदान करता है। इसलिए, टीसीएम में संरचनात्मक पहचान के लिए एमएसएन तकनीक को लागू करना आवश्यक है।
तिब्बती चिकित्सा टीसीएम13 का एक महत्वपूर्ण घटक है, और ये दवाएं मुख्य रूप से पठार क्षेत्र14 में पाए जाने वाले जानवरों, पौधों और खनिजों से प्राप्त होती हैं। तिब्बती दवा एबेलमोस्चुस मैनिहोट सीड्स (एएमएस) एबेलमोस्चुस मैनिहोट (लिन) मेडिकस का बीज है। एएमएस एक पारंपरिक हर्बल दवा है जिसका उपयोग एटोपिक डर्मेटाइटिस, गठिया और कुष्ठ रोग जैसी स्थितियों के इलाज के लिए किया जाता है। इसमें चाल्कोन होता है, जिसमें जीवाणुरोधी, एंटिफंगल, एंटीकैंसर, एंटीऑक्सिडेटिव और विरोधीभड़काऊ प्रभाव होते हैं। वर्तमान अध्ययन में, एमएस एन प्रक्रियाओं में सुधार किया गया था, और आईटी-एमएस और एमएसएन का उपयोग करके तिब्बती दवा एएमएस में यौगिक संरचनाओं की पहचान करने के लिए एक विस्तृत विधि विकसित की गई थी। आयन मोड, स्कैनिंग रेंज और टकराव मोड सहित कुछ एमएस मापदंडों को ट्रेस यौगिकों की पहचान करने में समस्याओं को दूर करने के लिए अनुकूलित किया गया था। इस अध्ययन का उद्देश्य टीसीएम में ट्रेस यौगिकों की मानकीकृत संरचना पहचान को बढ़ावा देना है।
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Protocol
1. नमूना तैयार करना
- एएमएस नमूने के 1 ग्राम का सटीक वजन करें, और इसे 80% मेथनॉल के 30 एमएल के साथ शंक्वाकार फ्लास्क में रखें। 25 डिग्री सेल्सियस पर निष्कर्षण के 30 मिनट के लिए मिश्रण को अल्ट्रासाउंड स्नान सोनिकेटर में स्थानांतरित करें। 5 मिनट के लिए 14,000 x g पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें।
नोट: अल्ट्रासाउंड स्नान सोनिकेटर की आवृत्ति 40 KHz है। - एक इंजेक्शन सिरिंज और एक माइक्रोपोरस झिल्ली फिल्टर (0.22 μm, केवल कार्बनिक) तैयार करें। सतह पर तैरने वाले को 2 एमएल नमूना बोतल में फ़िल्टर करें।
2. एमएस सेटिंग
- वैक्यूम पंप का स्विच चालू करें। आर्गन सिलेंडर और आंशिक दबाव वाल्व के मुख्य वाल्व को खोलें, और दबाव को लगभग 0.3 एमपीए तक समायोजित करें। नाइट्रोजन वाल्व खोलें।
नोट: प्रयोगात्मक स्थितियों के लिए पर्याप्त वैक्यूम डिग्री सुनिश्चित करने के लिए कम से कम 8 घंटे तक प्रतीक्षा करें। जांचें कि विश्लेषण से पहले आर्गन और नाइट्रोजन का गैस दबाव काफी अधिक है। - MS नियंत्रण सॉफ़्टवेयर लॉन्च करें। सॉफ्टवेयर पैनल में हीटेड एसईआई स्रोत पर क्लिक करें, और एमएस पैरामीटर दर्ज करें, जिसमें हीटर तापमान (350 डिग्री सेल्सियस), शीथ गैस प्रवाह दर (35 एआरबी), ऑक्स गैस प्रवाह दर (15 एआरबी), स्प्रे वोल्टेज (सकारात्मक मोड के लिए 3.8 केवी, नकारात्मक मोड के लिए -2.5 केवी), और केशिका तापमान (275 डिग्री सेल्सियस) शामिल हैं। आयन स्रोत को सक्रिय करने के लिए लागू करें बटन पर क्लिक करें।
3. एलसी प्रीरन, विधि स्थापना और एमएस अधिग्रहण।
- क्रमशः 0.1% फॉर्मिक एसिड जलीय घोल और शुद्ध एसिटोनिट्राइल का उपयोग करके मोबाइल चरण ए और मोबाइल चरण बी तैयार करें। उन्हें कम से कम 15 मिनट के लिए एक अल्ट्रासाउंड स्नान सोनिकेटर में रखें। समाधानों को क्रमशः ए और बी द्रव मार्ग से कनेक्ट करें (चित्रा 1 ए)। एक मेथनॉल-पानी (1: 9 वी / वी) समाधान तैयार करें, और फिर इसे हाथ से पंप और इंजेक्टर की सफाई तरल पदार्थ की बोतलों में भरें।
नोट: अल्ट्रासाउंड स्नान सोनिकेटर की आवृत्ति 40 KHz है। - LC-MS नियंत्रण सॉफ़्टवेयर लॉन्च करें।
- एलसी नियंत्रण कक्ष खोलने के लिए प्रत्यक्ष नियंत्रण बटन पर क्लिक करें। पंप मॉड्यूल (चित्रा 1 बी) पर काउंटरक्लॉकवाइज दिशा में शुद्ध वाल्व खोलें।
- पंप सेटिंग खोलने के लिए अधिक विकल्प बटन पर क्लिक करें, और 3 मिनट के लिए 5 mLmin-1 पर शुद्ध पैरामीटर सेट करें। बुलबुला हटाने शुरू करने के लिए पर्ज बटन पर क्लिक करें। इसके बाद, शुद्ध वाल्व बंद करें।
- प्राइम सिरिंज, वॉश बफर लूप और वॉश नीडल एक्सटर्नली बटन पर क्लिक करें ताकि सिरिंज को तीन चक्रों के लिए कुल्ला किया जा सके, एक चक्र के लिए लूप और एक चक्र के लिए सुई को क्रमशः कुल्ला किया जा सके। नमूना बोतल को नमूने में रखें (चित्रा 1 सी)।
- विधि-संपादन विंडो खोलने के लिए उपकरण सेटअप बटन पर क्लिक करें। एक नई एलसी-एमएस उपकरण विधि बनाने के लिए नया बटन पर क्लिक करें।
- एलसी विधि के लिए कुल रन टाइम स्थापित करें। इसके बाद, विधि-संपादन विंडो में दबाव सीमा, कुल प्रवाह दर, प्रवाह ढाल, नमूना तापमान, स्तंभ तापमान और तैयार तापमान डेल्टा सेट करने के लिए मान दर्ज करें।
नोट: मोबाइल चरण की डिफ़ॉल्ट कुल प्रवाह दर 50% ए और 50% बी के साथ 0.3 एमएल / मिनट पर स्थिर है और क्रोमैटोग्राफिक कॉलम की अनुपस्थिति में कॉलम तापमान के बिना। नमूना तापमान और तैयार तापमान डेल्टा के डिफ़ॉल्ट मान क्रमशः 15 डिग्री सेल्सियस और 0.1 डिग्री सेल्सियस हैं। अन्य सेटिंग्स उपयोग किए गए तरल क्रोमैटोग्राफी कॉलम के प्रकार पर निर्भर करती हैं। - MS विधि के लिए सामान्य MS या MSn प्रयोग प्रकार का चयन करें। अधिग्रहण समय, ध्रुवीयता, द्रव्यमान सीमा, डायवर्ट मान संख्या, और डायवर्ट मान अवधि कॉन्फ़िगर करने के लिए मान दर्ज करें. सेटिंग्स को एक उपकरण विधि के रूप में कॉन्फ़िगर करने के लिए सहेजें बटन पर क्लिक करें।
नोट: क्रोमैटोग्राफी कॉलम के बिना डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स निम्नानुसार हैं: अधिग्रहण समय, 2 मिनट; ध्रुवीयता, सकारात्मक या नकारात्मक; द्रव्यमान सीमा, 100 से 1,200; डायवर्ट मान संख्या, 2; और मान अवधि, 1.99 मिनट डायवर्ट करें।
4. मल्टीपल-स्टेज मास स्पेक्ट्रोमेट्री का संचालन
- अनुक्रम तालिका खोलने के लिए अनुक्रम सेटअप बटन पर क्लिक करें।
- तालिका में, निम्न जानकारी दर्ज करें: नमूना प्रकार, फ़ाइल नाम, पथ, नमूना ID, उपकरण विधि, स्थिति, और इंजेक्शन वॉल्यूम।
- अनुक्रम तालिका रिकॉर्ड करने के लिए सहेजें बटन पर क्लिक करें, और फिर सेटिंग्स को लागू करने और एमएस अधिग्रहण शुरू करने के लिए विश्लेषण प्रारंभ करें बटन पर क्लिक करें।
नोट:: डिफ़ॉल्ट नमूना प्रकार अज्ञात के रूप में चयनित है। उपकरण विधि चरण 3.6 में सहेजी गई विधि है। नमूना बोतल नमूना कमरे में अपने अद्वितीय स्थान पर रखा गया है। उदाहरण के लिए, आरए 1 नमूना कक्ष में लाल क्षेत्र की पहली पंक्ति में पहला स्थान है। डिफ़ॉल्ट इंजेक्शन की मात्रा आमतौर पर 2 μL है, जो नमूने की एकाग्रता पर निर्भर करती है।
- डेटा प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर में एमएस डेटा लोड करने के लिए एक्सप्लोरर में कच्ची फ़ाइल पर डबल-क्लिक करें। बेस पीक क्रोमैटोग्राम (बीपीआई) में, माउस को क्लिक करके और खींचकर वक्र (एयूसी) के तहत अधिकतम क्षेत्र वाले क्षेत्र का चयन करें। संबंधित एमएस स्पेक्ट्रा एक ही विंडो में प्रदर्शित किया जाएगा।
- अगले एमएस / एमएस विश्लेषण के लिए एक लक्षित आयन का चयन करें।
- विधि-संपादन विंडो को पुन: खोलें। MSn सेटिंग तालिका में, लक्षित आयन के m/z को पैरेंट मास कॉलम में एक दशमलव स्थान पर सेट करें।
- टकराव मोड का चयन करें, और टकराव ऊर्जा (CE) मान दर्ज करें। MS/MS स्कैन श्रेणी सेट करें। MS विधि रिकॉर्ड करने के लिए सहेजें बटन पर क्लिक करें, और अनुक्रम तालिका में एक नया फ़ाइल नाम दर्ज करें। एमएस अधिग्रहण शुरू करने के लिए स्टार्ट बटन पर क्लिक करें।
एमएस स्कैन रेंज लक्षित मूल आयन का 40% -130% था। टकराव-प्रेरित पृथक्करण (सीआईडी) मोड में डिफ़ॉल्ट सीई मान 35% है।
- एमएस कच्ची फ़ाइल को डेटा प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर में लोड करने के लिए एक्सप्लोरर में कच्ची फ़ाइल पर डबल-क्लिक करें।
- MS/MS स्पेक्ट्रम में सबसे मजबूत टुकड़ा आयन की पहचान करें, और MSn विधि सूची में इसका m/z मान दर्ज करें। MS n सेटिंग तालिका में, टक्कर मोड, CE मान और स्कैन रेंज सहित MS3 पैरामीटर सेट करें।
- MS विधि रिकॉर्ड करने के लिए सहेजें बटन पर क्लिक करें, और अनुक्रम तालिका में एक नया फ़ाइल नाम दर्ज करें। एमएस3 अधिग्रहण शुरू करने के लिए प्रारंभ बटन पर क्लिक करें।
- डेटा प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर में एमएस3 कच्ची फ़ाइल लोड करने के लिए एक्सप्लोरर में कच्ची फ़ाइल पर डबल-क्लिक करें। MS 4 स्पेक्ट्रम प्राप्त करने के लिए चरण4.4 दोहराएँ।
- एमएसएन प्रयोग को पूरा करें जब स्पेक्ट्रम में कोई स्थिर टुकड़ा आयन नहीं देखा जाता है।
5. मैनुअल एमएसएन डेटा विश्लेषण
- एमएस से एमएसएन तक सभी द्रव्यमान स्पेक्ट्रा खोलने के लिए कच्ची फ़ाइलों पर डबल-क्लिक करें। मैन्युअल रूप से आयन और संबंधित टुकड़े आयनों के बीच एम / जेड अंतर मूल्यों की गणना करें।
नोट: उदाहरण के लिए, आयन (m/z 617.25) और संबंधित खंड आयनों (m/z 571.28) के बीच m/z अंतर मान MS/MS में 45.97 था, आयन (m/z 571.28) और संबंधित खंड आयनों (m/z 525.38) के बीच m/z अंतर मान MS3 में 45.90 था, और आयन (m/z 525.38) के बीच m/z अंतर मान 45.90 था। एमएस4 में क्रमशः 252.22। - मैन्युअल रूप से एमएस 4 परिणामों (एमएसएन का अंतिम स्तर) के अनुसार "कोर" संरचनाखींचें। मैन्युअल रूप से एम / जेड अंतर मान के आधार पर कार्यात्मक समूहों या आणविक खंडों का उपयोग करके मूल संरचना प्राप्त करें। एमएसएन में प्रत्येक आणविक संरचना के अनुसार आणविक दरार पथ को मैन्युअल रूप से खींचें। मैन्युअल आणविक व्युत्पत्ति के उदाहरण प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में विस्तृत हैं।
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Representative Results
सेलोबायोस का उपयोग सकारात्मक आयन मोड में एमएसएन की व्यवहार्यता को सत्यापित करने के लिए एक मॉडल के रूप में किया गया था। जैसा कि चित्र 2ए में दिखाया गया है, सेलोबायोस [सी 12 एच22ओ11] + के ईएसआई-एमएस (सकारात्मक आयन मोड) ने एम / जेड 365 पर प्रोटॉन अणु [एम + एच] + का उत्पादन किया। m/z 365 पर [M+H]+ के उत्पाद आयन स्कैन (CID-MS/MS) के परिणामस्वरूप m/z 305 (चित्रा 2B) पर दूसरा टुकड़ा आयन उत्पन्न हुआ, जिसका आगे MS3 और MS4 विश्लेषण (चित्रा 2C, D) का उपयोग करके विश्लेषण किया गया। एमएस3 विश्लेषण के परिणामस्वरूप एम / जेड 254 पर तीसरा टुकड़ा आयन हुआ, और एमएस4 विश्लेषण के परिणामस्वरूप एम / जेड 185 पर चौथा टुकड़ा आयन हुआ। एमएस /एमएस विश्लेषण (चित्रा 2 ई) से पता चला है कि एम / जेड 60 पर खोए हुए टुकड़े आयन ने एम / जेड 365 पर आयन विखंडन के अनुक्रम का संकेत दिया, अर्थात् रिंग-ओपनिंग हाइड्रोलिसिस (नीले रंग में चिह्नित), सी-सी बॉन्ड क्लीवेज (लाल रंग में चिह्नित), और निर्जलीकरण (हरे रंग में चिह्नित)। इसी तरह, एमएस3 विश्लेषण से पता चला कि एम / जेड 60 पर खोए हुए टुकड़े आयन ने एम / जेड 305 पर एक आयन के सी-सी बॉन्ड दरार (लाल रंग में चिह्नित) का संकेत दिया। एमएस4 विश्लेषण से पता चला है कि एम / जेड 60 पर खोए हुए टुकड़े आयन में हाइड्रोलिसिस (नीले रंग में चिह्नित) और निर्जलीकरण (हरे रंग में चिह्नित) निहित है, जिसके परिणामस्वरूप एम / जेड 245 के साथ आयन की दरार एम / जेड 185 के साथ आयन में होती है। एमएसएन विश्लेषण में चरण फ्रैक्चर ने संकेत दिया कि यह विधि कार्बोहाइड्रेट की संरचना की जांच के लिए संभव थी।
एलसी-क्यू-टीओएफ-एमएस का उपयोग करके एएमएस के प्रारंभिक गुणात्मक विश्लेषण ने कई अज्ञात यौगिकों की उपस्थिति का खुलासा किया। इनमें से एक, m/z 617 पर एक आयन, नकारात्मक मोड में एमएसएन विश्लेषण के लिए चुना गया था। एएमएस में m/z 617 पर [M-H]− के उत्पाद आयन स्कैन (CID-MS/MS) ने m/z 571 पर एक दूसरा टुकड़ा आयन उत्पन्न किया। इस टुकड़े आयन के एमएस 3 विश्लेषण ने एम / जेड 525 पर एक तीसरा टुकड़ा आयन उत्पन्न किया, और एमएस4 विश्लेषण ने एम / जेड 345 और 273 (चित्रा 3 ए-डी) पर चौथे टुकड़े आयनों का उत्पादन किया। m/z 571 के MS3 ने CH2 OH भाग को मेथनॉल (−32DA) और OH भाग (−18 DA) को पानी के रूप में खोने से m/z 525 पर एक टुकड़ा आयन प्रदान किया। इन एमएस4 परिणामों का उपयोग यौगिक की "कोर" संरचना की मैन्युअल पहचान के लिए किया गया था, और इसकी मूल संरचना आयन और इसके टुकड़े आयनों के एम / जेड मूल्यों की तुलना करके निर्धारित की गई थी। m/z 617 पर यौगिक की आणविक संरचना और MSn में इसके दरार पथ चित्र 3E में दिखाए गए हैं। एम / जेड 365 पर एक और अज्ञात यौगिक का एमएसएन का उपयोग करके सकारात्मक मोड में विश्लेषण किया गया था। एएमएस में m/z 365 पर [M+H]+ आयन के उत्पाद आयन स्कैन (CID-MS/MS) ने m/z 299, m/z 329 और m/z 347 पर दूसरे खंड आयन ों का उत्पादन किया। इन टुकड़े आयनों के एमएस3 विश्लेषण ने एम / जेड 231 (चित्रा 4 ए-सी) पर एक तीसरा टुकड़ा आयन उत्पन्न किया। m/z 365 पर यौगिक की आणविक संरचना और दरार तंत्र चित्र 4E में दिखाया गया है।
चित्रा 1: आईटी-एमएस और मल्टीपल-स्टेज मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण का उपयोग करके तिब्बती चिकित्सा में अज्ञात यौगिक संरचनाओं की पहचान करना। (ए) तरल क्रोमैटोग्राफी के लिए मोबाइल चरण। (बी) तरल क्रोमैटोग्राफी पंप। (सी) नमूना कक्ष। (ई) एमएस में आयन ट्रैप मॉड्यूल की आंतरिक संरचना(एफ) एमएस 4 स्पेक्ट्रम। (जी) एमएस4 परिणामों से आणविक संरचना की जानकारी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: सकारात्मक आयन मोड में आईटी-एमएस के माध्यम से सेलोबायोस का बहु-चरण विखंडन। (ए) सेलोबायोस का मूल द्रव्यमान स्पेक्ट्रम। (बी) एमएस / एमएस स्पेक्ट्रम में टुकड़े आयन। (सी) एमएस3 स्पेक्ट्रम में टुकड़े आयन। (डी) एमएस4 स्पेक्ट्रम में टुकड़े आयन। (ई) सेलोबायोस की दरार तंत्र और आणविक संरचना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: नकारात्मक आयन मोड में आईटी-एमएस के माध्यम से एम / जेड 617 पर अज्ञात एएमएस यौगिक आयन का बहु-चरण विखंडन और संरचनात्मक विश्लेषण । (ए) एएमएस का आंशिक द्रव्यमान स्पेक्ट्रम। (बी) एमएस / एमएस स्पेक्ट्रम में टुकड़े आयन। (सी) एमएस3 स्पेक्ट्रम में टुकड़े आयन। (डी) एमएस4 स्पेक्ट्रम में टुकड़े आयन। (ई) एम / जेड 617 पर एएमएस यौगिक आयन की दरार तंत्र और आणविक संरचना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: सकारात्मक आयन मोड में आईटी-एमएस के माध्यम से एम / जेड 365 पर अज्ञात एएमएस यौगिक आयन का बहु-चरण विखंडन संरचनात्मक विश्लेषण । (ए) एएमएस का आंशिक द्रव्यमान स्पेक्ट्रम। (बी) एमएस / एमएस स्पेक्ट्रम में टुकड़े आयन। (सी) एमएस3 स्पेक्ट्रम में टुकड़े आयन। (डी) एम / जेड 365 पर एएमएस यौगिक आयन की दरार तंत्र और आणविक संरचना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
आईटी-एमएस और इसकीएमएसएन तकनीक ट्रेस टीसीएम यौगिकों की संरचना की पहचान करने के लिए एक नया दृष्टिकोण प्रदान करती है। क्यू-टीओएफ-एमएस के विपरीत, जो टुकड़े आयनों की गहराई से पहचान नहीं कर सका, एमएसएन तकनीक के साथ आईटी-एमएस आयनों को अलग करने और जमा करने की क्षमता के कारण उत्कृष्टता प्राप्त करता है। यह लेख आईटी-एमएस और एमएसएन तकनीक का उपयोग करके तिब्बती चिकित्सा में ट्रेस यौगिकों की पहचान करने के लिए एक विधि को रेखांकित करता है। विधि प्रदान की गई टुकड़ा आयन जानकारी की मात्रा निर्धारित करने के लिए एमएस एन मेंएन मान का उपयोग करती है। इस पद्धति में महत्वपूर्ण चरणों में उपयुक्त स्कैन रेंज का चयन करना और सीई मान को समायोजित करना शामिल है, जिससे मूल्यवान टुकड़ों की पहचान होती है।
सामान्य तौर पर, सैकराइड का एमएसएन विश्लेषण सकारात्मक आयन मोड16 में सबसे अच्छा प्रदर्शन किया जाता है, जबकि फेनोलिक एसिड और एल्कलॉइड का नकारात्मक आयन मोड में सबसे अच्छा विश्लेषण किया जाता है। ईएसआई स्रोत में यौगिक की प्रतिक्रिया को फॉर्मिक एसिड, एसिटिक एसिड और अमोनियम एसीटेट17 जैसे एडिटिव्स के साथ मोबाइल चरण को समायोजित करके बेहतर बनाया जा सकता है। कमजोर ध्रुवीयता वाले यौगिकों के लिए एक वायुमंडलीय-दबाव रासायनिक आयनीकरण स्रोत पर विचार किया जा सकता है। एक उपयुक्त स्कैन रेंज चुनने से टुकड़े आयनों की तीव्रता बढ़ सकती है, जो प्रत्येक एमएसएन में अपरिहार्य ऊर्जा क्षय के कारण एमएसएन के अगले चरण के लिए फायदेमंद है। टुकड़ा आयन का एम / जेड स्कैनिंग रेंज के मध्य क्षेत्र में स्थित होना चाहिए ताकि सर्वोत्तम संबंधित तीव्रता प्राप्त की जा सके। यदि किसी आयन में दोगुना या एकाधिक आवेश होते हैं, तो विखंडन के दौरान आवेश संख्या को कम करके उच्च m/z मान वाले टुकड़े आयन प्राप्त किए जा सकते हैं। इस मामले में, स्कैनिंग रेंज के अंतिम m/z को बड़ा होने के लिए सेट किया जाना चाहिए। सीआईडी मोड एमएसएन विश्लेषण18 में अधिकांश यौगिकों के लिए उपयुक्त है। यदि टुकड़ा आयन की तीव्रता अपर्याप्त है, तो सीई मान को एक समय में 5% तक बढ़ाया जा सकता है। जब एमएसएन में कई, जटिल टुकड़े आयन होते हैं, तो आयन पृथक्करण को नियंत्रित करने के लिए कम सीई मान की आवश्यकता होती है। स्पंदित-क्यू टकराव-प्रेरित पृथक्करण मोड, जो छोटे अणुओं के लिए उपयुक्त है, सीआईडी मोड19 की तुलना में कम-आणविक भार टुकड़े आयनों के बारे में अधिक विस्तृत जानकारी प्रदान करता है। इलेक्ट्रॉन स्थानांतरण पृथक्करण (ईटीडी) मॉडल पेप्टाइड फ्रैक्चर और प्रोटीन पहचान में प्रमुख है, लेकिन टीसीएम घटकों20 की पहचान करने के लिए शायद ही कभी उपयोग किया जाता है। ईटीडी मोड का उपयोग डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड21 युक्त अज्ञात यौगिकों की जांच के लिए किया जा सकता है।
यद्यपि एमएसएन विधि में अन्य एमएस तकनीकों की तुलना में संरचनात्मक पहचान के लिए कई फायदे हैं, फिर भी कुछ सीमाएं हैं। सबसे पहले, टक्कर मोड में से कोई भी सभी टीसीएम यौगिकों के लिए उपयुक्त नहीं है। टकराव मोड का एक उचित विकल्प और टकराव ऊर्जा का मैनुअल समायोजन टुकड़ा आयनों में सुधार कर सकता है। इसके अलावा, एमएसएन विधि के साथ, जटिल आइसोमर्स के साथ बड़े अणुओं में कार्यात्मक समूहों की स्थिति को अलग करना मुश्किल है। कार्यात्मक समूह साइटों की पहचान करना एक चुनौतीपूर्ण कार्य है जिसके लिए अनुभवी शोधकर्ताओं की आवश्यकता होती है। मैनुअल पोस्ट-विश्लेषण और लंबे एमएसएन डेटा प्रोसेसिंग समय भी महत्वपूर्ण बाधाएं हैं जो शोधकर्ताओं को इस तकनीक का उपयोग करने से हतोत्साहित करती हैं। क्यू-टीओएफ-एमएस अपनी उच्च माप सटीकता, रिज़ॉल्यूशन और डेटाबेस के साथ उपयोग में आसानी के कारण शोधकर्ताओं के बीच लोकप्रिय है। हालांकि, आईटी-एमएस आयनों को अलग करने और जमा करने और विश्लेषण के कई चरणों को करने की क्षमता के कारण अज्ञात आयनों और ट्रेस आयनों के लिए एक अच्छा समाधान है। क्यू-टीओएफ और आईटी-एमएस का एकीकरण टीसीएम नमूनों के पूर्ण गुणात्मक विश्लेषण के लिए एक इष्टतम समाधान प्रदान कर सकता है। एमएसएन प्रौद्योगिकी का व्यापक रूप से खाद्य, पर्यावरण विज्ञान और चिकित्सा जैसे क्षेत्रों में उपयोग किया जाता है, और आईटी-एमएस इंस्ट्रूमेंटेशन के सुधार के साथ विभिन्न क्षेत्रों में इसकी लोकप्रियता और उपयोग बढ़ने की उम्मीद है।
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Disclosures
लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा नहीं की है।
Acknowledgments
इस काम को टीसीएम के चेंगदू विश्वविद्यालय (नंबर 030058191), सिचुआन के नेचर साइंस फाउंडेशन (2022 एनएसएफएससी 1470), और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (82204765) के जिंगलिन प्रतिभा कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Thermo Scientific | CAS 75-05-8 | LC-MS grade |
| Formic Acid | Knowles | CAS 64-18-6 | HPLC grade |
| Linear ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | LTQ XL | |
| liquid chromatograph | Thermo Scientific | U3000 | |
| LTQ Tune | Thermo Scientific | version 2.8.0 | MS control software |
| Methanol | Thermo Scientific | CAS 67-56-1 | LC-MS grade |
| Pure water | Thermo Scientific | CAS 7732-18-5 | LC-MS grade |
| Xcalibur | Thermo Scientific | version 2.0 | LC-IT-MS operational software |
References
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