用于神经递质光学检测的细胞型神经递质荧光工程报告系统（CNiFERs）的构建 体内

本视频的总体目标是介绍基于细胞的神经递质荧光报告系统（CNiFERs）的构建与检测方法，该系统可用于在活体中光学监测特定神经递质的释放。该方法有助于解答神经科学领域中关于脑内神经调质释放时间及其动态过程的关键问题。该技术的主要优势在于，其可针对任何通过G蛋白偶联受体（GPCS）信号通路发挥作用的神经递质或神经调质进行适配。

该方法的区域性示范具有重要意义。体内注射以及随后对CNiFERs的成像在技术上具有挑战性。开始此操作前，请参见T-25培养瓶中的HEK293细胞，这些细胞含有基于前端的钙离子检测器和嵌合G蛋白。

然后，将细胞在37摄氏度、含5% CO2的湿润化培养箱中培养，直至细胞汇合度达到约50%。随后，吸除T-25培养瓶中的培养基。加入2毫升慢病毒培养基混合液，将T-25培养瓶置于37摄氏度、含5% CO2的条件下继续培养。

第二天，加入一毫升胰蛋白酶消化，收获感染的 HEK293 细胞。随后将细胞沉淀重悬于五毫升 HEK293 生长培养基中。取一毫升细胞接种至 T-75 培养瓶中用于冻存保存，另取 1.5 毫升细胞接种至 T-25 培养瓶中用于 FACS 分析。

对于10点激动剂浓度曲线，为检测感染的细胞，将纤维连接蛋白包被的96孔板的前两行每孔加入100微升细胞悬液进行接种。随后，将培养于T-25培养瓶、T-75培养瓶和96孔板中的HEK293细胞在37°C、5%CO₂条件下孵育一至两天，直至细胞融合度达到约90%。在进行FACS分析前，通过制备包含10个不同激动剂浓度（围绕预测EC50值）的药物板，以确定GPCR的功能性表达。

使用倍比稀释法配制不同浓度的激动剂，并创建模板以记录药物浓度。接下来，将酶标仪温度设置为37摄氏度。然后，对96孔荧光酶标仪进行编程，以检测FRET信号并执行溶液转移操作。

使用基因编码的基于FRET的钙离子传感器TN-XXL测量FRET时，将激发波长设置为436 ± 4.5 纳米。随后，为ECFP和黄色荧光蛋白（citrine）设置发射滤光片和截止滤光片。接下来，编程酶标仪每4秒检测一次荧光发射信号，共检测180秒。

从三倍化合物板中选择100微升板体积、150微升移液高度以及递送50微升药物的选项。将药物递送的时间点设置为30秒。随后，吸出A行和B行中的培养基，并向约90%融合的96孔sniffer板中加入100微升ACSF。

然后，将三倍药物板和96孔进样板放入酶标仪中。在启动程序前，让酶标板在37摄氏度下平衡30分钟。酶标仪运行结束后，将荧光读数导出至文本文件中。

然后，将此文件导入先前创建的电子表格模板中，该模板可将荧光强度归一化至刺激前基线，计算每种激动剂浓度下的峰值 FRET 比值，并生成剂量-反应曲线。通过将玻璃毛细管置于垂直电极拉制仪上，制备 CNiFER 注射移液管。使用一对镊子将电极尖端折断至直径约为 40 微米。

将一块浸有ACSF的海绵放置在已麻醉小鼠颅骨上预先制备的2×3毫米薄颅窗上，以保持湿润，同时准备用于注射的细胞。接着，收获在T-75培养瓶中生长至约80%融合度的CNiFER克隆细胞。吸除培养基，并用无菌PBS洗涤细胞。

吸除 PBS，加入 10 毫升 ACFS 以使细胞从培养瓶底部脱落。随后吹打混匀，使细胞团块分散。在细胞培养离心机中离心 2 分钟。

吸除上清液，将沉淀重悬于 100 微升 ACSF 中。随后，以 1400 ×g 离心 30 秒，吸除上清液，保留覆盖有 ACSF 的沉淀。之后，用矿物油回填注射移液管。

将移液管安装到纳米注射仪上。在小鼠准备区域附近的塑料石蜡膜条上放置5 µL CNiFER细胞悬液。用拉制的移液管吸取CNiFER细胞。

现在，将移液管移动至目标的 x 和 y 坐标位置。降低移液管，刺穿此前已处理变薄的颅骨。继续下移至颅骨表面以下约 200 到 400 微米处，即大脑皮层的第二层和第三层。

使用纳米注射器在最深位置注射 4.6 纳升 CNiFER 细胞。注意观察油相与细胞界面的移动，随后等待五分钟，使细胞充分释放。

将移液管回撤约 100 微米，再次注入 4.6 纳升 CNiFER 细胞，然后等待五分钟。随后，缓慢轻柔地撤出移液管，以防止 CNiFER 细胞回流。在此步骤中，将固定头部的小鼠连同成像平台一起置于双光子成像显微镜的 10 倍水浸物镜下。

插入用于FRET成像的滤光立方体，该立方体配备505纳米的二向色镜，以及用于检测ECFP的460纳米至500纳米带通滤光片和用于检测citrine的520纳米至560纳米带通滤光片。然后，向含有减薄颅窗的孔中加入ACSF，并将10倍水浸物镜浸入ACSF中。结合汞灯和GFP滤光立方体，使用目镜定位CNiFERs。

现在切换到40倍水浸物镜。接着，选择适合双光子成像的光路。打开近红外飞秒脉冲激光器。

选择820纳米的波长，功率设置为5%至15%。将PMT一和PMT二的电压设置为亚最大值，通常为500–1000伏特，具体取决于PMT。然后将每个通道的增益设置为1，并将物镜的Z轴位置归零。将物镜从皮层表面降低约100至200微米，然后开始XY扫描。

调节每个通道的激光功率、增益和光电倍增管（PMT）电压，以优化CNiFER荧光的信噪比。接下来，使用软件将成像区域限定为包含CNiFER细胞的区域以及一个背景区域。选择Cowman线，设置平均次数为2，以获得合适的信噪比，并采用每像素4微秒、扫描速率为3至1赫兹的设置。

随后，在CNiFER细胞周围绘制一个感兴趣区域（ROI），每层包含大约三到四个细胞。设置对ROI的平均荧光强度进行实时分析。

然后，开始采集以随时间监测 CNiFER 荧光，并启动电刺激或行为学实验，同时监测 FRET。在此示例中，D2R CNiFER 的 FRET 反应通过带溶液递送系统的酶标仪进行测量。该图显示了多巴胺施加至 D2 CNiFER 期间的 FRET 反应。

请注意，随着多巴胺浓度增加，ECFP 的发射光减弱，而锦黄色荧光蛋白（citrine）的发射光增强。此处展示的是相应的 FRET 比值图。图中显示了 D2 CNiFERs 对多巴胺和去甲肾上腺素的剂量反应曲线。

此外，还展示了缺乏 D2R 的响应性对照 CNiFER。该柱状图显示了其他神经递质和调节剂在 50 纳摩尔和 1 微摩尔浓度下的 fret 比值响应。在此，对黑质中的多巴胺能神经元进行电刺激，可引起 D2 CNiFER 的 fret 比值发生显著变化。

注意观察反应幅度如何随着电刺激强度的增加而增强。将刺激与可卡因注射相结合可增强CNiFER的反应。观看本视频后，您应充分了解如何构建、测试和使用CNiFER进行活体成像。

在CNiFERs细胞的整个研发过程中，必须始终保持无菌操作技术，因为这些细胞最终将被植入活体小鼠体内。CNiFERs的实现为神经科学领域的研究提供了一种重要工具，可用于光学检测任何通过G蛋白偶联受体传递信号的神经递质或神经调质的释放。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。