Name: 构建基于细胞的神经递质荧光工程记者（CNiFERs）神经递质的光学检测在体内 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: 了解利用HEK293细胞构建CNiFERs的方法，用于在体光学监测神经递质释放动态。该技术可适配多种GPCR信号神经调质，为神经科学研究提供实时成像工具。

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我们感谢加利福尼亚大学旧金山分校的 B. Conklin 提供 Gqi5 和 Gqs5 cDNA、A. Schweitzer 在电子设备方面的协助、N. Taylor 在克隆筛选方面的协助、Ian Glaaser 和 Robert Rifkin 的校对，以及 Olivier Griesbeck 提供的 TN-XXL。本研究得到了美国国家药物滥用研究所（NIDA）（DA029706；DA037170）、国家生物医学成像与生物工程研究所（NIBIB）（EB003832）、罗氏公司（Hoffman-La Roche）（88610A）的科研基金资助。 &#34;与滥用药物相关的神经科学&#34; 通过NIDA获得的培训资助（DA007315）。

<ol><li>Day, J. C., Kornecook, T. J., Quirion, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+in+vivo.+microdialysis+to+the+study+of+cholinergic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Application of in vivo. microdialysis to the study of cholinergic systems.</a> Methods. 23, 21-39 (2001).</li>
<li>Robinson, D. L., Venton, B. J., Heien, M. L., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+subsecond+dopamine+release+with+fast-scan+cyclic+voltammetry+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Detecting subsecond dopamine release with fast-scan cyclic voltammetry in vivo.</a> Clin Chem. 49, 1763-1773 (2003).</li>
<li>Liang, R., Broussard, G. J., Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Chemical+Neurotransmission+with+Genetically+Encoded+Fluorescent+Sensors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Imaging Chemical Neurotransmission with Genetically Encoded Fluorescent Sensors.</a> ACS Chem Neurosci. , (2015).</li>
<li>Okubo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+extrasynaptic+glutamate+dynamics+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Imaging extrasynaptic glutamate dynamics in the brain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 6526-6531 (2010).</li>
<li>Marvin, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+fluorescent+probe+for+visualizing+glutamate+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission.</a> Nat Methods. 10, 162-170 (2013).</li>
<li>Nguyen, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+biosensor+for+neurotransmitter+release+and+in+situ+receptor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An in vivo biosensor for neurotransmitter release and in situ receptor activity.</a> Nat Neurosci. 13, 127-132 (2010).</li>
<li>Muller, A., Joseph, V., Slesinger, P. A., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+reporters+reveal+in+vivo+dynamics+of+dopamine+and+norepinephrine+release+in+murine+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell-based reporters reveal in vivo dynamics of dopamine and norepinephrine release in murine cortex.</a> Nat Methods. 11, 1245-1252 (2014).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J Vis Exp. , e3998(2012).</li>
<li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Lentivirus production.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Conklin, B. R., Farfel, Z., Lustig, K. D., Julius, D., Bourne, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substitution+of+three+amino+acids+switches+receptor+specificity+of+Gq%CE%B1+to+that+of+Gj%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gqα to that of Gjα.</a> Nature. 363, 274-276 (1993).</li>
<li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat Protoc. 1, 3166-3173 (2006).</li>
<li>Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polished+and+reinforced+thinned-skull+window+for+long-term+imaging+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Drew, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nat Methods. 7, 981-984 (2010).</li>
<li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+as+a+tool+to+study+blood+flow+and+neurovascular+coupling+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 32, 1277-1309 (2012).</li>
<li>Yamauchi, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+ligand-gated+ion+channel+receptors+with+genetically+encoded+Ca2%2B+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterizing ligand-gated ion channel receptors with genetically encoded Ca2+ sensors.</a> PLoS One. 6, e16519(2011).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat Methods. 2, 932-940 (2005).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
<li>Cui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+activation+of+striatal+direct+and+indirect+pathways+during+action+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Concurrent activation of striatal direct and indirect pathways during action initiation.</a> Nature. 494, 238-242 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

CNiFERs 的创建为光学检测脑内神经递质的释放提供了一种创新且独特的方法 体内CNiFERs 非常适合用于测量突触外释放， 即，体积传导，用于神经递质。重要的是，每种CNiFER都具有天然G蛋白偶联受体（GPCR）的特性，可对脑内神经递质量变提供生理性的光学测量。迄今为止，已开发出用于检测乙酰胆碱的CNiFER（M1-CNiFER）6，多巴胺（D2-CNiFER）7 和去甲肾上腺素（α1a-CNiFER）7.
原则上，任何通过G蛋白偶联受体（GPCR）传递信号的神经递质均可构建相应的CNiFER。对于GPCR通过G蛋白介导信号传导的情况q G蛋白，无需对HEK293细胞进行进一步修饰。通过G蛋白介导信号的GPCR输入/输出，然而，需要共表达一种Gqi5 嵌合G蛋白将GPCR与G蛋白偶联q/PLC 信号通路7,10同样，通过G蛋白偶联受体（GPCRs）介导G蛋白信号通路的...

要充分理解神经元在大脑中如何进行通信，必须具备一种能够检测神经递质释放的方法。 体内有几种成熟的技术可用于神经递质的测定 体内一种常用的技术是微透析法，即将套管插入脑内，收集少量脑脊液，并采用高效液相色谱结合电化学检测进行分析。1微透析的空间分辨率在探针直径的数倍范围内。 例如，对于直径为200 μm的微探针，空间分辨率约为0.5 mm。然而，该技术的时间分辨率较低，因为采样间隔通常持续约5分钟或更长1此外，分析并非实时进行。另一种技术是快速扫描循环伏安法（FSCV），该技术使用插入脑内的碳纤维探针。FSCV具有优异的时间分辨率（亚秒级）、高灵敏度（纳摩尔级）以及借助探针实现的空间分辨率&#160;直径为5至30 μm。然而，快速扫描循环伏安法（FSCV）仅限于检测那些在碳电位探针上能产生特征性氧化和还原电压曲线的神经递质2.
测量神经递质的第三种技术是通过基因编码的神经递质（NT）生物传感器直接检测3通过该方法，可创建一种融合蛋白，该蛋白包含一个与荧光共振能量转移（FRET）荧光基团对偶联的神经递质配体结合域。4 或一种重排的GFP5与前两种方法不同，这些生物传感器是基因编码的，可通过转基因动物的制备或利用病毒载体急性感染细胞，使其在宿主细胞（如神经元）表面表达。迄今为止，基因编码的生物传感器仅针对谷氨酸和GABA的检测得到开发。3-5这些技术的局限性在于灵敏度较低，处于纳摩尔（nM）范围。&#160;以及无法将检测范围扩展到大量神经递质， 例如，经典神经递质、神经肽和通过G蛋白偶联受体（GPCRs）介导信号传导的神经调质。事实上，人类基因组中包含近800个GPCRs。
为解决这些不足，我们开发了一种创新工具，可光学检测任何通过G蛋白偶联受体（GPCR）信号通路释放的神经递质。CNiFERs（基于细胞的神经递质荧光工程报告细胞）是经基因工程改造的单克隆HEK293细胞，可表达特定的GPCR，当其被激活时，会触发细胞内[Ca²⁺]浓度升高2+]，该信号由基于FRET的遗传编码钙指示剂检测2+ 传感器，TN-XXL。因此，CNiFERs 将神经递质受体结合转化为荧光信号的变化，从而对局部神经递质活性提供直接且实时的光学读出。通过利用特定神经递质的天然受体，CNiFERs 保留了内源性表达受体的化学特异性、亲和力以及时间动力学特性. 迄今为止，我们已开发出三种类型的 CNiFER，一种利用 M1 受体检测乙酰胆碱，一种利用 D2 受体检测多巴胺，另一种利用 α1a 受体检测去甲肾上腺素。6,7CNiFER 技术具有良好的可扩展性和可放大性，适用于任何类型的 GPCR。在本 JoVE 文章中，我们描述并展示了设计、实现和测试该技术的方法学 体内 适用于任何应用的CNiFERs。

<table><tbody><tr><td>pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro&amp;nbsp;</td><td>System Biosciences</td><td>CD510B-1</td><td>克隆：用于生成慢病毒</td></tr><tr><td>12 x 75 毫米 BD Falcon 高透明度聚丙烯圆底试管</td><td>BD 生物科学</td><td>352063</td><td>FACS</td></tr><tr><td>BD 40 μm Falcon 细胞滤网</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td>FACS</td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶 EDTA&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td>FACS</td></tr><tr><td>96孔板，平底，透明&amp;nbsp;</td><td>康宁&amp;nbsp;</td><td>3596</td><td>FACS</td></tr><tr><td>96孔细胞培养板&amp;nbsp;</td><td>康宁&amp;nbsp;</td><td>CLS3997</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Optilux 黑色透明底板&amp;nbsp;</td><td>康宁&amp;nbsp;</td><td>3603</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Flexstation 移液吸头</td><td>Molecular Devices</td><td>9000-0911</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>乙酰胆碱氯化物&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2661</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>去甲肾上腺素&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7256</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>盐酸多巴胺&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1090</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>GABA&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2129</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>组胺&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7125</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>谷氨酸&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49621</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>肾上腺素&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4642</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>生长抑素&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1763</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>5HT&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9523</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>VIP&amp;nbsp;</td><td>Alpha Diagnostics 公司&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>SP-69627</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Orexin A</td><td>Alpha Diagnostics 公司&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>12-p-01</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>P 物质&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6883</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>腺苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4036</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>褪黑素&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5250C</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>荧光酶标仪 &amp;和软件</td><td>Molecular Devices</td><td>Flexstation 3</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;含谷氨酰胺和高糖的DMEM&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td>组织培养</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;胎牛血清</td><td>Life Technologies</td><td>10082-139</td><td>组织培养</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;青霉素/链霉素&amp;nbsp; 抗生素</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>组织培养</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;嘌呤霉素&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pr-1</td><td>组织培养</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;纤连蛋白&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td>组织培养</td></tr><tr><td>CoolCell LX 无酒精程序降温细胞冻存盒</td><td>Bioexpress</td><td>D-3508</td><td>组织培养</td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯胶水&amp;nbsp;</td><td>Loctite</td><td>Loctite 495号</td><td>手术与立体定位注射</td></tr><tr><td>塑料石蜡膜&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>Parafilm&amp;reg;</td><td>手术与立体定位注射</td></tr><tr><td>纳米注射器</td><td>德拉蒙德</td><td>3-000-204</td><td>手术与立体定位注射</td></tr><tr><td>玻璃电极</td><td>德拉蒙德</td><td>3-000-203G</td><td>手术与立体定位注射</td></tr><tr><td>手持电钻</td><td>OSADA</td><td>Exl-M40</td><td>手术与立体定位注射</td></tr><tr><td>钻头磨具</td><td>精细科学</td><td>19007-05; 19007-07)</td><td>手术与立体定位注射</td></tr><tr><td>灭菌浴</td><td>FST</td><td>18000-45，热珠灭菌器</td><td>手术与立体定位注射</td></tr><tr><td>异氟烷麻醉舱/面罩</td><td>高地医疗设备</td><td>564-0427，HME 109 台式麻醉机，配备异氟烷蒸发器、氧气流量计和总阀；564-0852，诱导室 16×7×7.5 cm</td><td>手术与立体定位注射</td></tr><tr><td>带臂的3D内窥镜</td><td>蔡司</td><td></td><td>手术与立体定位注射</td></tr><tr><td>光纤光源</td><td></td><td></td><td>手术与立体定位注射</td></tr><tr><td>聚维酮碘&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>手术与立体定位注射</td></tr><tr><td>70 %（v/v）异丙醇</td><td></td><td></td><td>手术与立体定位注射</td></tr><tr><td>聚维酮碘消毒垫</td><td>dynarex</td><td>1108</td><td>手术与立体定位注射</td></tr><tr><td>0.9% 氯化钠注射液（USP，918610）</td><td></td><td></td><td>手术与立体定位注射</td></tr><tr><td>环孢素（注射剂，USP）</td><td></td><td></td><td>手术与立体定位注射</td></tr><tr><td>布托啡诺（注射剂）丁丙诺啡（0.03 &amp;mu;克/克啮齿动物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>手术与立体定位注射</td></tr><tr><td>眼用软膏&amp;nbsp;</td><td>阿克恩</td><td>NDC 17478-235-35</td><td>手术与立体定位注射</td></tr><tr><td>Surgifoam</td><td>Ethicon</td><td></td><td>手术与立体定位注射</td></tr><tr><td>握持牙科水泥</td><td>Dentsply</td><td>#675571, 675572</td><td>手术与立体定位注射</td></tr><tr><td>瞬间超级胶水&amp;nbsp;</td><td>NDindustries</td><td></td><td>手术与立体定位注射</td></tr><tr><td>LOCTITE 4041</td><td></td><td></td><td>手术与立体定位注射</td></tr><tr><td>METABOND</td><td>C&amp;amp;B</td><td></td><td>手术与立体定位注射</td></tr><tr><td>0号盖玻片</td><td>Fisher</td><td></td><td>手术与立体定位注射</td></tr><tr><td>立体定位仪&amp;nbsp;</td><td>Kopf</td><td></td><td>手术与立体定位注射</td></tr><tr><td>直肠探头和加热垫</td><td>FHC</td><td>40-90-8D，直流温度控制器，40-90-2-06，6.5×9.5 cm加热垫，40-90-5D-02，直肠热敏电阻探头</td><td>手术与立体定位注射</td></tr><tr><td>用于成像的光学平台</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>手术与立体定位注射</td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Fisher</td><td>S55667</td><td>手术与立体定位注射</td></tr><tr><td>Kwik-Cast（硅胶弹性体）</td><td>世界精密仪器公司</td><td></td><td>手术与立体定位注射</td></tr><tr><td>缝合&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>18&amp;rsquo;&amp;rsquo;, 1667, 4-0</td><td>手术与立体定位注射</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>精细科学工具</td><td>91500-09, 15018-10</td><td>手术与立体定位注射</td></tr><tr><td>Forcepts</td><td>精细科学工具</td><td>11252-30；#55，11295-51；Grafe，11050-10</td><td>手术与立体定位注射</td></tr><tr><td>学生用哈尔斯泰德-蚊式止血钳</td><td>精细科学工具</td><td>91308-12</td><td>手术与立体定位注射</td></tr><tr><td>小型血管电凝器套装</td><td>精细科学工具</td><td>18000-00</td><td>手术与立体定位注射</td></tr><tr><td>热珠灭菌器</td><td>精细科学工具</td><td>18000-45</td><td>手术与立体定位注射</td></tr><tr><td>带硅胶垫的仪器箱</td><td>精细科学工具</td><td>20311-21</td><td>手术与立体定位注射</td></tr><tr><td>带硅胶垫的塑料灭菌容器</td><td>精细科学工具</td><td>20810-01</td><td>手术与立体定位注射</td></tr><tr><td>用于2P固定阶段荧光显微镜的 &lt;em&gt;体内&lt;/em&gt; 成像</td><td>Olympus</td><td>FV1200 MPE</td><td>活体成像</td></tr><tr><td>多光子激光器</td><td>SpectraPhysics</td><td>Mai Tai DeepSee</td><td>活体成像</td></tr><tr><td>绿色激光</td><td>Olympus</td><td>473 nm 激光器</td><td>活体成像</td></tr><tr><td>xy 平移基座</td><td>Scientifica</td><td>MMBP</td><td>活体成像</td></tr><tr><td>用于YFP和CFP的FRET滤光片组</td><td>奥林巴斯</td><td></td><td>活体成像</td></tr><tr><td>10x 和 40x 水浸物镜</td><td>Olympus</td><td></td><td>活体成像</td></tr><tr><td>气浮台</td><td>纽波特</td><td></td><td>活体成像</td></tr><tr><td>定制的避光笼</td><td>Thorlab</td><td></td><td>活体成像</td></tr></tbody></table>

用于神经递质光学检测的细胞型神经递质荧光工程报告系统（cnifers）的构建 体内

Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo

基于细胞的神经递质荧光工程报告系统（CNiFERs）为神经科学家提供了一种通过光学手段检测大脑中神经递质释放的新工具 体内. 一种特定的CNiFER由稳定表达某种特异性G蛋白偶联受体（该受体与G蛋白偶联）的人胚胎肾细胞构建而成q/11 G蛋白，以及基于FRET的Ca2+-检测器，TN-XXL。受体激活会导致FRET信号增强。CNiFER细胞具有纳摩尔（nM）级别的灵敏度和秒级的时间响应，这是因为CNiFER克隆株利用了特定神经递质的天然受体， 例如，D2R 用于多巴胺。CNiFERs 可直接植入大脑，能够以低于一百 µm 的空间分辨率感知神经递质释放，因此非常适合用于测量容积传递 体内CNiFERs 还可用于筛选其他药物是否存在潜在的交叉反应性 体内我们最近扩展了CNiFER家族，以包括与G蛋白偶联的G蛋白偶联受体（GPCRs）输入/输出 G蛋白。CNiFER可用于检测乙酰胆碱（ACh）、多巴胺（DA）和去甲肾上腺素（NE）。鉴于任何G蛋白偶联受体（GPCR）均可用于构建新型CNiFER，而人类基因组中约有800种GPCR，本文将介绍设计、实现和测试各类CNiFER的一般性实验流程。

CNiFER 来源于经基因工程改造的、可稳定表达至少两种蛋白的人胚胎肾（HEK293）细胞：一种特异性的G蛋白偶联受体（GPCR）和一种基因编码的[Ca2+] 传感器 TN-XXL。TN-XXL 在响应 Ca²⁺ 时，其青色荧光蛋白 eCFP 与黄色荧光蛋白 Citrine 之间发生荧光共振能量转移（FRET）。2+ 离子6,15. 激活与内源性G蛋白偶联的GPCRq G蛋白触发胞质内[Ca2+] 通过 PLC/IP3 通路，导致TNXXL Ca的FRET信号增强2+ 检测器 (图1).
<img alt="图1" src="/files/ftp_upload/53290/53290fig1.jpg" /> 
图1：CNiFERs 的构建示意...

我们介绍一种用于创建基于细胞的神经递质荧光工程报告系统（CNiFERs）的方案，以实现对容积性神经递质释放的光学检测。

用于神经递质光学检测的细胞型神经递质荧光工程报告系统（CNiFERs）的构建 体内

基于细胞的神经递质荧光工程报告系统（CNiFERs）为神经科学家提供了一种通过光学手段检测神经递质释放的新工具

本视频的总体目标是介绍基于细胞的神经递质荧光报告系统（CNiFERs）的构建与检测方法，该系统可用于在活体中光学监测特定神经递质的释放。该方法有助于解答神经科学领域中关于脑内神经调质释放时间及其动态过程的关键问题。该技术的主要优势在于，其可针对任何通过G蛋白偶联受体（GPCS）信号通路发挥作用的神经递质或神经调质进行适配。该方法的区域性示范具有重要意义。体内注射以及随后对CNiFERs的成像在技术上具有挑战性。开始此操作前，请参见T-25培养瓶中的HEK293细胞，这些细胞含有基于前端的钙离子检测器和嵌合G蛋白。然后，将细胞在37摄氏度、含5% CO2的湿润化培养箱中培养，直至细胞汇合度达到约50%。随后，吸除T-25培养瓶中的培养基。加入2毫升慢病毒培养基混合液，将T-25培养瓶置于37摄氏度、含5% CO2的条件下继续培养。第二天，加入一毫升胰蛋白酶消化，收获感染的 HEK293 细胞。随后将细胞沉淀重悬于五毫升 HEK293 生长培养基中。取一毫升细胞接种至 T-75 培养瓶中用于冻存保存，另取 1.5 毫升细胞接种至 T-25 培养瓶中用于 FACS 分析。对于10点激动剂浓度曲线，为检测感染的细胞，将纤维连接蛋白包被的96孔板的前两行每孔加入100微升细胞悬液进行接种。随后，将培养于T-25培养瓶、T-75培养瓶和96孔板中的HEK293细胞在37°C、5%CO₂条件下孵育一至两天，直至细胞融合度达到约90%。在进行FACS分析前，通过制备包含10个不同激动剂浓度（围绕预测EC50值）的药物板，以确定GPCR的功能性表达。使用倍比稀释法配制不同浓度的激动剂，并创建模板以记录药物浓度。接下来，将酶标仪温度设置为37摄氏度。然后，对96孔荧光酶标仪进行编程，以检测FRET信号并执行溶液转移操作。使用基因编码的基于FRET的钙离子传感器TN-XXL测量FRET时，将激发波长设置为436 ± 4.5 纳米。随后，为ECFP和黄色荧光蛋白（citrine）设置发射滤光片和截止滤光片。接下来，编程酶标仪每4秒检测一次荧光发射信号，共检测180秒。从三倍化合物板中选择100微升板体积、150微升移液高度以及递送50微升药物的选项。将药物递送的时间点设置为30秒。随后，吸出A行和B行中的培养基，并向约90%融合的96孔sniffer板中加入100微升ACSF。然后，将三倍药物板和96孔进样板放入酶标仪中。在启动程序前，让酶标板在37摄氏度下平衡30分钟。酶标仪运行结束后，将荧光读数导出至文本文件中。然后，将此文件导入先前创建的电子表格模板中，该模板可将荧光强度归一化至刺激前基线，计算每种激动剂浓度下的峰值 FRET 比值，并生成剂量-反应曲线。通过将玻璃毛细管置于垂直电极拉制仪上，制备 CNiFER 注射移液管。使用一对镊子将电极尖端折断至直径约为 40 微米。将一块浸有ACSF的海绵放置在已麻醉小鼠颅骨上预先制备的2×3毫米薄颅窗上，以保持湿润，同时准备用于注射的细胞。接着，收获在T-75培养瓶中生长至约80%融合度的CNiFER克隆细胞。吸除培养基，并用无菌PBS洗涤细胞。吸除 PBS，加入 10 毫升 ACFS 以使细胞从培养瓶底部脱落。随后吹打混匀，使细胞团块分散。在细胞培养离心机中离心 2 分钟。吸除上清液，将沉淀重悬于 100 微升 ACSF 中。随后，以 1400 ×g 离心 30 秒，吸除上清液，保留覆盖有 ACSF 的沉淀。之后，用矿物油回填注射移液管。将移液管安装到纳米注射仪上。在小鼠准备区域附近的塑料石蜡膜条上放置5 µL CNiFER细胞悬液。用拉制的移液管吸取CNiFER细胞。现在，将移液管移动至目标的 x 和 y 坐标位置。降低移液管，刺穿此前已处理变薄的颅骨。继续下移至颅骨表面以下约 200 到 400 微米处，即大脑皮层的第二层和第三层。使用纳米注射器在最深位置注射 4.6 纳升 CNiFER 细胞。注意观察油相与细胞界面的移动，随后等待五分钟，使细胞充分释放。将移液管回撤约 100 微米，再次注入 4.6 纳升 CNiFER 细胞，然后等待五分钟。随后，缓慢轻柔地撤出移液管，以防止 CNiFER 细胞回流。在此步骤中，将固定头部的小鼠连同成像平台一起置于双光子成像显微镜的 10 倍水浸物镜下。插入用于FRET成像的滤光立方体，该立方体配备505纳米的二向色镜，以及用于检测ECFP的460纳米至500纳米带通滤光片和用于检测citrine的520纳米至560纳米带通滤光片。然后，向含有减薄颅窗的孔中加入ACSF，并将10倍水浸物镜浸入ACSF中。结合汞灯和GFP滤光立方体，使用目镜定位CNiFERs。现在切换到40倍水浸物镜。接着，选择适合双光子成像的光路。打开近红外飞秒脉冲激光器。选择820纳米的波长，功率设置为5%至15%。将PMT一和PMT二的电压设置为亚最大值，通常为500–1000伏特，具体取决于PMT。然后将每个通道的增益设置为1，并将物镜的Z轴位置归零。将物镜从皮层表面降低约100至200微米，然后开始XY扫描。调节每个通道的激光功率、增益和光电倍增管（PMT）电压，以优化CNiFER荧光的信噪比。接下来，使用软件将成像区域限定为包含CNiFER细胞的区域以及一个背景区域。选择Cowman线，设置平均次数为2，以获得合适的信噪比，并采用每像素4微秒、扫描速率为3至1赫兹的设置。随后，在CNiFER细胞周围绘制一个感兴趣区域（ROI），每层包含大约三到四个细胞。设置对ROI的平均荧光强度进行实时分析。然后，开始采集以随时间监测 CNiFER 荧光，并启动电刺激或行为学实验，同时监测 FRET。在此示例中，D2R CNiFER 的 FRET 反应通过带溶液递送系统的酶标仪进行测量。该图显示了多巴胺施加至 D2 CNiFER 期间的 FRET 反应。请注意，随着多巴胺浓度增加，ECFP 的发射光减弱，而锦黄色荧光蛋白（citrine）的发射光增强。此处展示的是相应的 FRET 比值图。图中显示了 D2 CNiFERs 对多巴胺和去甲肾上腺素的剂量反应曲线。此外，还展示了缺乏 D2R 的响应性对照 CNiFER。该柱状图显示了其他神经递质和调节剂在 50 纳摩尔和 1 微摩尔浓度下的 fret 比值响应。在此，对黑质中的多巴胺能神经元进行电刺激，可引起 D2 CNiFER 的 fret 比值发生显著变化。注意观察反应幅度如何随着电刺激强度的增加而增强。将刺激与可卡因注射相结合可增强CNiFER的反应。观看本视频后，您应充分了解如何构建、测试和使用CNiFER进行活体成像。在CNiFERs细胞的整个研发过程中，必须始终保持无菌操作技术，因为这些细胞最终将被植入活体小鼠体内。CNiFERs的实现为神经科学领域的研究提供了一种重要工具，可用于光学检测任何通过G蛋白偶联受体传递信号的神经递质或神经调质的释放。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。

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