构建基于细胞的神经递质荧光工程记者（CNiFERs）神经递质的光学检测在体内
2016年5月12日
我们提出了一个协议，用于容量神经递质释放的光学检测创建基于细胞的神经递质荧光工程记者（CNiFERs）。
本视频的总体目标是描述基于细胞的神经递质荧光报告基因 （CNiFER） 的构建和测试方法，该方法可用于光学监测体内特定神经递质的释放。这种方法可以帮助回答神经科学中有关大脑中神经调节剂的时间和释放的关键问题。该技术的主要优点是它可以适用于通过 GPCS 发出信号的任何类型的神经递质或神经调节剂。
这种方法的区域演示是有帮助的。这是体内注射，随后的 CNiFERs 成像在技术上具有挑战性。要开始此过程，请参阅在 T-25 培养瓶中包含基于前端的钙检测器和嵌合 g 蛋白的 HEK293 细胞。
然后，在 37 摄氏度、5% CO2 的加湿培养箱中培养细胞，直到大约 50% 汇合。然后，从 T-25 培养瓶中吸出培养基。加入 2 毫升 lenta 病毒培养基混合物，并在 37 摄氏度和 5% CO2 下孵育 T-25 培养瓶。
第二天，通过添加 1 毫升胰蛋白酶收获感染的 HEK293 细胞。接下来，将细胞沉淀重悬于 5 mL HEK293 生长培养基中。在 T-75 培养瓶中接种 1 毫升细胞用于冷冻和储存，在 T-25 培养瓶中接种 1.5 毫升细胞用于 FACS 分析。
对于 10 点激动剂曲线，为了测试感染的细胞，在纤连蛋白包被的 96 孔板的前两排接种每孔 100 微升细胞悬液。然后，在 T-25 培养瓶、T-75 培养瓶和 96 孔板中孵育生长的 HEK293 细胞，直到在 37 摄氏度和 5% CO 2 下约 90% 汇合一到两天。在 FACS 分析之前，通过制备具有 10 种不同激动剂浓度的药板来确定 GPCR 的功能表达，这些药板将预测的 EC 50 括起来。
使用连续稀释法制备不同浓度的激动剂，并创建模板，以跟踪药物浓度。接下来，将读板器温度设置为 37 摄氏度。然后，对 96 孔荧光酶标仪进行编程，用于测量品丝并执行溶液转移。
要使用基于基因编码的品丝钙传感器 TNXXL 测量品丝，请将激发波长设置为 436 正负 4.5 纳米。然后，为 ECFP 和黄水晶设置发射滤光片和截止滤光片。接下来，对读板器进行编程，使其每 4 秒测量一次排放物，总共 180 秒。
选择 100 微导板体积、150 微升移液器高度以及从三重复合板输送 50 微升药物的选项。将药物输送的时间点设置为 30 秒。之后，从 A 行和 B 行吸出培养基，并向 96 孔吸枪板中加入 100 微升 ACSF，即约 90% 汇合。
然后，将 3 倍药物板和 96 孔吸枪板加载到读板器中。在开始程序之前，让 30 分钟在 37 摄氏度下平衡板。酶标仪运行后，将荧光酶标仪值导出到文本文件。
然后，将此文件导入到先前制作的电子表格模板中，该模板将荧光强度标准化为刺激前基线，计算每种激动剂浓度的峰品丝比，并生成剂量反应曲线。通过将玻璃毛细管放在垂直电极拉拔器上来准备 CNiFER 注射移液器。使用一对镊子将电极尖端折断至约 40 微米的直径。
将浸有 ACSF 的海绵放在麻醉小鼠先前形成的 2 x 3 毫米薄颅骨窗口上，以便在准备注射细胞时保持湿润。接下来，收获在 T-75 培养瓶中生长的 CNiFER 克隆，使其汇合度约为 80%。吸出培养基，并用无菌 PBS 洗涤细胞。
去除 PBS，并使用 10 毫升 ACFS 将细胞从培养瓶底部移出。然后，对细胞进行研磨以解离细胞团块。在细胞培养离心机中离心 2 分钟。
去除上清液，将沉淀重悬于 100 微升 ACSF 中。随后，以 1400 次 G 离心 30 秒，除去上清液，留下沉淀，覆盖在 ACSF 中。然后，用矿物油回填注射移液管。
将移液器加载到 nano 注射器上。将 5 μL CNiFER 细胞悬液放在小鼠制剂附近的塑料石蜡膜条上。将 CNiFER 细胞吸入拉出的移液器中。
现在，将移液器移动到目标 x 和 y 坐标。放下移液管，刺穿先前准备好的变薄的头骨。继续到颅骨表面以下约 200 到 400 微米处，在皮层的第二层和第三层。
使用纳米注射器在最深部位注射 4.6 纳升 CNiFER 细胞。注意油和电池界面中的移动。然后，等待 5 分钟让细胞分配。
取出移液管约 100 微米，再注入 4.6 纳升 CNiFER 细胞，再次等待 5 分钟。然后，缓慢而轻柔地取出移液器，以防止 CNiFERs 回流。在此过程中，将带有头部约束鼠标的成像平台置于双光子成像显微镜中的 10 倍水浸物镜下。
插入用于 FRET 成像的滤光片立方体，该滤光片立方体具有 505 纳米的二向色镜和跨度为 460 纳米至 500 纳米的带通滤光片（用于测量 ECFP）和 520 纳米至 560 纳米（用于测量黄水晶）。然后，将 ACSF 添加到井中，其中包含减薄的颅骨窗口，并将 10 倍水浸物镜降低到 ACSF 中。将目镜与汞灯和 GFP 滤光片立方体结合使用，以定位 CNiFER。
现在，切换到 40 倍水浸物镜。接下来，为双光子成像选择合适的光路。打开近红外飞秒脉冲激光器。
选择 820 纳米的波长，功率设置为 5% 到 15%将 pmt 1 和 pmt 2 电压设置为次最大值，通常为 500-1000 伏，具体取决于 pmt。然后，将每个通道的增益设置为 1，并将物镜的 z 位置归零。将物镜从皮质表面降低约 100 至 200 微米，然后开始 xy 扫描。
调整每个通道的激光功率、增益和 pmt 电压，以优化 CNiFER 荧光的信噪比。接下来，使用软件将成像限制在包含 CNiFER 单元的区域以及背景区域。选择 cowman 线，平均 2 以获得合适的信噪比，并使用 3 比 1 赫兹的扫描速率，每个像素 4 微秒。
之后，围绕 CNiFER 单元绘制 ROI。每个平面周围大约有 3 到 4 个细胞。设置 ROI 平均强度的实时分析。
然后，开始采集以监测 CNiFER 荧光随时间的变化，并开始电刺激或行为实验，同时监测烦恼。在此示例中，D2R CNiFER 品丝的响应是在带有溶液输送系统的读板器上测量的。该图显示了将多巴胺应用于 D2 CNiFERs 期间的 fret 反应。
请注意，ECFP 发射减少，而黄水晶发射随多巴胺的增加而增加。这是相应的品格比图。此处显示的是 D2 CNiFERs 对多巴胺和去甲肾上腺素反应的剂量反应曲线。
此外，还介绍了缺乏 D2R 的响应式控制 CNiFER。该条形图显示了其他神经递质和调节剂在 50 纳摩尔和 1 微摩尔时的品格比响应。在这里，黑质中 DA 神经元的电刺激导致 D2 CNiFER 的品丝比发生很大变化。
请注意响应的幅度如何随着电刺激强度的增加而增加。与可卡因注射的耦合刺激增强了 CNiFER 反应。观看此视频后，您应该对如何创建、测试和使用 CNiFERs 进行体内成像有了很好的了解。
在 CNiFER 的整个开发过程中，保持无菌技术至关重要，因为这些细胞最终将被植入活体小鼠体内。CNiFERs 的实现为神经科学领域的研究提供了一个重要的工具，以光学测量通过 G 蛋白偶联受体发出信号的任何神经递质或神经调节剂的释放。感谢您的观看，祝您的实验好运。
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概述
本文介绍了一种构建基于细胞的神经递质荧光工程报告器（CNiFERs）的协议，以光学方式监测体内神经递质释放。该方法旨在增进对大脑内神经调节动态的理解。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 荧光成像
背景
- CNiFERs旨在检测特定的神经递质。
- 这种技术可以适应通过G蛋白偶联受体（GPCRs）信号传递的各种神经递质。
- CNiFERs的体内应用存在技术挑战。
- HEK293细胞用于构建这些报告器。
研究目的
- 开发一种实时监测神经递质释放的方法。
- 解决关于神经调节剂释放的时间和动态的关键问题。
- 为神经科学研究提供一个多功能工具。
使用的方法
- 使用HEK293细胞构建CNiFERs。
- 体内注射CNiFERs以进行监测。
- 成像技术用于可视化神经递质释放。
- 适应该方法用于不同的神经递质。
主要结果
- 成功构建了特定神经递质的CNiFERs。
- 展示了体内成像能力。
- 验证了该方法对各种神经调节剂的适应性。
- 洞察了大脑中神经递质释放的动态。
结论
- CNiFERs为研究神经递质动态提供了强大的工具。
- 该方法可以应用于神经科学的各种研究问题。
- 未来的研究可以利用这种技术获得对大脑功能更深入的见解。
常见问题
Executive Industry Relevance
CNiFERs enable real-time, in vivo detection of neurotransmitter release with high spatial and temporal resolution, supporting mechanistic de-risking in target validation for CNS drug discovery. By providing quantitative, dose-responsive readouts of GPCR activation, they improve predictive confidence in early discovery and reduce biological ambiguity in lead identification. The platform’s adaptability to any GPCR-linked neurotransmitter system offers translational continuity from target engagement to functional screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring real-time neurotransmitter dynamics in physiologically relevant contexts.
- Operational Value: Provides nM sensitivity and second-scale temporal resolution for detecting endogenous ligand release.
- Scientific Value: Supports biological de-risking through direct measurement of receptor activation in live tissue.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative FRET ratio data suitable for dose-response curve generation and EC50 determination.
- Operational Value: Enables standardized, reproducible screening of compound libraries for agonist/antagonist activity in live cells.
- Scientific Value: Facilitates cross-reactivity profiling of drug candidates against multiple neurotransmitter systems in vivo.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by detecting volume transmission in cortical layers two and three.
- Operational Value: Supports continuity from in vitro characterization to in vivo functional validation.
- Scientific Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by linking target engagement to physiological output.
Pipeline & Workflow Integration
CNiFERs integrate into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical assessment by providing functional readouts of GPCR-mediated signaling in intact neural circuits.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via real-time monitoring of neuromodulator release.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized FRET-based readouts and solution transfer protocols.
- Analytics: Enables quantitative comparison of conditions via normalized fluorescence intensity and peak FRET ratio calculations.
- Translational Research: Connects target engagement to preclinical continuity through in vivo imaging of cortical neurotransmitter dynamics.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform adaptable to any GPCR, reducing redevelopment costs across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized cell preparation, injection, and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing direct functional readouts of target modulation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on in vivo target engagement and functional response.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, viral transduction, and FACS analysis for clonal selection.
- Depends on fluorescence microscopy infrastructure, including two-photon imaging and filter sets for ECFP/citrine detection.
- Necessitates cross-team standardization between molecular biology, imaging, and pharmacology groups.
- Involves adaptation considerations for different GPCR signaling pathways (e.g., Gq/11 vs Gi/o coupling).
- Limited by surgical precision required for intracranial implantation and chronic imaging window maintenance.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:56
Lentiviral Transduction of HEK293/TN-XXL/Gqi5 Cells
2:49
Preparation for FACS and Isolation of the Single CNiFER Clones
5:17
CNiFER Implantation into Mouse Cortex
7:52
In Vivo Imaging of CNiFER Clones
10:42
Results: Examples of Flexstation Analysis, Agonist-induced FRET Response and Dose Response Curves for D2 CNiFER
12:02
Conclusion
