一种用于评估血管内皮生长因子的简易生物测定法

本简单基于细胞的生物测定方法的总体目标是检测、定量并监测血管内皮生长因子配体家族成员的活性。该方法可解答血管生物学、病毒学、癌症及眼科领域中的关键问题，其中VEG-FR家族配体在这些疾病的关键过程中发挥重要作用。该检测方法的主要优势在于，无需使用特殊的上皮细胞，即可根据VEG-FM家族配体与其不同受体结合及交联的能力对其进行评估。

将处于对数生长期的IL3分泌细胞系WEHI-3D以每管5×10⁶个细胞的密度接种于4至10个T175培养瓶中，每个培养瓶内含50毫升新鲜培养基，用移液器吹打混匀五次。培养7天，或直至细胞生长对数期过后约24至48小时。倾倒出培养瓶中的培养液及细胞。

在1,000 ×g条件下离心15分钟，以去除细胞和细胞碎片。然后弃去上清液的上层90%，并通过0.22微米滤器过滤。将条件培养基分装成每份1毫升的等分试样，用于后续检测制备。

制备培养基时使用50毫升分装量用于传代因子依赖性细胞系，使用200毫升分装量用于在20摄氏度条件下长期保存。将较小体积的培养基储存在20摄氏度。在含有10% WEHI-3B条件培养基的培养液中培养对照BAF3细胞。

在相同培养基中加入1毫克/毫升G418培养VegFR2-EPoR-BAF3细胞。将处于对数生长期的细胞按1:15比例传代。收集处于对数生长期的对照BAF3细胞或VegFR2VPoR-BAF3细胞。

轻轻吹打以使细胞从培养瓶底部脱落，于750 ×g离心5分钟以收集细胞沉淀。将沉淀重悬于10毫升小鼠等渗磷酸盐缓冲液中，再次于750 ×g离心5分钟。重复洗涤两次，以彻底去除含有IL3的培养基。

使用不含DEHI-3D条件培养基的培养液洗涤细胞一次。必须洗去含有IL3的培养基，以确保无额外生长因子残留，否则可能导致假阳性结果或背景活性升高。离心后弃去上清液，将细胞重悬于不含IL3的相同培养基中，浓度为每毫升7.4 × 10⁴个细胞。

最后，将台盼蓝的PBS溶液与细胞悬液等体积混合，取混合液加入血细胞计数板。计数至少100个细胞。能够摄取染料的细胞视为死亡或正在死亡的细胞。

用于检测的细胞必须具有较高的活力，以确保其能够对检测条件产生正常反应。使用校准良好的P20自动移液器和经高压灭菌的吸头，将1,000个细胞以13.5 µL不含白细胞介素的培养基加入72孔板的各孔中。在分装细胞悬液时应注意充分混匀，以避免细胞因重力沉降而导致浓度不均。

使用校准良好的P2移液器，在对照孔中每孔加入1.5 µL不含IL3的培养基，设三个重复。轻轻混匀。以相同方式，将10% WEHI-3D条件培养基以及含100 ng/mL VegFA但不含IL3的对照样品加入目标孔中。

最后，将1.5微升的待测样品以三复孔加入。用无菌水、PBS或培养基填充微孔板中未使用的孔。在透气容器中放入吸有水的滤纸，以形成可进行气体交换的加湿环境。

将检测板置于培养 chamber 中，在含10%二氧化碳的湿润环境中孵育16小时。孵育16小时后，使用标准倒置相差显微镜在40至100倍放大倍数下观察检测板。此时可区分阳性与阴性样本。

未添加生长因子支持或仅含培养基的孔中，圆形细胞数量会减少，并可见死亡或濒死细胞及细胞碎片。而培养在含有 IL3 或 VegFR2 配体的培养基中的细胞则体积较大、呈半透明状，细胞质中无或仅有极少颗粒样物质，且培养物中几乎无细胞碎片。将 10,000 个经洗涤的细胞加入 135 微升不含 IL3 的培养基中，接种至标准的 96 孔板的各孔中。

使用校准的P20移液器向各孔中加入15 µL的待测样本和对照样本。将细胞、生长因子和/或抑制剂的混合物按之前条件孵育48小时。孵育结束后，采用本实验方案文字部分所述方法评估各孔中活细胞的数量。

此处展示的是利用VEGF-R2 EPoR BAF3生物测定法来定量三种对VEGF-R2具有特异性的重组人血管内皮生长因子（VEGF-A165、VEGF-C和VEGF-D）活性的实验结果。在存在贝伐珠单抗（一种针对VEGF-A165的抑制性单克隆抗体）或曲妥珠单抗（一种非中和性抗体）的情况下，对活性进行了定量。

数据已相对于单独使用 VEGF-A165 的反应进行了归一化处理。正如预期，贝伐珠单抗阻断了 VEGF-A165 在该检测中的作用，但对 VEGF-C 和 VEGF-D 的活性无影响。暴露于 IL3 的细胞存活率很高。

而未暴露于任何额外生长因子的细胞则表现出较差的存活率。在进行该操作时，重要的是要牢记，条件培养基中含有多种需要在检测前预先生成的调控因子。该技术为血管生物学、病毒学、癌症和眼科领域重新兴起研究VEG-FM在连接蛋白中的作用铺平了道路。

观看本视频后，您应能够充分了解如何制备生物检测试验细胞、如何开展生物检测试验，以及如何对VEG-FM配体活性进行定量或半定量分析。