一个简单的生物测定血管内皮生长因子的评价

这种简单的基于细胞的生物测定的总体目标是检测、定量和监测木偶连接蛋白血管内皮生长因子家族成员的活性。这种方法可以回答血管生物学、病毒学、癌症和眼科学中的关键问题，其中 VEG-FR 家族木苷辐射这些疾病中的关键过程。该测定的主要优点是它允许评估 VEG-FM 家族木苷结合和交联其不同受体的能力，而无需专门的上皮细胞。

数面中的第六个细胞移液 5 次 10 次至第 6 个细胞移液到含有 50 毫米新鲜培养基的 4 至 10 个 T175 培养瓶中，培养 IL3 分泌细胞系 WEHI-3D。孵育 7 天或直到细胞在大约 24 至 48 小时内度过对数生长期。从培养瓶中倒出液体和细胞。

并以 1， 000 Gs 离心 15 分钟以去除细胞和细胞碎片。然后去除顶部 90% 的 supernaytent 并通过 0.22 微米的过滤装置过滤。将条件培养基分装成 1 毫升等分试样，用于测定制备。

50 mL等分试样用于制备培养基以传代A因子依赖性细胞系，200 mL体积用于在20°C下长期储存。将较小的体积储存在 20 摄氏度。在含有 10% WEHI-3D 条件培养基的培养基中培养对照 BAF3 细胞。

和 VegFR2-EPoR-BAF3 细胞，加 1 毫克/毫升 G418。从对数期生长的细胞中传代 1 至 15 稀释的细胞。收获对照 BAF3 或 VegFR2VPoR-BAF3 细胞，用于对数中期培养。

轻轻移液以去除培养瓶底部的细胞，以 750 G 离心 5 分钟以回收细胞沉淀。将沉淀重悬于 10 mL 小鼠磷酸盐缓冲盐水中，然后再次以 750 Gs 离心 5 分钟。再重复洗涤两次以去除含有 IL3 的培养基。

使用不含 DEHI-3D 条件培养基的培养基洗涤细胞一次。洗掉含有 IL3 的培养基以确保没有额外的生长因子残留非常重要，这可能会产生假阳性结果或高背景活性。离心并丢弃 supernayten 后，将细胞重悬于浓度为 7.4 倍 10 的相同 IL3 游离培养基中，至每毫升 10 至第四个细胞。

等体积的 PBS 台盼蓝与细胞群混合，并上样到血细胞计数器中。计数至少 100 个细胞。吸收染料的细胞被认为是死亡或垂死的。

用于检测的细胞必须具有高活力，以确保它们能够响应其检测条件。使用校准良好的 P20 自动移液管和高压灭菌吸头，将 1， 000 个细胞添加到 13.5 μL IL 缺陷培养基中，加入 72 孔板的孔中。在分装过程中注意混合细胞悬液，以确保细胞在重力下的沉降不会使细胞浓度产生偏差。

使用校准良好的 P2 移液器向对照孔中加入 1.5 微升不含 IL3 的培养基，一式三份。错综复杂的混合。以相同的方式将 10% WEHI-3D 条件培养基和 100 ng/ml VegFA no IL3 对照添加到所需的孔中。

最后，加入 1.5 微升测试样品，一式三份。用无菌水、PBS 或培养基填充微孔板的任何未使用的孔。将浸过水的薄纸放入透气容器中，以创建一个允许气体交换的加湿室。

将检测板在腔室中，在 10% 二氧化碳的潮湿环境中孵育 16 小时。孵育 16 小时后，使用标准倒相显微镜以 40 至 100 倍放大倍率分析板。此时可以区分阳性和阴性样品。

没有生长因子支持或单独使用培养基的孔将减少圆形细胞的数量以及死亡或垂死的细胞和细胞碎片。而与含有 IL3 或 VegFR2 木苷的培养基一起孵育的细胞大且半透明，并且在培养物中的细胞质或细胞碎片中没有或几乎没有颗粒状证据。将 10， 000 个洗涤的细胞加入 135 μL IL3 缺陷培养基中，加入标准 96 孔板的孔中。

使用校准的 P20 移液器向孔中加入 15 微升测试样品和对照。像以前一样，将细胞生长因子和/或抑制剂的混合物孵育 48 小时。在孵育期结束时，使用方案书面部分概述的方法评估孔中活细胞的数量。

以下是 VEGF-R2 EPoR BAF3 生物测定法用于量化三种对 VEGF-R2 具有特异性的卧位人木苷的活性的测定结果。VEGF-A165、VEGF-C 和 VEGF-D。在贝伐珠单抗（一种针对 VEGF-A165 的抑制性单克隆抗体）存在下或在曲妥珠单抗（一种非中和抗体）存在下定量活性。

与单独使用 VEGF-A165 的反应相比，数据已标准化。正如预期的那样，贝伐珠单抗在测定中阻断了 VEGF-A165 的作用，但对 VEGF-C 和 VEGF-D 的活性没有影响。暴露于 IL3 的细胞具有高度活力。

而那些没有暴露于额外生长因子的细胞活力较差。尝试此程序时，请务必记住，它们是条件培养基中的一系列控制剂，需要在检测之前生成。这项技术为血管生物学、病毒学、癌症和视同源学的复兴铺平了道路，以探索 VEG-FM 在木偶蛋白中的作用。

观看此视频后，您应该对如何制备生物测定细胞、运行生物测定以及进行 VEG-FM 木苷活性的定量或半定量分析有很好的了解。