Name: 评估人体骨骼肌微组织骨骼肌健康的功能指标 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 了解使用MyoTACTIC平台构建三维人体骨骼肌微组织的方法。该技术支持无创、可重复的收缩力和钙瞬变测量，适用于肌肉生物学、疾病建模及药物筛选研究。

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我们感谢Mohammad Afshar、Haben Abraha、Mohsen Afshar-Bakooshli和Sadegh Davoudi在MyoTACTIC培养平台的发明以及本文所述制造和分析方法的建立过程中所做出的贡献。HL获得了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）器官芯片工程与创业培训项目奖学金以及多伦多大学Wildcat研究生奖学金的资助。PMG是内源性修复领域的加拿大研究讲席教授，并获得了安大略再生医学研究所、干细胞网络以及“设计医学”项目（加拿大卓越研究计划之一）对本研究的支持。示意图使用BioRender.com制作。

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<li>Maffioletti, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+human+iPSC-derived+artificial+skeletal+muscles+model+muscular+dystrophies+and+enable+multilineage+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering.</a> Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).</li>
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<li>Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+extracellular+matrix+composition+in+structure+and+function+of+bioengineered+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle.</a> Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).</li>
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作者声明无利益冲突。

本文描述了一种可用于基础肌肉生物学研究、疾病建模或候选分子测试的三维人源肌肉微组织（hMMT）培养模型的构建与分析方法。MyoTACTIC 平台成本低廉、易于制造，且仅需相对少量的细胞即可生成骨骼肌微组织。在 MyoTACTIC 培养平台中形成的 hMMT 包含排列有序、多核且具有横纹的肌管，并能对电刺激产生响应，引发钙瞬变，进而触发收缩（图 2，图 3，图 4）。既往研究表明，hMMT 对生化刺激具有类似的响应能力，并可达到与较大规模的三维骨骼肌模型所报道相当的成熟水平12,30。
在整个 MyoTACTIC 培养板制备和 hMMT 生成过程中，一个关键要点是防止气泡产生，一旦形成则必须彻底清除。为了实现可操作的 PDMS 模具的单步浇铸，已在 Afshar 等人先前描述的 3D 打印塑...

骨骼肌是人体中最丰富的组织之一，支持运动、体温稳态和代谢等关键生理功能1。传统上，动物模型和二维（2D）细胞培养系统被用于研究生物学过程和疾病发病机制，以及测试治疗骨骼肌疾病的药理化合物2,3。尽管动物模型极大地增进了我们对健康和疾病状态下骨骼肌的理解，但其转化应用受到高成本、伦理问题以及物种间差异的限制2,4。在转向基于人类细胞的系统研究骨骼肌时，二维细胞培养因其操作简便而受到青睐。然而，这种模式存在局限性，往往无法重现体内自然发生的细胞-细胞和细胞-细胞外基质之间的相互作用5,6。近年来，三维（3D）骨骼肌模型作为一种强大的替代方案，逐渐取代整体动物模型和传统的二维培养系统，能够在体外模拟具有生理和病理相关性的过程7,8。 确实，已有大量研究报道了在生物人工三维培养体系中构建人类骨骼肌的策略1。这些研究中的一个普遍局限在于，肌肉组织的主动收缩力通常是在将其从培养平台取出并连接至力传感器后进行量化，该方法具有破坏性，因此仅能作为终点检测手段9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21。另一些研究设计了可实现非侵入性测量主动收缩力的培养系统，但并非所有系统都适用于高通量分子筛选应用7,8,9,10,14,18,22,23,24,25,26,27,28,29。
本方案详细描述了一种在骨骼肌（Myo）微组织阵列力检测平台（MyoTACTIC）中构建人源肌肉微组织（hMMTs）的方法；该平台是一种96孔板装置，可支持三维骨骼肌微组织的大规模生产30。MyoTACTIC板的制备方法能够在单次浇铸步骤中生成具有96个孔的聚二甲基硅氧烷（PDMS）培养板及其所有相应的孔结构特征，且每个孔仅需相对少量的细胞即可形成微组织。在MyoTACTIC中形成的微组织包含排列有序、具有横纹且多核的肌管，这些结构在装置的不同孔之间具有良好的可重复性；在成熟后，可原位响应化学和电刺激30。本文概述并讨论了从聚氨酯（PU）复制模制备PDMS MyoTACTIC培养板装置的技术、利用永生化人源成肌祖细胞构建hMMTs的优化方法，以及对工程化hMMTs的力学生成能力和钙处理特性的功能评估。

<table><tbody><tr><td>0.9% 氯化钠溶液，无菌</td><td>House Brand</td><td>1010</td><td>将溶液配制成 10 mL 的等分试样，于 4&amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>25G 针头</td><td>BD, Medstore, University of Toronto</td><td>2548-CABD305127</td><td></td></tr><tr><td>6-氨基己酸，&amp;ge;99%（滴定法），粉末</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A2504-100G</td><td>通过将 5 mg 6-氨基己酸粉末溶解于 100 mL 经高压灭菌的蒸馏水中，制备成 50 mg/mL 的储备液。溶液经真空过滤后，分装为 10 mL 等分试样，于 4&amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>6.35 mm 内径管路</td><td>VWR</td><td>60985-528</td><td></td></tr><tr><td>AB1167 成肌细胞系</td><td>Institut de Myologie (Paris, France)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>任意波形发生器</td><td>Rigol</td><td>DG1022Z</td><td></td></tr><tr><td>基底膜提取物（Geltrex）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14132-02</td><td>以 50 &amp;micro;L 或 100 &amp;micro;L 等分试样形式保存于 -80&amp;deg;C</td></tr><tr><td>台式真空室</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>D2672</td><td></td></tr><tr><td>BNC 转鳄鱼夹电缆</td><td></td><td></td><td>从 Amazon 购买</td></tr><tr><td>细胞培养塑料制品</td><td>Sarstedt</td><td></td><td>包括培养板、血清移液管等</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>D8418-250ML</td><td></td></tr><tr><td>不含钙、镁的 DPBS 粉末</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21600069</td><td></td></tr><tr><td>杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）（1X）</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>此为含高糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠的 DMEM</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Fisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>牛血浆来源纤维蛋白原</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>F8630-5G</td><td>将 7–10 mg 纤维蛋白原粉末分装为等分试样，于 -20&amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>Filtropur 注射器滤器，孔径 0.22 µm</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>马血清</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>人重组胰岛素</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>91077C</td><td>储备液为 100X，通过将 1 mg 人重组胰岛素溶解于 1 mL DMEM 和 1 &amp;micro;L 10N NaOH 中制备。溶液经滤过并分装为 1 mL 等分试样，于 4&amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>图像采集软件</td><td>Olympus</td><td>cellSens Dimension</td><td></td></tr><tr><td>图像处理软件</td><td>National Institutes of Health</td><td>ImageJ</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 恒温箱</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>201</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Olympus</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>显微镜-相机连接架</td><td>Labcam</td><td>Labcam for iPhone</td><td>从 Amazon 购买</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>一次性塑料注射器，1 cc</td><td>BD</td><td>2606-309659</td><td></td></tr><tr><td>一次性塑料注射器，50 cc</td><td>BD</td><td>2612-309653</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127，粉末，BioReagent</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>P2443-250G</td><td>通过将 5 g Pluronic F-127 粉末溶解于 100 mL 冷却的高压灭菌蒸馏水中，制备 5% 储备液。溶液经真空过滤后，分装为 10 mL 等分试样，于 4&amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>聚二甲基硅氧烷（Sylgard 184 硅橡胶弹性体试剂盒）</td><td>Dow</td><td>4019862</td><td>该试剂盒亦可在 Thermo Fisher Scientific、Sigma - Aldrich 等供应商处购买</td></tr><tr><td>聚氨酯阴模</td><td>本实验室自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>脱模剂</td><td>Mann Release Technologies</td><td>200</td><td></td></tr><tr><td>旋片式真空泵</td><td>Edwards</td><td>A65401906</td><td></td></tr><tr><td>手术刀</td><td>Almedic, Medstore, University of Toronto</td><td>2586-M36-0100</td><td></td></tr><tr><td>单刃剃须刀片</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>骨骼肌细胞基础培养基</td><td>Promocell</td><td>C-23260</td><td>制备 30 mL 等分试样，于 4&amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>骨骼肌细胞生长培养基（即用型）</td><td>Promocell</td><td>C-23060</td><td>制备 42 mL 等分试样，于 4&amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>智能手机（iPhone）</td><td>Apple</td><td>SE</td><td></td></tr><tr><td>标准型干式真空泵</td><td>Welch</td><td>2546B-01</td><td></td></tr><tr><td>灭菌袋</td><td>Alliance</td><td>211-SCM2</td><td></td></tr><tr><td>顶针</td><td>Igege</td><td></td><td>从 Amazon 购买</td></tr><tr><td>人血浆来源凝血酶</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>T6884-250UN</td><td>将 100 单位凝血酶溶解于 1 mL 0.1% BSA 溶液中。制备 10 &amp;micro;L 等分试样，于 -20&amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>镀锡铜线</td><td>Arco</td><td>B8871K48</td><td>从 Amazon 购买</td></tr><tr><td>台盼蓝溶液，0.4%</td><td>Thermo Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA，0.25%</td><td>Thermo FIsher Scientific</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>真空室 2</td><td>SP Bel-Art</td><td>F42027-0000</td><td></td></tr></tbody></table>

评估人类骨骼肌微组织中骨骼肌健康的各项功能指标

Assessing Functional Metrics of Skeletal Muscle Health in Human Skeletal Muscle Microtissues

骨骼肌的三维（3D）体外模型是生物医学研究中的重要进展，因其能够在可扩展的体系中研究骨骼肌的重建与功能，并便于进行实验操作。3D肌肉培养系统具有重要价值，可使科研人员在人源细胞背景下对骨骼肌进行离体研究。3D体外&#160;模型能够高度模拟成体骨骼肌组织的天然结构特征。然而，由于目前尚缺乏易于制备、成本低廉、操作简便且能批量生成较大量人源骨骼肌组织的平台，限制了该模型的广泛应用。此外，鉴于骨骼肌在多种疾病状态下其功能会随时间推移而受损，若实验平台本身能够直接进行微创的钙瞬变和收缩力测量，则更适用于微组织研究。本实验方案描述了一种名为“MyoTACTIC”的96孔平台的制备方法，以及人源三维骨骼肌微组织（hMMTs）的规模化生产流程。同时，还介绍了可在该平台上对各微组织进行重复、微创电刺激，并实现骨骼肌收缩力与钙处理能力随时间动态监测的实验方法。

本文所述方法包括：使用聚氨酯（PU）模具浇铸基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的96孔MyoTACTIC培养平台，制备人源肌肉微组织（hMMT）复制阵列，并在培养装置内分析hMMT功能的两个方面——力生成和钙处理。图1展示了hMMT接种前MyoTACTIC培养孔制备的示意图。PDMS是一种广泛使用的硅基聚合物，易于 molding 以制造复杂装置32。本研究设计了一种基于PDMS的方案，利用预制的负相PU模具30，可浇铸出任意数量的96孔培养装置。最终固化的PDMS正相板具有柔韧性，可借助单刃剃刀轻松切割为更小尺寸的功能单元（图1）。这使得用户可根据其实验设计中对hMMT复制体的具体需求，灵活调整装置规模。这些较小的功能单元还有助于克服在操作快速聚合的细胞外基质（ECM）支架（如纤维蛋白水凝胶）时的局限性，通过灵活调节孔数以匹配用户的细胞接种速度。此外，PDMS可耐受高压灭菌，且可长期保存。最后，从操作便利性角度，完整的MyoT...

本文描述了一种详细的方案，用于制备三维人源骨骼肌微组织阵列，并进行微创的下游原位功能检测，包括收缩力和钙处理分析。

三维（3D）体外骨骼肌模型是生物医学研究中的重要进展，因其为研究……提供了可行机会

本方案详细描述了构建和分析三维人骨骼肌微组织培养物的方法。肌肉微组织可用于基础肌肉生物学研究、疾病建模或候选分子的测试。该技术的主要优势在于能够原位评估收缩力和钙瞬变。因此，您可以对肌肉组织功能进行纵向研究。本次实验操作由本实验室的研究生 Brennen Musgrave 和 Heta Lad 演示。在细胞接种前两到三小时，将六孔温和战术板部分放入10厘米细胞培养皿中。通过加入 100 微升 5% Pluronic F-127 溶液，分别制备每个独立的肌牵张培养孔。用盖子覆盖各孔，并用石蜡膜密封培养皿。将培养皿置于配备板式旋转适配器的离心机中，在 1,550 ×g 条件下离心 1 分钟。将培养皿置于 4 摄氏度保存，直至细胞准备接种。然后在生物安全柜中将 150 微升基底膜提取物和 110 微升凝血酶分装液在冰上缓慢解冻。在细胞培养生物安全柜中操作，向含有 7 毫克粉末状纤维蛋白原的 1.5 毫升微量离心管中加入 700 微升 0.9% 生理盐水溶液。将试管置于37摄氏度的细胞培养箱中孵育三至五分钟，期间不进行涡旋振荡。取出后轻轻弹击试管，然后在微量离心机中瞬时离心溶解后的溶液，再将其放回超净工作台。使用配备0.22微米注射式滤器的1毫升注射器过滤纤维蛋白原溶液。然后将溶解的纤维蛋白原溶液与基底膜提取物和凝血酶分装液一同置于冰上。在37摄氏度预热组织生长培养基，待组织接种后加入培养孔中。从培养箱中取出细胞培养板，吸除培养基。然后，向每块培养板中加入 5 毫升 DPBS，洗涤细胞一次。吸除 DPBS，再向每块培养皿中加入 1 毫升 0.25% 胰蛋白酶 EDTA，使细胞脱离。将培养板放入细胞培养箱中孵育 3 分钟，随后向培养皿中加入 3 毫升洗涤培养基以终止胰蛋白酶作用，然后将细胞转移至适当大小的锥形管中。以400 × g离心10分钟使细胞沉淀。小心吸除上清液，避免破坏细胞沉淀，然后将细胞重悬于1毫升洗涤液中。在明场显微镜下使用血细胞计数板和台盼蓝染料对细胞进行计数。为接种六个组织，需准备足够用于八个组织的细胞和细胞外基质，以弥补损耗和气泡形成造成的损失。将120万个细胞转移至新的锥形管中，再用洗涤培养基将体积补至10毫米。在400 × g条件下离心10分钟，使细胞沉淀。在1.5毫升微量离心管中配制150微升ECM混合液，冰上保存备用。从含有细胞的锥形管中吸除培养基，注意避免触及细胞沉淀。用戴手套的手指用力弹击管底，直至沉淀重悬为细胞悬液。将120微升ECM溶液转移至含有细胞悬液的离心管中，轻轻吹打混匀，使细胞在ECM中完全重悬，形成单细胞悬液。避免产生气泡，然后将细胞-ECM悬液置于冰上备用。将预冷的含有肌腱微孔的10厘米培养皿放置于细胞培养罩内的冰袋上，吸除每个微孔中的泊洛沙姆F-127溶液。将残余的Pluronic F-127溶液从多孔PDMS中释放，并

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

评估人体骨骼肌微组织骨骼肌健康的功能指标

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通过酶解法分离小鼠六种后肢肌肉获取完整短、中、长骨骼肌纤维：超越趾短屈肌的研究

本文介绍了一种用于测定人或小鼠骨骼肌新鲜通透化肌纤维中线粒体氧化磷酸化水平的综合性方法。该方法能够在保持线粒体网络结构和膜完整性的前提下，实时定量检测线粒体呼吸，并评估底物偏好性与代谢灵活性。...

通过高分辨率呼吸测定法测量人和小鼠骨骼肌纤维的线粒体呼吸

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利用微型计算机断层扫描技术对小型动物骨骼肌进行无创定量分析

了解使用MyoTACTIC平台构建三维人体骨骼肌微组织的方法。该技术支持无创、可重复的收缩力和钙瞬变测量，适用于肌肉生物学、疾病建模及药物筛选研究。

评估人类骨骼肌微组织中骨骼肌健康的各项功能指标

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