Целевая абляция печени: Индуцирование смерти гепатоцитов с метронидазолом в трансгенных личинках зебры

Overview

В статье описывается целевая абляция печени, метод индуцирования смерти гепатоцитов с метронидазолом у трансгенных личинок зебры. Протокол выборки описывает процесс генерации, манипулирования и оценки целевой абляции печени у зебры.

Protocol

1. Подготовка эмбрионов/личинок

1. Перенесите 100 эмбрионов в 100-мм чашку Петри с 25 мл яичной воды. Храните не более 100 эмбрионов на чашку Петри и поднимайте их при 28 градусах Цельсия.
2. Для ингибирования пигментации до 10 часов после оплодотворения (л.с.) добавляйте фенилтирурею (ПТУ) в чашки Петри и поднимайте эмбрионы/личинки до 80 л.с. Окончательная концентрация ПТУ составляет 0,2 мМ.
   ВНИМАНИЕ: PTU является токсичным. Использование в соответствии с соответствующими руководящими принципами обработки.
3. Анестезировать личинки, добавляя 3-амино-амино-бензойной кислоты этилэстер (Tricaine), в окончательной концентрации 0,016%, в чашках Петри. Затем, используя эпифлюоресценции микроскопа, сортировать CFP-положительных личинок. Используйте личинки с аналогичным размером печени и отбросить те, с меньшим или большим печени.
   ПРИМЕЧАНИЕ: любые CFP-положительные личинки, независимо от интенсивности, могут быть использованы, потому что нет никакой разницы в степени абляции гепатоцитов между гемизиготными и гомозиготными личинками.
   ВНИМАНИЕ: tricaine является токсичным. Использование в соответствии с соответствующими руководящими принципами обработки.
4. Удалите яичную воду, содержащую Tricaine и добавить яичную воду, дополненную 0,2 мМТУ. Храните эмбрионы/личинки при 28 градусах Цельсия.

2. Лечение Mtz

1. Приготовьте свежий раствор 10 мМтц, растворив 0,171 г порошка Mtz в 100 мл яичной воды, дополненной 0,2% DMSO и 0,2 мМТУ. Чтобы полностью растворить Mtz, смешайте раствор на RT с быстрым перемешиванием в течение 20-30 минут. Чтобы помочь solubilize Mtz и для повышения Mtz пронизывания в личинки, добавить DMSO при подготовке Mtz.
   ВНИМАНИЕ: длительное воздействие или повышенная концентрация Mtz является токсичным. Использование в соответствии с соответствующими руководящими принципами обработки.
2. Разделите личинки на контрольные и экспериментальные группы, передав желаемое количество личинок в две разные 100-мм чашки Петри или многоясную пластину. Для экспериментальной группы держите личинки в растворе 10 мМтц; для контрольной группы, держать их в яичной воде, содержащей 0,2% DMSO.
3. Обложка пластин или Петри блюда, содержащие раствор Mtz с алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить фото-инактивации Mtz, и инкубировать при 28 градусов по Цельсию. Продолжительность лечения Mtz зависит от стадии личинки и трансгенной линии.

3. Анализ регенерации печени, управляемой билиарами

1. В конце периода абляции снимите раствор Mtz с пластин. Вымойте обработанные Mtz личинки, добавив 25 мл яичной воды. Закружить пластину 2-3 раза, чтобы вымыть личинки, прежде чем отказаться от яичной воды. Повторите три раза, а затем погрузить личинки еще раз в яичную воду. Чтобы избежать сердечного отека и личинок в обработанных Мтц larvae, добавить более низкую концентрацию Tricaine, при конечной концентрации 0,008%, чтобы обездвижить личинок.
2. Для анализа печени, изучить размер печени Mtz обработанных личинок под микроскопом эпифлюоресценции с фильтром CFP. Оцените уровни абляции гепатоцитов на основе относительного размера печени: большие (не абляционные; 0-10% личинок), средние (частично абляции; 10-20%) и очень маленькие (полностью абляции; 80-90%).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder	Sigma-Aldrich	A5040	Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7.
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Metronidazole	Sigma-Aldrich	M1547
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629
100 x 15 mm petri dish	Denville Scientific Inc.	M5300
egg water			0.3 g/L of sea salts ‘Instant Ocean’ and 0.5 mM CaSO4 in distilled water.
epifluorescence microscope	Leica Microsystems	M205FA