Målrettet leverablasjon: Indusere Hepatocyte Death med Metronidazol i transgene sebrafisk larver

Overview

Artikkelen beskriver målrettet leverablasjon, en metode for å indusere hepatocyttdød med metronidazol i transgene sebrafisk larver. Prøveprotokollen beskriver prosessen for å generere, manipulere og vurdere målrettet leverablasjon i sebrafisk.

Protocol

1. Fremstilling av embryoer/larver

1. Overfør 100 embryoer til en 100 mm petriskål med 25 ml eggvann. Oppbevar ikke mer enn 100 embryoer per petriskål og hev dem ved 28 °C.
2. For å hemme pigmentering, tilsett fenylthiourea (PTU) i petriskålene før 10 timer etter befruktning (hpf), og hev embryoer/larver til 80 hkf. Den endelige konsentrasjonen av PTU er 0,2 mM.
   FORSIKTIG:PTU er giftig. Brukes i henhold til passende retningslinjer for håndtering.
3. Bedøv larver ved å legge til 3-amino benzoinsyre etyl ester (Tricaine), i en endelig konsentrasjon på 0,016%, inn i petriske retter. Deretter sorterer du CFP-positive larver ved hjelp av et epifluorescence-mikroskop. Bruk larver med lignende leverstørrelse og kast de med en mindre eller større lever.
   MERK:Alle CFP-positive larver, uavhengig av intensitet, kan brukes fordi det ikke er noen forskjell i omfanget av hepatocyt ablasjon mellom de hemizygote og homozygote larver.
   FORSIKTIG: trikain er giftig. Brukes i henhold til passende retningslinjer for håndtering.
4. Fjern eggvannet som inneholder Tricaine og tilsett eggvann supplert med 0,2 mM PTU. Hold embryoene/larvene ved 28 °C.

2. Mtz Behandling

1. Forbered fersk 10 mM Mtz-oppløsning ved å oppløse 0,171 g Mtz pulver i 100 ml eggvann supplert med 0,2% DMSO og 0,2 mM PTU. For å oppløse Mtz helt, bland løsningen på RT med rask omrøring i 20-30 minutter. For å hjelpe til med å løse Mtz og for å forbedre Mtz-permeasjonen i larver, legg til DMSO når du forbereder Mtz.
   FORSIKTIG:Langvarig eksponering eller økt konsentrasjon av Mtz er giftig. Brukes i henhold til passende retningslinjer for håndtering.
2. Del larvene i kontroll og eksperimentelle grupper ved å overføre ønsket antall larver til to forskjellige 100 mm petriskål eller flerbrønnsplate. For den eksperimentelle gruppen, hold larver i 10 mM Mtz-løsning; for kontrollgruppen, hold dem i eggvann som inneholder 0,2% DMSO.
3. Dekk platene eller petriskålene som inneholder Mtz-løsningen med aluminiumsfolie for å forhindre fotoinaktivering av Mtz, og inkuber ved 28 °C. Varigheten av Mtz-behandlingen avhenger av larvestadiet og den transgene linjen.

3. Analyse av biliærdrevet leverregenerering

1. På slutten av ablasjonsperioden, fjern Mtz-løsningen fra platene. Vask de Mtz-behandlede larver ved å legge til 25 ml eggvann. Virvle platen 2-3 ganger for å vaske larver før du kaster eggvannet. Gjenta tre ganger og senk deretter larvene igjen i eggvann. For å unngå hjerteødem og larvedød i de Mtz-behandlede larver, legg til en lavere konsentrasjon av Tricaine, i en endelig konsentrasjon på 0,008%, for å immobilisere larver.
2. For leveranalyse, undersøk leverstørrelsen til de Mtz-behandlede larver under et epifluorescence mikroskop med CFP-filteret. Vurder hepatocytt ablasjonsnivåer basert på den relative leverstørrelsen: stor (ikke-ablated; 0-10% larver), middels (delvis ablated; 10-20%), og svært liten (fullt ablated; 80-90%).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder	Sigma-Aldrich	A5040	Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7.
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Metronidazole	Sigma-Aldrich	M1547
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629
100 x 15 mm petri dish	Denville Scientific Inc.	M5300
egg water			0.3 g/L of sea salts ‘Instant Ocean’ and 0.5 mM CaSO4 in distilled water.
epifluorescence microscope	Leica Microsystems	M205FA