Overview
この記事では、トランスジェニックゼブラフィッシュ幼虫のメトロニダゾールで肝細胞死を誘導する方法である標的肝アブレーションについて説明しています。サンプルプロトコルは、ゼブラフィッシュの標的肝アブレーションを生成、操作、評価するプロセスを記述しています。
Protocol
1. 胚/幼虫の準備
- 100個の胚を25mlの卵水で100mmのシャーレに移します。シャーレ1個につき100個以下の胚を保管し、28°Cで上げます。
- 色素沈着を抑制するには、フェニルチオ尿症(PTU)を受精後10時間(hpf)前のシャーレに添加し、80hpfまで胚/幼虫を上げる。PTUの最終濃度は0.2 mMです。
注意: PTU は毒性があります。適切な取り扱いガイドラインに従って使用してください。 - 3アミノ安息香酸エチルエステル(Tricaine)を最終濃度0.016%でペトリ皿に加えて幼虫を麻酔します。次いで、蛍光顕微鏡を用いて、CFP陽性の幼虫を選別する。同様の肝臓サイズの幼虫を使用し、より小さいかより大きな肝臓を持つものを捨てます。
注: CFP陽性の幼虫は、強度に関係なく、半接合性とホモ接合幼虫の間に肝細胞アブレーションの程度に差がないため、使用することができます。
注意: トリケーヌは有毒です。適切な取り扱いガイドラインに従って使用してください。 - トリケーヌを含む卵水を取り除き、0.2 mM PTUで補った卵水を加えます。胚/幼虫を28°Cに保つ。
2. Mtz治療
- 0.2%DMSOと0.2 mM PTUを加えた100 mlの卵水に0.171 gのMtzパウダーを溶解して、新鮮な10 mM Mtz溶液を調製します。Mtzを完全に溶解するには、RTで溶液を20〜30分間急速に攪拌して混合します。Mtzを可溶化し、幼虫へのMtz透過を高めるために、Mtzを準備するときにDMSOを追加します。
注意: 長期暴露またはMtz濃度の上昇は毒性があります。適切な取り扱いガイドラインに従って使用してください。 - 幼虫の所望の数を2つの異なる100mmシャーレまたはマルチウェルプレートに移すことによって、幼虫を制御および実験グループに分離します。実験グループの場合、幼虫を10 mM Mtz溶液に保ちます。コントロールグループの場合は、0.2%のDMSOを含む卵水に保管してください。
- Mtz溶液を含むプレートまたはシャーレをアルミホイルで覆い、Mtzのフォト不活性化を防ぎ、28°Cでインキュベートします。 Mtz治療の持続時間は、幼虫期およびトランスジェニックラインに依存する。
3. 胆道性肝再生の解析
- アブレーション期間の終了時に、プレートから Mtz 溶液を取り除きます。25mlの卵水を加えて、Mtz処理した幼虫を洗います。卵の水を捨てる前に、プレートを2〜3回回旋回して幼虫を洗います。3回繰り返し、幼虫を卵水にもう一度浸します。Mtz処理された幼虫の心臓浮腫および幼虫死を避けるために、トリケーヌの濃度を0.008%の最終濃度で加え、幼虫を固定化する。
- 肝臓分析のために、CFPフィルターで、蛍光顕微鏡下でMtz処理幼虫の肝臓サイズを調べます。相対的な肝臓サイズに基づいて肝細胞アブレーションレベルを評価する:大きい(非アブレート;0-10%幼虫)、中型(部分的に失化;10-20%)、および非常に小さい(完全に失食;80-90%)。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder | Sigma-Aldrich | A5040 | Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7. |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich | M1547 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 100 x 15 mm petri dish | Denville Scientific Inc. | M5300 | |
| egg water | 0.3 g/L of sea salts ‘Instant Ocean’ and 0.5 mM CaSO4 in distilled water. | ||
| epifluorescence microscope | Leica Microsystems | M205FA |
