Gezielte Leberablation: Hepatozytentod mit Metronidazol bei transgenen Zebrafischlarven induzieren

Overview

Der Artikel beschreibt die gezielte Leberablation, eine Methode zur Induktion des Hepatozytentodes mit Metronidazol bei transgenen Zebrafischlarven. Das Probenprotokoll beschreibt den Prozess zur Erzeugung, Manipulation und Bewertung der gezielten Leberablation bei Zebrafischen.

Protocol

1. Herstellung von Embryonen/Larven

1. 100 Embryonen in eine 100 mm Petrischale mit 25 ml Eiwasser geben. Halten Sie nicht mehr als 100 Embryonen pro Petrischale und heben Sie sie bei 28 °C an.
2. Um die Pigmentierung zu hemmen, phenylthiourea (PTU) vor 10 Stunden nach der Befruchtung (hpf) in die Petrischalen geben und Embryonen/Larven bis 80 hpf erhöhen. Die endletzte Konzentration von PTU beträgt 0,2 mM.
   VORSICHT: PTU ist giftig. Verwendung in Übereinstimmung mit den entsprechenden Handhabungsrichtlinien.
3. Anästhetisieren Sie die Larven, indem Sie 3-Amino-Benzoesäure-Ethylester (Tricaine) in einer Endkonzentration von 0,016% in die Petrischalen einfügt. Dann sortieren Sie mit einem Epifluoreszenzmikroskop CFP-positive Larven. Verwenden Sie Larven mit einer ähnlichen Lebergröße und entsorgen Sie solche mit einer kleineren oder größeren Leber.
   ANMERKUNG:Alle CFP-positiven Larven, unabhängig von der Intensität, können verwendet werden, da es keinen Unterschied im Ausmaß der Hepatozytenablation zwischen den hemizygoten und homozygoten Larven gibt.
   VORSICHT: Tricain ist giftig. Verwendung in Übereinstimmung mit den entsprechenden Handhabungsrichtlinien.
4. Entfernen Sie das Eiwasser, das Tricain enthält, und fügen Sie Eiwasser hinzu, das mit 0,2 mM PTU ergänzt wird. Die Embryonen/Larven bei 28 °C halten.

2. Mtz Behandlung

1. Frische 10 mM Mtz Lösung vorbereiten, indem Sie 0,171 g Mtz-Pulver in 100 ml Eiwasser auflösen, ergänzt mit 0,2% DMSO und 0,2 mM PTU. Um den Mtz vollständig aufzulösen, mischen Sie die Lösung bei RT mit schnellem Rühren für 20-30 Minuten. Um Mtz zu beruhigen und die Mtz-Permeation in die Larven zu verbessern, fügen Sie DMSO bei der Vorbereitung von Mtz hinzu.
   VORSICHT: Längere Exposition oder erhöhte Konzentration von Mtz ist toxisch. Verwendung in Übereinstimmung mit den entsprechenden Handhabungsrichtlinien.
2. Trennen Sie die Larven in Kontroll- und Versuchsgruppen, indem Sie die gewünschte Anzahl von Larven in zwei verschiedene 100 mm Petrischale oder Multi-Well-Platte übertragen. Für die Versuchsgruppe, halten Sie die Larven in 10 mM Mtz Lösung; für die Kontrollgruppe in Eiwasser mit 0,2% DMSO aufbewahren.
3. Bedecken Sie die Platten oder Petrischalen, die die Mtz-Lösung enthalten, mit Aluminiumfolie ab, um die Photoinaktivierung von Mtz zu verhindern, und brüten Sie bei 28 °C. Die Dauer der Mtz-Behandlung hängt vom Larvenstadium und der transgenen Linie ab.

3. Analyse der Biliary-getriebenen Leberregeneration

1. Am Ende der Ablationszeit die Mtz-Lösung von den Platten entfernen. Waschen Sie die mit Mtz behandelten Larven, indem Sie 25 ml Eiwasser hinzufügen. Wirbeln Sie die Platte 2-3 mal, um die Larven zu waschen, bevor Sie das Eiwasser entsorgen. Dreimal wiederholen und dann die Larven noch einmal in Eiwasser eintauchen. Um Herzödem und Larventod in den mit Mtz behandelten Larven zu vermeiden, fügen Sie eine niedrigere Konzentration von Tricain bei einer Endkonzentration von 0,008% hinzu, um die Larven zu immobilisieren.
2. Für die Leberanalyse untersuchen Sie die Lebergröße der mit Mtz behandelten Larven unter einem Epifluoreszenzmikroskop mit dem GFP-Filter. Bewerten Sie die Hepatozytenablation basierend auf der relativen Lebergröße: groß (nicht verlated; 0-10% Larven), mittel (teilweise ablated; 10-20%) und sehr klein (vollständig ablated; 80-90%).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder	Sigma-Aldrich	A5040	Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7.
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Metronidazole	Sigma-Aldrich	M1547
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629
100 x 15 mm petri dish	Denville Scientific Inc.	M5300
egg water			0.3 g/L of sea salts ‘Instant Ocean’ and 0.5 mM CaSO4 in distilled water.
epifluorescence microscope	Leica Microsystems	M205FA