Målrettet Lever Ablation: Inducerende Hepatocyte Død med Metronidazole i Transgene Zebrafish Larver

Overview

Artiklen beskriver målrettet lever ablation, en metode til at fremkalde hepatocyt død med metronidazle i transgene zebrafisk larver. Prøveprotokollen beskriver processen for generering, manipulation og vurdering af målrettet leverabblation hos zebrafisk.

Protocol

1. Tilberedning af embryoner/larver

1. Der overføres 100 embryoner til en 100 mm petriskål med 25 ml ægvand. Der må ikke opbevares mere end 100 embryoner pr. petriskål, og de må hæves ved 28 °C.
2. For at hæmme pigmentering tilsættes phenylthiourea (PTU) i petriskålene før 10 timer efter befrugtning (hpf) og hæve embryoner / larver indtil 80 hkf. Den endelige koncentration af PTU er 0,2 mM.
   ADVARSEL:PTU er giftig. Anvendes i overensstemmelse med passende håndteringsretningslinjer.
3. Bedøve larverne ved at tilføje 3-amino benzoesyre ethylester (Tricaine), ved en endelig koncentration på 0,016%, i petriskåle. Derefter, ved hjælp af en epifluorescens mikroskop, sortere CFP-positive larver. Brug larver med en lignende leverstørrelse og kassér dem med en mindre eller større lever.
   BEMÆRK: Enhver CFP-positiv larver, uanset intensitet, kan anvendes, fordi der ikke er nogen forskel i omfanget af hepatocyt ablation mellem hemizygous og homozygous larver.
   ADVARSEL: Tricaine er giftigt. Anvendes i overensstemmelse med passende håndteringsretningslinjer.
4. Fjern ægget vand, der indeholder Tricaine og tilsæt æg vand suppleret med 0,2 mM PTU. Embryonerne/larverne skal holdes ved 28 °C.

2. Mtz-behandling

1. Der fremstilles frisk 10 mM Mtz-opløsning ved at opløse 0,171 g Mtz-pulver i 100 ml ægvand suppleret med 0,2% DMSO og 0,2 mM PTU. For helt at opløse Mtz blandes opløsningen ved RT med hurtig omrøring i 20-30 minutter. For at hjælpe med at opløse Mtz og forbedre Mtz-gennemtrængning i larverne, tilsæt DMSO, når du forbereder Mtz.
   ADVARSEL: Langvarig eksponering eller øget koncentration af Mtz er giftig. Anvendes i overensstemmelse med passende håndteringsretningslinjer.
2. Adskil larverne i kontrol og eksperimentelle grupper ved at overføre det ønskede antal larver til to forskellige 100 mm petriskål eller multibrøndplade. For forsøgsgruppen skal larverne opbevares i 10 mM Mtz-opløsning; for kontrolgruppen opbevares de i ægvand, der indeholder 0,2 % DMSO.
3. Dæk pladerne eller petriskålene, der indeholder Mtz-opløsningen, med aluminiumsfolie for at forhindre fotoinaktivering af Mtz, og inkubat ved 28 °C. Varigheden af Mtz-behandlingen afhænger af larvestadiet og den transgene linje.

3. Analyse af biliary-drevet lever regenerering

1. Ved afslutningen af ablationsperioden fjernes Mtz-opløsningen fra pladerne. Vask de Mtz-behandlede larver ved at tilsætte 25 ml ægvand. Slyng pladen 2-3 gange for at vaske larverne, før du kasserer ægvandet. Gentag tre gange og derefter nedsænke larverne igen i ægvand. For at undgå hjerteødem og larvedød i de Mtz-behandlede larver tilsættes en lavere koncentration af Tricaine ved en endelig koncentration på 0,008% for at immobilisere larverne.
2. Til leveranalyse skal du undersøge leverstørrelsen af de Mtz-behandlede larver under et epifluorescensmikroskop med det fælles fiskeripolitikfilter. Vurder hepatocyt ablationsniveauer baseret på den relative leverstørrelse: stor (ikke-ablated; 0-10% larver), medium (delvist ablated; 10-20%) og meget lille (fuldt ablated; 80-90%).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder	Sigma-Aldrich	A5040	Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7.
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Metronidazole	Sigma-Aldrich	M1547
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629
100 x 15 mm petri dish	Denville Scientific Inc.	M5300
egg water			0.3 g/L of sea salts ‘Instant Ocean’ and 0.5 mM CaSO4 in distilled water.
epifluorescence microscope	Leica Microsystems	M205FA